Une méthode standardisée pour l'analyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage

Résumé

La cellule endothéliale sinusoïdale hépatique fenêtrée est un système de filtrage biologiquement important qui est fortement influencé par diverses maladies, toxines et états physiologiques. Ces changements ont un impact significatif sur la fonction hépatique. Nous décrivons des méthodes de standardisation de la mesure de la taille et du nombre de fenêtres dans ces cellules.

Résumé

Les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques sont la porte d’entrée du foie, leurs fenestrations transcellulaires permettent le transfert sans entrave de substances petites et dissoutes du sang dans le parenchyme hépatique pour le métabolisme et le traitement. Les fenêtres sont des structures dynamiques - leur taille et/ou leur nombre peuvent être modifiés en réponse à divers états physiologiques, médicaments et maladies, ce qui en fait une cible importante pour la modulation. Pour comprendre comment la morphologie de la LSEC est influencée par diverses maladies, états toxiques et physiologiques, et comment ces changements affectent la fonction hépatique, il faut mesurer avec précision la taille et le nombre de fenêtres. Dans cet article, nous décrivons les techniques de fixation et de traitement de la microscopie électronique à balayage utilisées dans notre laboratoire pour assurer une préparation reproductible des échantillons et une interprétation précise. Les méthodes comprennent la fixation par perfusion, la fixation secondaire et la déshydratation, la préparation au microscope électronique à balayage et l’analyse. Enfin, nous proposons une méthode étape par étape pour l’analyse d’images standardisée qui profitera à tous les chercheurs dans le domaine.

Introduction

Les cellules endotheliales sinusoïdales hépatiques (LSECs) sont très différenciées des cellules endothéliales qui tapissent la paroi de la sinusoïde hépatique. LSECs sont perforées avec des fenestrations qui sont non diaphragmée, transcellulaire des pores de 50 à 250 nm de diamètre. Jusqu'à 20% de la surface de LSECs est couverte par fenestrations, qui sont habituellement en groupes de quelques dizaines à quelques centaines appelés plateaux perforés ^{1 à 3} (figure 1). Fenestrations permettent le transfert de plasma et nanosubstrates entre le sang et les hépatocytes, la création d'un système d'ultrafiltration est performant. Fene....

Protocole

NOTE: Toutes les procédures impliquant l'utilisation d'animaux sont réalisées conformément à la législation locale. Notre travail est approuvé par le Comité de santé du district Animal Welfare Sydney locale. Les procédures autorisées sont décrites dans la documentation de licence de projet et suivent des lignes directrices qui assurent le bien-être de l'animal en tout temps. Veiller au respect de la législation sur l'expérimentation animale du pays où le travail est effectué.

1. Protocole de préparation EM Fixative

1. Pour 100 ml de fixateur, préparer paraformaldéhyde en ajoutant 2 g de poudre de paraformaldéhyde à....

Résultats

La visualisation initiale à faible grossissement par microscopie électronique à balayage révèle une surface plane de l'échantillon de foie avec une zone exposée assez grand pour observer de nombreux grands vaisseaux du foie et des sinusoïdes (figure 1A). Assurer le placement de bloc de foie correcte sur le talon de montage est essentiel pour obtenir des images claires des sinusoïdes et la capsule de Glisson du foie devraient être évités pour cette raison (figure 1B). L'augmentation du g.......

Discussion

La capacité de mesurer de façon précise et reproductible l'état du foie endothélium sinusoïdal est une étape importante dans la compréhension de la biologie de ces cellules hautement spécialisées. De nouvelles techniques telles que la microscopie d'éclairage structuré ^32, microscopie à force atomique ³³ et d-STORM (directe stochastique optique reconstrucion Microscopy) ³⁴ seront de communiquer des informations importantes concernant la morphologie de ces cellules in vitro,

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
25 % de glutaraldéhyde de qualité EM	ProSciTech	C001	Stocker le stock à -20 C jusqu’à ce que nécessaire, éviter de recongeler
Poudre de paraformaldéhyde	Sigma Aldrich	158127	Préparez toujours du paraformaldéhyde poudre fraîche de
cacodylate de sodium	Sigma Aldrich	C0250	Préparez un stock de 0,2 M, pH 7,4 en dissolvant la poudre dans dH2O, utilisé principalement à 0,1 M en préparant une dilution 1:2
Chlorure	de calcium Sigma Aldrich	C1016	Préparez 1 M de CaCl2 en dissolvant la poudre dans du dH2O
Tretroxide d’osmium	ProSciTech	C011	Laver les ampoules dans un acide faible avant utilisation pour éviter toute contamination. Préparez 2 % de stock dans une bouteille en verre
Éthanol - Absolu	Sigma Aldrich	459836  ;	L’éthanol à 100 % doit être de haute qualité et stocké avec un tamis moléculaire
Autres grades d’éthanol	Labtech	EL5	Préparez des éthanols classés avec dH2O
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	52619  ;	Laisser atteindre la température ambiante avant utilisation
Canules	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G convient à la plupart des rats, 22 G convient à la plupart des souris, mais il est bon d’en avoir quelques 24 G sous la main en cas de très petites souris
Ruban de carbone conducteur	ProSciTech	IA0201
Peinture au carbone	ProSciTech	I003
Kétamine			Doit être obtenu sous licence
Xylazine			Doit être obtenu sous licence
Tamis moléculaire	Sigma Aldrich	208647	Élimine l’eau de l’éthanol à 100 %