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Un, test de comportement évolutives et économiques pour mesurer l'éthanol sédation sensibilité et la tolérance rapide dans

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DOI :

10.3791/52676

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15 avril 2015

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1Department of Human and Molecular Genetics, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

Dans cet article

Résumé

Des tests simples pour mesurer la sensibilité à l’éthanol et la tolérance rapide chez la drosophile facilitent l’utilisation de cet organisme modèle pour étudier ces comportements importants liés à l’éthanol. Ici, un test relativement simple et évolutif pour mesurer la sensibilité à l’éthanol et la tolérance rapide chez les mouches est décrit.

Résumé

trouble de consommation d'alcool (AUD) est un grave problème de santé. Malgré une forte composante héréditaire à AUD, quelques gènes ont été clairement mis en cause dans leur étiologie. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est un modèle puissant pour explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents génétique des comportements liés à l'alcool et détient donc une grande promesse pour l'identification et la compréhension de la fonction des gènes qui influencent AUD. L'utilisation du modèle de Drosophila pour ces types d'études dépend de la disponibilité de dosages qui mesurent de façon fiable les réponses comportementales de l'éthanol. Ce rapport décrit un dosage approprié pour évaluer la sensibilité de l'éthanol et de la tolérance rapide de mouches. la sensibilité à l'éthanol mesurée dans ce dosage est influencé par le volume et la concentration d'éthanol utilisé, une variété de manipulations génétiques signalés précédemment, et également la durée de vol sont logés sans nourriture immédiatement avant l'essai. En revanche, l'éthanol sensitivity mesurée dans ce dosage ne est pas affectée par la manipulation de la vigueur à la mouche, sexe du vol, et de suppléments de milieu de croissance avec des antibiotiques ou des levures vivantes. Trois méthodes différentes pour quantifier la sensibilité de l'éthanol sont décrits, tous conduisant à des résultats de sensibilité d'éthanol essentiellement indiscernables. La nature évolutive de ce test, combiné avec sa simplicité globale de set-up et relativement faible coût, le rendent approprié pour petits et grands analyse génétique à grande échelle de la sensibilité de l'éthanol et de la tolérance rapide chez la drosophile.

Introduction

trouble de consommation d'alcool (AUD) est un problème de santé dans le monde énorme (examiné en 1). Bien que les mécanismes favorisant le développement de AUD sont complexes, ces troubles ont une composante génétique importante (par exemple, 2). La grande héritabilité de l'AUD et les réponses comportementales conservés à l'éthanol dans de nombreuses espèces (3,4) examinés en ont généré un vif intérêt dans l'utilisation des organismes modèles génétiques pour enquêter sur l'implication de gènes spécifiques dans les comportements liés à l'éthanol vers une meilleure compréhension de la base moléculaire de AUD. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a émergé comme un organisme modèle leader pour explorer les mécanismes moléculaires génétique de comportements liés à l'éthanol (examinés dans 3,4). Des études ont mis en évidence chez les mouches rôles pendant plusieurs voies de signalisation dans les réponses comportementales à l'éthanol (examinés dans cinq). Curieusement, certains des gènes et les voies qui influencent responsab comportementaleses à l'éthanol dans les mouches ont également été impliqués dans les comportements liés à l'éthanol rongeurs et / ou AUD humain (par exemple, 6-14). La conservation des mécanismes de conduire les comportements liés à l'éthanol à travers les espèces, couplés avec la suite d'outils génétiques disponibles dans le système de modèle de drosophile, soulignent l'utilité du modèle de la mouche des fruits pour étudier la génétique des réponses comportementales à l'éthanol.

Sensibilité 15,16 et la tolérance (revue dans 17) à l'éthanol chez l'homme est lié au développement de AUD. Ces deux réponses comportementales à l'éthanol peut être modélisée en vol via une variété de tests de laboratoire (revue dans 3,4). Tous les tests de mouches connues des auteurs sont fondés sur des dépendant du temps induite par l'éthanol sédation / incoordination ou la récupération en fonction du temps à partir d'éthanol sédation.

Dans un précédent article de notre groupe sur la génétique de la sensibilité à l'éthanol et rla tolérance de apid chez la drosophile, un test de comportement à base d'éthanol sédation induite vapeur de mouches a été utilisé 18. Les tests dans ce dosage a été initié en transférant adulte vivant vole sans anesthésie pour vider des flacons de produits alimentaires, le piégeage des mouches dans les flacons avec un bouchon en acétate de cellulose, l'addition d'éthanol à la partie supérieure (c.-à-face non volantes) de la bougie d'acétate de cellulose, et sceller le flacon contenant les mouches, bouchon en acétate de cellulose et de l'éthanol avec un bouchon de silicone (voir schéma de la figure S3, référence 18). Plusieurs flacons représentant différents groupes de mouches ont été évalués en parallèle, augmenter le débit de cet essai. Les flacons ont été donnés un code anonyme et expérimentateurs ont été aveuglés au groupe de traitement pour prévenir biais involontaire dans l'évaluation de la sédation. Dans une expérience standard, les mouches dans des flacons ont été frappa doucement à intervalles de 6 min et, après une récupération de 30 secondes, le nombre de mouches sous sédation dans chaque flacon a été compté et converted pour cent vol actives. Les mouches absorbés vapeur d'éthanol à partir de la prise d'acétate de cellulose de façon dépendante du temps, entraînant des augmentations progressives dans l'éthanol interne 18 et la sédation (cf de référence 18 et la figure 1A et 1B dans ce rapport). Sédation dans cet essai a été opérationnel défini comme mouches (i) permanent en l'absence de la marche ou (ii) couché sur le dos avec ou sans battant des ailes. Ici, ce dosage de la sédation de l'éthanol est décrite en détail, outre l'optimisation opérationnelle pertinente à l'utilisation, il est prévu, et le test est utilisé pour traiter la contribution d'options de supplémentation alimentaire sur la sensibilité mouche de sédation.

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Protocole

1. Jour avant le test

  1. Recueillir les mouches dans des flacons de produits frais dans des groupes de 11 (même sexe) sous brève (1-5 min) CO 2.
  2. Permettre aux mouches de récupérer O / N dans des flacons de produits alimentaires dans un espace à environnement contrôlé (généralement 25 ° C, 60% d'humidité relative, 12 h cycle lumière / obscurité).
  3. Préparer la solution (s) de l'éthanol en diluant pur (100%) dans de l'éthanol purifié (≥18 MQ) de l'eau à la concentration finale (s) approprié à l'essai prévu. Laisser la solution (s) pour revenir à RT O / N.
    Remarque: La dilution de l'éthanol est exothermique.

2. jour de l'analyse

  1. Pour chaque flacon de mouches à tester, préparer (i) un endroit propre, vide alimentaire flacon; ce est à dire, les tests flacon, (ii) une nouvelle fiche d'acétate de cellulose, (iii) un bouchon en silicone et (iv) 1 ml de solution d'éthanol (voir le tableau 3).
  2. Préparer chambre d'essai en ajustant la température à 20-25 ° C et une humidité relative de 55-65%.
  3. Avoir un autre travailleurattribuer un code unique à chaque groupe de flacons et d'enregistrer le code pour plus tard. Placez flacons codés avec des mouches dans la salle de test pour se acclimater pendant quelques minutes.
  4. Étiqueter les flacons d'essai vides pour correspondre codes sur les flacons de mouches de 2,3.
  5. Construire un disque journal de test de copie en introduisant les codes dans les colonnes (une colonne / flacon) dans une feuille de calcul semblable au tableau 1.
  6. Utilisation du journal de test comme un guide, organiser des flacons alimentaires codés avec des mouches et des flacons d'essai vides en correspondant à des tableaux dans la salle d'examen.
    Remarque: Un nombre maximum raisonnable de flacons à tester est 24 (ce est à dire, six séries de quatre flacons chacun).
  7. Transfert d'oiseau de flacons d'aliments dans appariés flacons d'essai vide / étiquetés et insérer immédiatement cellulose bouchons d'acétate dans des flacons d'essai jusqu'à ce que la cellulose d'acétate bouchons sont 2 cm en dessous de la cime des flacons.
  8. Ci-après, traiter chaque rangée de quatre flacons comme un ensemble au quinconce des intervalles de 1 min.
  9. Pour l'évaluation du temps 0, saisir chaque flacon individuellement wième pouce et l'index, appuyez doucement sur la table trois fois pour frapper les mouches au fond du flacon, attendez 30 secondes puis de compter le nombre de mouches qui sont immobiles / morts. Notez le nombre de mouches immobiles / morts pour chaque flacon au temps 0 min dans le journal de test papier.
  10. Commencez minuterie compter en continu au temps 0 et commencer immédiatement ajoutant 1 ml d'éthanol à la cellulose d'acétate bouchons dans les flacons pour la première ligne / ensemble de 4 flacons. Ajouter 1 ml d'éthanol aux bougies d'acétate de cellulose dans les flacons à intervalles de 5 secondes dans l'ordre où elles seront testés. Ajouter de l'éthanol pour les bouchons d'acétate de cellulose dans un mouvement circulaire de sorte que l'éthanol est absorbé uniformément dans les bouchons d'acétate de cellulose. Lorsque l'éthanol a été ajouté à tous les quatre flacons d'essai dans le jeu, insérez un bouchon de silicone dans chaque flacon pour le sceller.
  11. Parfois, 1, 2, 3, 4 et 5 min, ajouter 1 ml d'éthanol à la seconde, troisième, quatrième, cinquième et ensembles de quatre flacons sixième, respectivement. Continuer introduction de bouchons en silicone aprèsajouter de l'éthanol à chaque jeu de quatre flacons.
  12. Au moment de 6 min, tester la première série de quatre flacons en saisissant chaque flacon avec le pouce et l'index, tapotant doucement sur la table trois fois pour frapper les mouches au fond du flacon, en attendant 30 secondes, puis en comptant et en enregistrant le nombre total de mouches qui sont sous sédation. Score vole comme sédatif se ils (i) se tiennent sur le plancher de la fiole, mais ne marchent pas ou (ii) se trouvent sur le dos avec ou sans battant des ailes.
  13. Tenez chaque flacon dans l'ensemble à intervalles de 5 secondes en utilisant le calendrier dans le tableau 2.
  14. Parfois, 7, 8, 9, 10 et 11 min, de tester les deuxième, troisième, quatrième, cinquième et sixième ensembles de fioles, respectivement, comme cela se fait pour le premier ensemble.
  15. Au moment 12 min, tester la première série de quatre flacons à nouveau comme décrit dans 2.12 et continuer à tester les deuxième, troisième, quatrième, ensembles, cinquième et sixième de flacons à 13, 14, 15, 16 et 17 minutes, respectivement.
  16. Continuer essai mouches comme décrit dans 2.12 jusqu'à ce que toutes les mouches sont sedated.
  17. Entrez le nombre total de mouches dans chaque flacon dans le disque journal de test de copie. Censurer mouches immobiles / morts au temps 0 à partir du nombre total de mouches.
  18. Calculer le pourcentage mouches actifs à chaque évaluation point dans le temps et que les données des placettes% mouches actifs (axe des ordonnées) en fonction du temps (axe des x). Quantifier éthanol sédation par interpolation sédation Durée 50 valeurs (ST50, le temps de 50% la sédation) du troisième ordre courbe polynomiale ou sigmoïde se adapte ou calculer l'aire sous la courbe.
  19. Compiler les données décodées de flacons et effectuer des analyses statistiques (par exemple, une analyse de la variance avec Bonferroni test de comparaison multiple) en fonction de la conception expérimentale.

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Résultats

Les données brutes à partir de ce dosage de l'éthanol sédation est le nombre de mouches qui sont sédation en fonction de la vapeur d'éthanol temps d'exposition. Les données brutes sont converties au pourcentage vol actif en fonction du temps (données primaires, les figures 1A, B, D - F). Sensibilité à la sédation éthanol à partir des données primaires peut être quantifiée comme sédation Temps 50 (ST50), le temps nécessaire pour 50% des mouches pour devenir sous sédation ou A...

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Discussion

Tests simples qui quantifient de manière reproductible phénotypes significatives sont d'une grande valeur pour l'analyse du comportement. Les travaux décrits ici traite de plusieurs aspects pratiques d'un test pour mesurer la sensibilité de l'éthanol de sédation et la tolérance rapide chez la drosophile. Bien que pas un objectif de ce travail, des analyses comportementales sont facilitées par le maintien de l'environnement et génétique constante de fond pour les sujets de test dans une étude...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces études ont été soutenues par des subventions des National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse à M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). Les auteurs remercient Jill Bettinger pour les discussions utiles et Jacqueline DeLoyht pour l’assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
flacons alimentairesVWR89092-772étroit
FlugsGenesee/flystuff.com49-102étroit
en siliconeFisher Scientific09-704-1l#4
éthanolPharmaco-Aaper111000200200 proof
bouchon

Références

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Essai de s dation l thanolDrosophila melanogastersensibilit l thanolm thode de test en flacontemps de s dation 50analyse g n tiquetrouble li l utilisation de l alcoolbouchons en ac tate de cellulose

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