Nous présentons ici un protocole décrivant ex situ oxygénée machine à perfusion de greffes de foie donateurs. Cet article contient une étape par étape protocole de se procurer et de préparer la greffe du foie pour la machine perfusion, préparer le liquide de perfusion, amorcer la machine à perfusion et d'effectuer oxygénée normothermique machine à perfusion de la greffe de foie.
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Article de méthode
Ex Situ Normothermique machine perfusion de foies de donneurs
Dans cet article
Résumé
Résumé
Contrairement à la conservation à froid statique conventionnelle (0-4 ° C), ex situ machine à perfusion peut fournir une meilleure préservation des foies de donneurs. Perfusion continue d'organes offre la possibilité d'améliorer la qualité des organes et permet ex situ évaluation de la viabilité des foies de donneurs avant la transplantation. Cet article vidéo fournit une étape de protocole d'étape pour ex situ de perfusion de la machine normothermique (37 ° C) de foies de donneurs humains en utilisant un dispositif qui fournit une pression et une température contrôlée irrigation sanguine pulsatoire de l'artère hépatique et la perfusion en continu de la veine porte. Le fluide de perfusion est oxygéné par deux creux oxygénateurs à membrane de fibres et la température peut être réglée entre 10 ° C et 37 ° C. Au cours de la perfusion, l'activité métabolique du foie, ainsi que le degré de lésion peut être évaluée par l'analyse biochimique des échantillons prélevés dans le liquide de perfusion. Machine de perfusion est un outil très prometteurà augmenter le nombre de foies qui sont appropriés pour la transplantation.
Introduction
La méthode actuelle de préservation d'organe dans la transplantation du foie est à débusquer avec et le stockage ultérieur des foies de donneurs dans le froid (0-4 ° C) liquide de conservation (tels que l'Université du Wisconsin solution ou une solution d'histidine-tryptophane-Ketoglutarate). Cette méthode est appelée stockage à froid statique (SCS). Bien que le taux métabolique de foies à 0-4 ° C est très faible, il existe toujours une demande pour / min / g de tissu hépatique 0,27 pmol d'oxygène, qui ne peut être assurée pendant SCS 1. La méthode classique de SCS, par conséquent, entraîne un certain degré de blessure (supplémentaire) de foies de donneurs. Bien que ce montant de blessure de conservation est pas un problème dans le foie des donateurs de bonne qualité, il peut devenir un facteur critique et la limitation dans le foie sous-optimales qui ont déjà subi un certain degré de blessure chez le donneur. Pour cette raison, les foies avec une qualité optimale ou critères dits prolongée donateurs (DPE) foies sont souvent rejetées pour la transplantation comme o des risquesf échec de la greffe précoce est considéré comme trop élevé. Les taux élevés de la fonction du greffon retardée, non-fonction primaire, et de sténoses biliaires non anastomotiques (NAS) ont été décrits chez les receveurs de foies de don après le décès circulatoire (DCD), les donateurs âgés ou les bénéficiaires de greffes stéatosiques 2. NAS sont une cause majeure de morbidité et de mortalité après transplantation hépatique. NAS peut se produire dans les deux conduits biliaires extra donateurs et intra-hépatiques et peut être accompagnée de boue biliaire intracanalaire et la formation de fonte 3,4. Bien que l'étiologie de NAS est considérée comme multifactorielle, une lésion d'ischémie / reperfusion des voies biliaires cours de la conservation du greffon et de la transplantation a été identifié comme un important mécanisme sous-jacent de 2,5. Transplantation d'un greffon DCD a été identifié comme l'un des plus importants facteurs de risque pour le développement de NAS. La combinaison d'une période d'ischémie chaude chez un donneur DCD, ischémie froide pendant la conservation d'organes, et la reperfusion ultérieureblessures chez le receveur est pensé pour être responsable de lésions irréversibles des voies biliaires, qui, en combinaison avec une capacité de régénération pauvre des voies biliaires, entraîne des cicatrices fibreuses et le rétrécissement des voies biliaires après transplantation hépatique 2,5. NAS ont été rapportés chez 30% des patients recevant un foie DCD 6-8. Il est devenu clair que la méthode actuelle de SCS des greffes de foie pour la transplantation est insuffisante pour les foies de DPE preinjured telles que celles provenant de donneurs DCD. Les méthodes alternatives sont nécessaires pour accroître et optimiser l'utilisation des foies de DPE pour la transplantation.
perfusion de la machine (MP) est une méthode de conservation d'organes qui peuvent fournir une meilleure préservation de donneurs d'organes, par rapport à SCS. MP pourrait être particulièrement pertinent pour la préservation des greffons de DPE. Un avantage important de MP est la possibilité de fournir de l'oxygène pour la greffe au cours de la période de conservation. MP peut être réalisé à différentes températures,qui ont été classés comme hypothermique (0-10 ° C), subnormothermic (10-36 ° C) et normothermique (36-37 ° C) député (NMP). En fonction de la température utilisée pour le MP, le type de liquide de perfusion doit être ajusté et avec l'augmentation de température de plus de l'oxygène doit être fourni. La première application clinique de MP dans la transplantation de foie humain a été basée sur la perfusion d'hypothermie sans oxygénation active de la 9,10 de fluide de perfusion. Dans les modèles animaux, député oxygénée hypothermique (0-10 ° C) a été montré pour avoir des effets protecteurs contre les lésions d'ischémie / reperfusion du foie greffe 11 et de fournir une meilleure préservation du plexus vasculaire péribiliaire des voies biliaires 12. Subnormothermic MP oxygénée à 20 ° C ou 30 ° C a également été étudié dans des modèles animaux et a été montré précédemment pour fournir la récupération de la fonction du greffon de foie DCD, par rapport à 13,14 SCS. La faisabilité de subnormothermic MP oxygéné des foies humains était recremment rapporté dans une série de sept foies de donneurs humains jetés 15. NMP (37 ° C) permet l'évaluation de la viabilité du greffon et la fonctionnalité avant la transplantation 16,17. En outre, MP permet de réchauffement graduel de la greffe du foie avant la transplantation, ce qui a été démontré pour faciliter la récupération et la réanimation de la greffe 18.
Le dispositif de perfusion utilisé dans le protocole actuel pour perfusion hépatique appareil permet perfusion double (par l'intermédiaire de la veine porte et l'artère hépatique) au moyen de deux pompes centrifuges, qui fournissent un flux continu de portail et un flux pulsatile artérielle. Le système est commandé par la pression, ce qui permet l'auto-régulation de l'écoulement à travers le foie, en fonction de la résistance intrahépatique. Deux creux oxygénateurs à membrane à fibres permettent l'oxygénation de la greffe du foie, ainsi que pour l'élimination de CO 2. La température peut être réglée sur la base du type d'utilisation envisagé MP (de temperat minimum ure de 10 ° C). Débit, la pression et la température sont affichées sur le dispositif en temps réel, permettant un contrôle continu du processus de perfusion. Un nouvel ensemble jetable stérile de tubes, réservoir et oxygénateurs est disponible pour la perfusion de chaque greffon (Figure 1).
Le but de cet article de la vidéo est de prévoir une étape par étape du protocole ex situ pour machine à normothermique perfusion de foies de donneurs humains en utilisant cet appareil de perfusion de foie de conception nouvelle.
Figure 1: (A) Un dessin schématique, (B) une photo de la machine de perfusion, (C) une vue rapprochée de l'oxygénateur, et (D) de la pompe centrifuge utilisée pour perfusion normothermique de foies de donneurs humains.obtenir = "_ blank"> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocole
Ce protocole a été approuvé par la commission médicale éthique (Medisch Ethische Toetsingscommissie) de l'Université Medical Center Groningen, aux Pays-Bas.
1. Préparation du liquide de perfusion
Remarque: Le volume total du fluide de perfusion préparée pour perfusion normothermique Machine selon ce protocole est 2233 ml et l'osmolarité ciblée du fluide de perfusion est 302 mOsmol / l.
- A partir des composants du fluide de perfusion décrit dans le tableau 1, maintenir les humains concentré de globules rouges, du plasma frais congelé et séparé de l'albumine humaine. Mélanger le reste des composants de façon stérile et conserver la solution dans un sac stérile pour le transport de la salle d'opération (OR). Pour ce faire, dans un environnement stérile (idéalement une installation de Bonne Pratiques de Fabrication) ou dans une hotte à flux laminaire dans une chambre de culture.
| Composants | Quantité |
| Globule rouge paniers (hématocrite 60%) | 840 ml |
| Le plasma frais congelé | 930 ml |
| L'albumine humaine 200 g / L (Albuman, Sanquin) | 100 ml |
| Nutrition parentérale modifié (Clinimix N17G35E, Baxter International Inc.) | 7,35 ml |
| Les multivitamines pour perfusion (Cernevit, Baxter International Inc.) | 7 pi |
| Oligo-éléments concentré pour perfusion (Nutritrace, B. Braun Melsungen AG) | 7,35 ml |
| Metronidazol pour l'administration iv (5 mg / ml) (Flagyl, Sanofi-Aventis) | 40 ml |
| Céfazoline 1,000 mg flacon 5 ml poudre pour l'administration iv (Servazolin, Sandoz) | 2 ml |
| L'insuline à action rapide (100 UI / ml) (Actrapid®, Novo Nordisk) | 20 ml |
| glubionate de calcium, solution intraveineuse de 10%, 137,5 mg / ml (Sandoz) | 40 ml |
| H 2 O stérile | 51,3 ml |
| Une solution de NaCl à 0,9% | 160 ml |
| Bicarbonate de sodium 8,4% de solution | 31 ml |
| Héparine 5000 IE / ml pour l'administration iv | 4 ml |
| Total | 2233 ml |
Tableau 1: Components de la perfusion de fluides 16.
- Transfert des globules rouges (840 ml) humain emballé, du plasma frais congelé (930 ml), albumine humaine 200 g / L (100 ml) et la solution préparée à l'étape 1.1 de l'OU à être administrés à l'appareil de perfusion.
2. amorçage du dispositif de perfusion
- Ajouter les composants du fluide de perfusion, y compris les humains concentré de globules rouges, du plasma frais congelé, albumine humaine et la solution préparée à l'étape 1.1 de la machine par l'intermédiaire du connecteur au-dessus des oxygénateurs et supprimer toutes les bulles d'air de la tubulure.
- Allumez la pompe veineuse et suivez les instructions du fabricant sur l'écran. Puis tourner sur la pompe artérielle et de suivre les instructions du fabricant sur l'écran.
- Null mètres de pression contre la pression atmosphérique en suivant les instructions à l'écran. Cela garantit que la pression mesurée au cours des perfusion est la pression réelle au niveau de la veine porte et l'artère hépatique.
- Démarrer le carbogène d'oxygénation en utilisant (95% O 2 + 5% CO 2) à un débit de 4 l / min. Le flux d'air sera réparti entre les deux oxygénateurs (2 L / min par oxygénateur) et cela devrait se traduire par une pO 2 de l'ordre de 60 kPa (ou 450 mmHg) dans le liquide de perfusion. Pour plus perfusions, il est conseillé d'utiliser des sources d'oxygène et de dioxyde de carbone distincts. Cela permet de petits ajustements dans le rapport O 2 / CO 2, qui peuvent être utilisés pour ajuster le pH et le pCO 2 du fluide de perfusion.
- Prélever un échantillon de perfusion pour la mesure des gaz du sang 15-20 min après que le dispositif a été amorcée et contrôler le pH et d'électrolytes en conséquence.
NOTE: Assurez-vous de jeter environ 3 ml de liquide de perfusion avant de prendre les échantillons, que ce fluide est dans le tube périphérique et ne représente pas le liquide de perfusion dans le système. Ajouter 8,4% de bicarbonate de sodium sOlution pour pouvoir tampon, visant un pH physiologique (7,35-7,45). Par exemple, ajouter 25-35 ml d'une solution de bicarbonate de sodium à 8,4% et de vérifier les niveaux de pH et de bicarbonate dans le liquide de perfusion en prélevant des échantillons pour la mesure des gaz du sang à intervalles réguliers.
3. Approvisionnement et préparation des foies de donneurs
Remarque: Procurer l'organe en utilisant la technique standard de refroidissement in situ et rincer avec un liquide de conservation par le froid (0-4 ° C) de 19. Pour faciliter la canulation de l'artère, laisser un segment de l'aorte supratruncal fixée à l'artère hépatique (figure 2A).
- Rincer les voies biliaires avec le fluide de conservation (par exemple, University of Wisconsin solution). Ligaturer le canal cystique avec un fil de suture chirurgical.
- Emballer et stocker l'organe dans un sac de donneur d'organes norme stérile et la boîte avec de la glace pilée pour transport subséquent vers le centre MP.
- Débutla procédure de table de retour dès l'arrivée du foie d'un donneur dans la salle d'opération.
- Prélever un échantillon d'au moins 10 ml de liquide de conservation pour les tests microbiologiques.
- Retirer les attaches du diaphragme à la surface nue du foie ainsi que tout muscle cardiaque restante de la manchette supérieure de la veine cave avec des ciseaux chirurgicaux.
- Disséquer l'artère et la veine porte en utilisant des ciseaux à disséquer et ligaturer les branches latérales en utilisant des sutures ou hémoclips chirurgicales.
- Fermer l'extrémité distale du segment d'aorte supratruncal en utilisant un fil de suture non absorbable monofilament (par exemple, 3-0 Prolène). Insérez la canule artérielle dans l'extrémité proximale de l'aorte supratruncal et sécuriser avec des sutures (figure 2A). Utilisez la canule fourni dans le paquet jetable, tel que fourni par le fabricant du dispositif de perfusion.
- Insérez la canule veineuse dans la veine porte et le fixer avec des sutures. Utilisez la canule fournie dans les dispospackage mesure. La veine hépatique reste uncannulated.
- Rincer la voie biliaire avec la solution de conservation. Insérer un cathéter de silicium dans le canal biliaire et le fixer avec des sutures.
NOTE: Ne pas insérer le cathéter trop profondément dans le canal biliaire, car cela pourrait causer des blessures à l'épithélium des voies biliaires. - Rincer le foie avec une solution de NaCl à 0,9% par la canule de la veine porte comme suit:
- Si la greffe a été conservé à l'Université de Wisconsin solution que la solution de conservation, débusquer le foie avec 2.000 ml de (C 0-4 °) une solution de NaCl 0,9% froid suivi par 500 ml de chaud (37 ° C) de 0,9% de NaCl solution.
- Si la greffe a été conservé dans une solution d'histidine-tryptophane-Ketoglutarate que la solution de conservation, débusquer le foie avec 1000 ml de (C 0-4 °) une solution de NaCl 0,9% froid suivi par 500 ml de chaud (37 ° C) 0,9 solution de NaCl%. Le but de la chasse d'eau tiède est d'éviter une baisse significative de la température de lafluide de perfusion.
- Effectuer immédiatement la chasse d'eau chaude avant de connecter le foie pour le dispositif de perfusion.
NOTE: Toujours garder la durée entre bouffée de chaleur et le début du NMP moins de 1-2 min.
| Caractéristiques des donateurs (n = 12) | Nombre (%) ou médian (IQR) |
| Âge (ans) | 61 (50-64) |
| Genre masculin) | 8 (67%) |
| Type de donateur DCD, Maastricht Type III DBD | 10 (83%) 2 (17%) |
| indice de masse corporelle (IMC) | 27 (25-35) |
| Motif de rejet DCD + âge> 60 ans DCD + IMC élevé DCD + diverses raisons * Stéatose sévère | 5 (41%) 3 (25%) 2 (17%) /> 2 (17%) |
| solution de préservation Solution UW Solution HTK | 6 (50%) 6 (50%) |
| Donateur temps d'ischémie chaude dans DCD (min) | 14 (17-20) |
| Temps d'ischémie froide (min) | 389 (458-585) |
| indice de risque des bailleurs de fonds (DRI) | 2,35 (2,01 à 2,54) |
Tableau 2: caractéristiques donateurs * antécédents du donneur de l'abus de drogues par voie intraveineuse pour une greffe et donateurs prolongée SO 2 <30% après le retrait du soutien de la vie pour une autre greffe.. Abréviations: DCD, don après le décès de la circulation; DBD, don après la mort cérébrale; UW, Université du Wisconsin; HTK, histidine-tryptophane-cétoglutarate
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Figure 2: (A) Photos d'une greffe de donneur humain qui a été préparé sur la table de retour et (B - D) a ensuite été perfusé normothermically. (A) La canule artérielle est inséré dans l'aorte surpratruncal et la canule veineuse est insérée dans la veine porte. Le canal biliaire est canulée avec un cathéter biliaire de silicium. (B) Le foie est positionné dans la chambre d'organe avec sa face antérieure tournée vers le bas et les canules sont reliées aux tubulures du dispositif de perfusion. (C) 30 min après le début de la perfusion normothermique la machine. (D) 6 heures après le début de la machine normothermique perfusion. Pendant le fonctionnement de la chambre d'organes est recouverte par un couvercle transparent pour maintenir un environnement stérile humide pour le foie (non représentée sur ces images)."> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
4. Normothermique machine Perfusion
- Positionner le foie dans la chambre de l'organe avec la face antérieure tournée vers le bas. Connecter immédiatement le foie au dispositif de perfusion de liaison amorcée par la canule de la veine au tube portail d'entrée du dispositif de perfusion et la canule artérielle dans le tube artériel d'entrée du dispositif.
- Lancer la perfusion des deux côtés portail et artérielle en suivant les instructions du fabricant sur l'écran. Régler la pression artérielle moyenne à 70 mmHg et la pression veineuse portale moyenne à 11 mmHg.
- Prélever des échantillons de fluide de perfusion toutes les 30 minutes pour une analyse immédiate des paramètres des gaz du sang (pO 2, pCO 2, SO 2, HCO 2 - et pH) et les paramètres biochimiques (glucose, le calcium, le lactate, de potassium et de sodium) à l'aide d'un analyseur des gaz du sang conventionnel . Soyez sûr de jeter environ 3 ml de perfusionfluide avant de prendre des échantillons, que ce fluide se trouve dans le tube périphérique et ne représente pas le liquide de perfusion dans le système.
- Pour prendre ces échantillons aspirer le liquide de perfusion en utilisant une seringue de 1 ml par les connecteurs d'échantillonnage qui font partie de l'ensemble de tubes jetables du dispositif de perfusion. Pour chaque échantillon, utiliser une nouvelle seringue et immédiatement enlever les bulles d'air de la seringue lors de l'aspiration de liquide de perfusion. Ensuite, insérez la seringue dans l'analyseur des gaz du sang et de suivre les instructions du fabricant fournies dans le manuel de l'analyseur.
- Recueillir le plasma du liquide de perfusion, congeler et conserver à -80 ° C pour la détermination de la phosphatase alcaline (AlkP), la gamma-glutamyl transférase (gamma-GT), l'alanine aminotransférase (ALT), de l'urée et de la bilirubine totale. Récupérer le plasma après 5 min de centrifugation du liquide de perfusion à 1500 x g et 4 ° C.
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Résultats
12 foies humains qui ont été refusé pour la transplantation pour des raisons diverses ont été utilisés après avoir obtenu le consentement éclairé pour la recherche de familles de donneurs. Caractéristiques des donateurs sont décrits dans le Tableau 2. Les foies de donneurs humains ont été perfusés normothermically pendant 6 heures en utilisant le protocole décrit dans le présent document. La qualité des greffes de foie ont été évalués par la surveillance de l'homogénéité macroscopique de la perfusio...
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Discussion
Cette vidéo fournit une étape par étape pour protocole de la machine normothermique perfusion de foies de donneurs humains en utilisant un dispositif qui permet contrôlée double pression de perfusion dans l'artère et la veine porte hépatique. En suivant ce protocole, les défaillances techniques de la machine de perfusion n'a pas eu lieu et tous les greffes étaient bien perfusé et bien oxygénée. Les foies perfuses ex situ ont hémodynamique étaient stables et métaboliquement actif, tel que défini par la p...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs de ce manuscrit ont pas de conflit d'intérêt à divulguer.
Remerciements
Ce travail de recherche a été soutenue financièrement par des subventions fournies par Innovatief Actieprogramma Groningen (IAG-3), Jan De Cock Kornelis Stichting et Tekke Huizingafonds, le tout dans les Pays-Bas. Nous sommes reconnaissants à tous les coordinateurs de transplantation néerlandais pour identifier les potentiels jeté foies et obtention du consentement éclairé.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Liver Assist | Organ Assist | OA. Li.Li.140 | Dispositif de perfusion |
| Liver Assist paquet jetable | Organ Assist | OA. Li.DP.540 | Set et canules jetables |
| Meredith No.8 | Vygon Nederlands B.V. | 1362082 | Canule biliaire |
| Albumine humaine 200 g/L / ALBUMAN | Sanquin | 15522598 | 100 ml |
| Nutrition parentérale modifiée | Baxter Nederland B.V. | N14G30E | 7,35 ml |
| Multivitamines pour perfusion / CERNEVIT | Baxter International Inc. | 9800927 | 7 &mu ; l |
| Oligo-éléments concentrés pour perfusion / NUTRITRACE | B. Braun Melsungen AG | 14811332 | 7,35 ml |
| Métronidazole 5 mg/ml | Baxter Nederland B.V. | 98181882 | 40 ml |
| de céfazoline / SERVAZOLIN | Sandoz B.V. | 15611337 | 2 ml |
| Insuline à action rapide | divers fournisseurs | 20 ml | |
| Glubionate de calcium, solution intraveineuse 10 %, 137,5 mg/ml | Sandoz | 97038695 | 40 ml |
| H2O | stérile Fresenius Kabi Nederland B.V. | 98084453 | 51,3 ml |
| de NaCl 0,9 % | Baxter Nederland B.V. | 15262510 | 160 ml |
| d’héparine 5 000 IE/ml pour administration intraveineuse | LEO Pharma B.V. | 98026178 | 4 ml |
| Bicarbonate de sodium 8,4 % | B. Braun Melsungen AG | 97973874 | La quantité dépend du pH |
| Globule rouge tassé (en SAGM) | Banque de sang (Sanquin N0012000 | 750 ml | |
| Plasma frais congelé | Banque de sang (Sanquin) | N04030A0/N04030B0 | 900 ml |
Références
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Réimpressions et autorisations
