Les lésions d’ischémie-reperfusion (IR) sont associées à un taux élevé de morbidité et de mortalité. L’objectif du modèle in vitro de privation et de réoxygénation d’oxygène-glucose (OGD-R) décrit ici est d’évaluer les effets des lésions d’ischémie et de reperfusion sur diverses cellules, en particulier dans les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique (BHE).
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Article de méthode
Oxygène-glucose privation et réoxygénation comme un
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ischémie-reperfusion (IR) des blessures est connu pour contribuer de manière significative à la morbidité et de la mortalité associée à un accident ischémique cérébral. Accidents vasculaires cérébraux ischémiques représentent 80% de tous les accidents vasculaires cérébraux. Une cause fréquente de blessures IR est l'afflux rapide de liquides suite à une occlusion chronique / aiguë de sang, les nutriments, oxygène vers les tissus déclenchant la formation de radicaux libres.
L'AVC ischémique est suivie par barrière hémato-encéphalique (BHE) et la dysfonction vasogénique oedème cérébral. Structurellement, les jonctions serrées (TJS) entre les cellules endotheliales jouent un rôle important dans le maintien de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). IR blessure est une blessure secondaire au début conduisant à une réponse inflammatoire non spécifique. Le stress oxydatif et l'inflammation métabolique suivante déclenche des dommages au cerveau secondaire comprenant perméabilité de la BHE et la perturbation des jonctions serrées (TJ) intégrité.
Notre protocole présente in vitro </ Em> exemple de la privation d'oxygène-glucose et réoxygénation (AM-R) sur des cellules de cerveau de rat endothéliale TJ intégrité et la formation de fibres de stress. Actuellement, plusieurs expérimentale dans des modèles in vivo sont utilisés pour étudier les effets des blessures IR; mais ils ont plusieurs limitations, telles que les difficultés techniques liées à des opérations chirurgicales, les influences moléculaires dépendantes de gènes et la difficulté à étudier les relations mécanistes. Cependant, les modèles in vitro peuvent aider à surmonter bon nombre de ces limitations. Le protocole présenté peut être utilisé pour étudier les différents mécanismes moléculaires et les relations mécaniques à fournir des stratégies thérapeutiques potentielles. Cependant, les résultats des études in vitro peuvent différer de la norme des études in vivo et doivent être interprétées avec prudence.
Introduction
Ischémie-reperfusion (IR) des blessures se trouve être la cause fréquente de diverses complications et de décès débilitants associés à l'AVC, infarctus du myocarde, un traumatisme, une maladie vasculaire périphérique et une lésion cérébrale traumatique 1,2. Blessures IR dans les vaisseaux cérébraux est une blessure secondaire au début conduisant à une inflammation et un oedème 3. Une des complications graves qui se produisent à la suite de stress oxydatif et l'inflammation métabolique qui suit est la perte de l'équilibre homéostatique conduisant à la formation de radicaux libres, des altérations de la barrière hémato-encéphalique (BHE) jonctions serrées (TJ) et la perméabilité microvasculaire 4,5.
Actuellement, des modèles in vivo utilisées pour étudier les effets des blessures IR sur le BBB inclure une occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO), microembolies et transgéniques ou knock-out animaux. Cependant, chacun a ses inconvénients et limitations comme indiqué par Hossmann 6. Modèle MCAO est utilisée pour étudier l'effits de stress redox, changements dans les communications de jonction de la BHE et les interactions entre le cerveau et les cellules immunitaires. Cependant, ils présentent divers défis techniques tels que la nécessité de procédures de microchirurgie précis et les difficultés qui y sont. Microembolies rompt instantanément sur le BBB tandis que l'utilisation de transgéniques ou knock-out animaux pour étudier l'ischémie cérébrale peut avoir des défis tels que les influences génétiques moléculaires dépendant sur la formation de l'infarctus, les changements dans l'anatomie vasculaire et variabilité de poids corporel 6. Ainsi, des modèles in vitro d'ischémie ont trouvé un intérêt croissant ces derniers temps principalement en raison de leur applicabilité dans la réalisation d'études mécanistes pour les médicaments. Cependant, les résultats des études in vitro peuvent ne pas représenter pleinement une étude in vivo et doivent être interprétées avec prudence 6.
Réactives effet de faibles concentrations d'oxygène sur des monocouches de cellules endotheliales et la perméabilité microvasculaire étéétudié par Ogawa 7. Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de rat (RBMECs) ont été utilisés pour développer in vitro du Bureau. La privation et la réoxygénation oxygène-glucose (OGD-R) technique présentée dans ce protocole a été adapté à partir d'études de Zulueta et al et Zhu et al 8,9. Nous avons exposé les cellules endotheliales du cerveau à OGD-R en les plaçant dans une chambre de l'hypoxie / anoxie contenant 0% O 2, 5% CO 2 et 95% de N 2. Les cellules ont ensuite été évalués pour des altérations de l'intégrité et le stress TJ formation de fibres par immunofluorescence localisation et la rhodamine étiquetage phalloidin respectivement. Immunofluorescence pour zonula occludens-1 (ZO-1) est effectuée pour déterminer l'intégrité TJ, comme ZO-1 est une membrane d'échafaudage importante protéine liée à TJ. Étiquetage rhodamine phalloïdine détermine l'actine filamenteuse (f actine) dans le cytosquelette de la cellule et est une indication claire de l'actine la formation de fibres de stress dans les cellules endothéliales.
Le but de cette méthode est de donner un aperçu de l'élaboration OGD-R comme un modèle in vitro de IR pour étudier BBB intégrité de TJ de cellules endothéliales et la formation de fibres de stress f-actine. Les résultats fourniront des informations sur le sort de la protéine TJ, ZO-1 et la formation de fibres de stress suivant OGD-R. La compréhension de ces relations sera l'occasion de déterminer les mécanismes moléculaires sous-jacents qui sont déclenchés suivent OGD-R et développer des stratégies thérapeutiques potentielles pour améliorer la perturbation BBB après le traitement AMG-R.
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Protocole
1. L'ensemencement des cellules endothéliales
- Obtenir des cultures primaires de RBMEC de partir adultes rats Sprague-Dawley (ou de les obtenir dans le commerce).
- Cultiver RBMECs à 100 cm de la fibronectine (50 ug / ml) des boîtes de Petri revêtues en utilisant le milieu de croissance des cellules endothéliales de cerveau de rat. Changer le milieu tous les deux jours, jusqu'à confluence est atteint.
- En arrivant à 80-90% de confluence, laver délicatement les cellules dans 5 ml tampon phosphate salin (PBS) par tourbillonnement. Les cellules sont ensuite détachés en les exposant à 1 ml de trypsine acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) solution chaude de 0,25%, équilibrée à 37 ° C.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2-5 min jusqu'à ce que les cellules sont décollées et dispersés.
REMARQUE: Appuyez sur la boîte de culture pour détacher les cellules. Voir les cellules sous le microscope pour confirmer le détachement complet de cellules de la surface de la boîte. - Ajouter 5 ml médias complet à la boîte de Pétri afin de neutraliser la trypsine.Pipeter le milieu contenant les cellules détachées et les recueillir dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. .
- Centrifuger les médias contenant des cellules endothéliales à 220 g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et de préserver le culot contenant cells.Suspend le culot dans 3-5 milieu de croissance des cellules endothéliales de cerveau de rat ml fraîche en mélangeant doucement de haut en bas avec des cellules de pipettes seront alors comptés en utilisant un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre.
- Transférer la suspension cellulaire dans la fibronectine (50 ug / ml) prérevêtue 8 système chambre de coulissement puits stérile, 0,7 cm 2 / puits avec une densité de semis comprise entre 10.000-15.000 cellules par puits. Cultiver les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence est atteinte
REMARQUE: Pour effectuer des transferts Western ou d'autres expériences, les cellules peuvent être cultivées dans 10 cm des boîtes de culture cellulaire ou des plats spéciaux tel que requis par l'expérience.
2. oxygène et de glucose Privation-réoxygénation In VitroModèle
REMARQUE: Le protocole suivant a été adapté à partir de Zulueta et al. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9.
- Utilisez le système de culture cellulaire à l'hypoxie pour étudier les effets de d'autres ministères-R sur RBMECs dans (voir Figure 1). Le programme d'installation et de calibrer le système de culture cellulaire à l'hypoxie avant de commencer l'expérience, selon les instructions du fabricant.
- Retirez les diapositives de la chambre de confluence (étape 1.8) à partir de la 37 ° C incubateur. Remplacer le milieu complet dans la glissière de la chambre avec désoxygénée, aucun glucose, milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et placé dans la chambre de l'hypoxie avec 95% de N 2 et 5% de CO 2 pendant 2 h à 37 ° C, pour représenter l'état OGD.
- Déplacez les cellules de retour à l'incubateur avec 95% de O 2, 5% de CO 2 à 37 ° C et muni d'un cerveau de rat cellules endothéliales milieu complet frais et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
NOTE: Cette étape représente une situation de réoxygénation. - Les diapositives de la chambre pour immunofluorescence localisation et l'étiquetage de la rhodamine phalloïdine (voir section 3).
3. immunofluorescence localisation de ZO-1 et f étiquetage actine Utilisation rhodamine phalloïdine
- Exposer les diapositives de la chambre contenant des monocouches RBMEC 100 pi de milieu Opti-MEM / sérique réduite / puits pendant 1 heure. Laver les lames de la chambre 3 fois dans 100 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,0 à 7,2).
- Fixer les cellules en utilisant 100 pi de paraformaldehyde à 4% dans du PBS (pH 7,0 à 7,2) pendant 15 min et laver les lames creuses pour 3 fois dans du PBS (pH 7,0 à 7,2).
- Perméabiliser les cellules en utilisant 100 ul de 0,5% de Triton X-100 dans du PBS, pH (7,0 à 7,2) pendant 15 min. Bloquer avec 100 ul de 2% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS pendant une heure. Après cette étape soit des cellules tache / étiquette soit pour ZO-1 ou f- actine.
- Pour immunofluorescence staining incuber les cellules avec un anticorps primaire anti-lapin contre ZO-1 en 1: 150, établi en 2% de BSA-PBS pour O / N à 4 ° C. Laver les cellules trois fois dans du PBS (pH 7,0-7,2). Incuber avec 100 ul de la fluorescéine isothiocyanate (FITC) -tagged anticorps secondaire anti-lapin pendant 1 heure à température ambiante.
- Pour le marquage rhodamine phalloïdine, après blocage, exposer les cellules à 100 pi de la rhodamine phalloïdine en dilution 1:50, préparé dans 2% de BSA-PBS, pendant 20 min.
- Laver les cellules d'immunofluorescence et la rhodamine étiquetage phalloïdine dans du PBS (pH 7,0-7,2). Montez les chambres en utilisant les médias de montage contenant un réactif anti-fade avec DAPI.
- Visualisez les cellules en utilisant un 60 X eau lentille à immersion et les cellules sont analysés dans un plan optique unique sous un microscope confocal.
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Résultats
Les cellules cultivées sur des lames fibronectine de chambre Nunc II prérevêtus ont été soumis à d'autres ministères-R en plaçant dans un modèle 110 chambre Biospherix ProOx. Après avoir soumis les cellules à OGD-R, ils ont été traités pour ZO-1 jonctionnelle coloration en utilisant une technique d'immunofluorescence comme représenté sur la figure 2 et l'assemblage du cytosquelette indiquant la F-actine la formation de fibres de stress en utilisant la rhodamine phalloïdine étiquette aux tach...
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Discussion
OGD-R comme un modèle in vitro pour les lésions d'ischémie-reperfusion a été bien établi pour étudier les neurones 10,11. Il existe également des études montrant l'effet de l'OGD sur les cellules et les modifications endothéliales cérébrales de la perméabilité et l'intégrité TJ 9. Cependant, notre étude montre l'effet de l'OGD ainsi que réoxygénation, qui est une représentation plus proche de lésions de reperfusion ischémique dans des conditions in vivo...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous reconnaissons Scott et le Programme de subventions de recherche Hôpital Blanche pour un soutien financier et Texas A & M Health Science Center College de médecine de laboratoire intégré Imaging pour l'utilisation du microscope confocal à balayage laser. Nous reconnaissons M. Glen Cryer de l'aide pour l'édition de manuscrits.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Proox modèle 110 | Biospherix | Modèle 110 | |
| DMEM, sans glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 ; bien stérile, verre ; diapositives ; | Anticorps | ||
| marqué FITC | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Tout autre PBS disponible peut être utilisé |
Références
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
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Réimpressions et autorisations
