Oxygène-glucose privation et réoxygénation comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischémie-reperfusion modèle pour étudier la dysfonction barrière hémato-encéphalique

Résumé

Les lésions d’ischémie-reperfusion (IR) sont associées à un taux élevé de morbidité et de mortalité. L’objectif du modèle in vitro de privation et de réoxygénation d’oxygène-glucose (OGD-R) décrit ici est d’évaluer les effets des lésions d’ischémie et de reperfusion sur diverses cellules, en particulier dans les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique (BHE).

Résumé

Ischémie-reperfusion (IR) des blessures est connu pour contribuer de manière significative à la morbidité et de la mortalité associée à un accident ischémique cérébral. Accidents vasculaires cérébraux ischémiques représentent 80% de tous les accidents vasculaires cérébraux. Une cause fréquente de blessures IR est l'afflux rapide de liquides suite à une occlusion chronique / aiguë de sang, les nutriments, oxygène vers les tissus déclenchant la formation de radicaux libres.

L'AVC ischémique est suivie par barrière hémato-encéphalique (BHE) et la dysfonction vasogénique oedème cérébral. Structurellement, les jonctions serrées (TJS) entre les cellules endotheliales jouent un rôle important dans le maintien de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). IR blessure est une blessure secondaire au début conduisant à une réponse inflammatoire non spécifique. Le stress oxydatif et l'inflammation métabolique suivante déclenche des dommages au cerveau secondaire comprenant perméabilité de la BHE et la perturbation des jonctions serrées (TJ) intégrité.

Notre protocole présente in vitro </ Em> exemple de la privation d'oxygène-glucose et réoxygénation (AM-R) sur des cellules de cerveau de rat endothéliale TJ intégrité et la formation de fibres de stress. Actuellement, plusieurs expérimentale dans des modèles in vivo sont utilisés pour étudier les effets des blessures IR; mais ils ont plusieurs limitations, telles que les difficultés techniques liées à des opérations chirurgicales, les influences moléculaires dépendantes de gènes et la difficulté à étudier les relations mécanistes. Cependant, les modèles in vitro peuvent aider à surmonter bon nombre de ces limitations. Le protocole présenté peut être utilisé pour étudier les différents mécanismes moléculaires et les relations mécaniques à fournir des stratégies thérapeutiques potentielles. Cependant, les résultats des études in vitro peuvent différer de la norme des études in vivo et doivent être interprétées avec prudence.

Introduction

Ischémie-reperfusion (IR) des blessures se trouve être la cause fréquente de diverses complications et de décès débilitants associés à l'AVC, infarctus du myocarde, un traumatisme, une maladie vasculaire périphérique et une lésion cérébrale traumatique ^1,2. Blessures IR dans les vaisseaux cérébraux est une blessure secondaire au début conduisant à une inflammation et un oedème ^3. Une des complications graves qui se produisent à la suite de stress oxydatif et l'inflammation métabolique qui suit est la perte de l'équilibre homéostatique conduisant à la formation de radicaux libres, des altérations de la barrière hémato-encéphalique (BH....

Protocole

1. L'ensemencement des cellules endothéliales

1. Obtenir des cultures primaires de RBMEC de partir adultes rats Sprague-Dawley (ou de les obtenir dans le commerce).
2. Cultiver RBMECs à 100 cm de la fibronectine (50 ug / ml) des boîtes de Petri revêtues en utilisant le milieu de croissance des cellules endothéliales de cerveau de rat. Changer le milieu tous les deux jours, jusqu'à confluence est atteint.
3. En arrivant à 80-90% de confluence, laver délicatement les cellules dans 5 ml tampon phosphate salin (PBS) par tourbillonnement. Les cellules sont ensuite détachés en les exposant à 1 ml de trypsine acide éthylènediaminetétraacétique ....

Résultats

Les cellules cultivées sur des lames fibronectine de chambre Nunc II prérevêtus ont été soumis à d'autres ministères-R en plaçant dans un modèle 110 chambre Biospherix ProOx. Après avoir soumis les cellules à OGD-R, ils ont été traités pour ZO-1 jonctionnelle coloration en utilisant une technique d'immunofluorescence comme représenté sur la figure 2 et l'assemblage du cytosquelette indiquant la F-actine la formation de fibres de stress en utilisant la rhodamine phalloïdine étiquette aux tach.......

Discussion

OGD-R comme un modèle in vitro pour les lésions d'ischémie-reperfusion a été bien établi pour étudier les neurones ^10,11. Il existe également des études montrant l'effet de l'OGD sur les cellules et les modifications endothéliales cérébrales de la perméabilité et l'intégrité TJ ^9. Cependant, notre étude montre l'effet de l'OGD ainsi que réoxygénation, qui est une représentation plus proche de lésions de reperfusion ischémique dans des conditions in vivo.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Proox modèle 110	Biospherix	Modèle 110
DMEM, sans glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8  ; bien stérile, verre  ; diapositives  ;	Anticorps
marqué FITC	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Tout autre PBS disponible peut être utilisé

secondaire anti-lapin 177402