Cerveau Imaging Source dans des modèles précliniques de Rat épilepsie focale utilisant haute résolution EEG Recordings

Il a été démontré que les décharges épileptiformes interictales (DEI) observées à partir de l’EEG constituent des marqueurs utiles de l’épileptogenèse chez les patients atteints d’épileptogenèse focale³. Les régions du cerveau d’où proviennent ces EEI, appelées zones irritatives, peuvent en pratique être localisées sur la base des enregistrements EEG⁴. Les modèles précliniques sont essentiels pour trouver des corrélats entre ces zones irritatives et les régions réelles sous-jacentes à l’initiation des crises. Cependant, l’enregistrement de l’EEG de petits animaux est difficile en raison de la petite surface de la tête par rapport au cuir chevelu humain. Bien que des méthodes invasives d’enregistrement chronique chez le rat puissent être utilisées^{5, 6,} il n’existe pas de techniques à l’heure actuelle pour obtenir des enregistrements EEG traditionnels sur des rongeurs dans des conditions aiguës sans avoir besoin d’anesthésie.

Pour résoudre ce problème, nous appliquons un mini-cap^{EEG 2} breveté, qui nous permet d’enregistrer les données EEG à 32 canaux de rongeurs de manière non invasive. Dans cette étude, nous fournissons également des preuves de la nécessité d’un analgésique pour préserver la fréquence des EEI. Par conséquent, bien que la fixation d’une mini-casquette EEG ait été réalisée sous isoflurane, des enregistrements EEG ont été obtenus chez le rat uniquement sous sédation (dexdomitor)⁷. La méthode proposée dans cette étude peut être utilisée dans n’importe quel modèle préclinique d’épilepsie focale chez le rat. Pour illustrer les capacités de cette méthodologie, nous l’appliquons pour comprendre les corrélats entre les zones irritatives et les zones d’apparition des crises dans la dysplasie corticale focale (FCD). À cette fin, nous utilisons un modèle « double-hit » de FCD⁸ chez les rats Wistar.

Pour effectuer une analyse de source cérébrale, il est nécessaire de : a) extraire avec précision les DEI à partir des données brutes de l’EEG et b) obtenir un modèle de conducteur de volume pour la tête individuelle de l’animal. Pour générer un modèle pratique de conducteur de volume, nous utilisons un atlas IRM in vivo de rat, comprenant des images moyennes d’intensité/forme et obtenu par recalage non linéaire d’images T2 de 31 rats Wistar⁹. Le modèle direct du conducteur de volume généré a été calculé par la méthode des éléments de frontière (BEM)¹⁰. Comme dans le cas des humains, deux modèles typiques d’EEI (ondes aiguës et pointes) ont été détectés et sous-classés en différents groupes grâce à un processus intelligent d’extraction, de sélection et de classification^{des caractéristiques 11}. Ces signaux sous-classifiés sont utilisés pour estimer les localisations des sources cérébrales associées à différents types de zones irritatives. Nous présentons les étapes d’analyse des sources à l’aide d’un logiciel public bien connu appelé Brainstorm¹². La localisation des sources EEG pour chaque sous-type d’EEI et les délais d’apparition des crises ont été effectués à l’aide de la tomographie électromagnétique cérébrale à basse résolution standardisée (sLORETA)¹³, qui est disponible dans Brainstorm.

Déclaration éthique: Toutes les expériences sont effectuées suivant les politiques établies par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC) à l'Université internationale de Floride (IACUC 13-004).

1. EEG Recordings

1. Préparation de la mini-bouchon EEG
   1. Plonger les pointes d'électrodes de l'EEG mini-bouchon au moins 12 heures dans de l'eau distillée avec du chlorure de 0,2%. Rincer le mini-bouchon EEG doucement dans de l'eau distillée. Séchez le bouchon et les électrodes dans l'air.
   2. Mix EEG pâte d'électrode avec une solution NaCl à 0,9% de la proportion de volume de 2: 1. Ajouter une goutte de bleu de méthylène, ce qui permettra de visualiser la pâte d'électrode à l'intérieur des électrodes et sur la peau. Prendre la pâte mélangée dans une seringue. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans la seringue. Injecter le gel dans chacune des 32 électrodes, leur remplissage sans introduire de bulles d'air. Il est recommandé d'injecter du fond plutôt que le haut. Ceci assure une meilleure access à chaque électrode et réduit la possibilité de déborder le gel.
   3. Tournez sur l'EEG et système d'enregistrement physiologique, et ouvrez le logiciel d'enregistrement correspondant sur l'ordinateur en cours d'utilisation.
2. la préparation des animaux et de l'anesthésie
   NOTE: l'épilepsie chronique a été créée en utilisant un protocole pour FCD ⁸ chez les rats Wistar. L'enregistrement EEG ont été menées chez des rats Wistar adultes (âgées de 8 semaines, 300 - 400 g).
   1. Notez le poids du rat dans une feuille d'expérimentation. Utilisez ces informations pour calculer la dose sédative (DEXDOMITOR 0,25 mg / kg). Induire une anesthésie chez le rat avec 5% d'isoflurane et 100% d'oxygène (1 L / min à 14,7 psi).
   2. Après couper la tête du rat, de réduire l'isoflurane à 2% et le maintenir pendant le réglage complet de la mini-bouchon EEG. Vérifiez réflexes de rat sont absents (orteil-pincement). Placez le rat sur un coussin chauffant dans l'appareil de stéréotaxie en fixant les canaux de l'oreille à l'aide de barres d'oreilles. Assurez-vous que l'anesthésie cône de nez est sécurisé.
   3. Applis pommade ophtalmique lubrifiante à chaque oeil.
   4. Raser les cheveux supplémentaire sur la tête de rat et les oreilles à l'aide d'un rasoir. Évitez tout saignement pendant le rasage.
      REMARQUE: Tous les cheveux à gauche sur la peau va produire du bruit dans les enregistrements EEG. Frotter la peau du rat avec 90% d'alcool isopropylique pour stimuler les vaisseaux sanguins et dessécher la peau.
   5. Placez un tampon de solution saline sur le cuir chevelu et le couvrir complètement pour garder bonne conductance de la peau jusqu'à ce que le mini-bouchon EEG est prêt à être placé.
   6. Connectez température, la respiration, et de trois sondes de l'électrocardiogramme plomb. Notez que la température est mesurée par une sonde rectale. Surveiller en continu la physiologie du rat au cours de la procédure d'enregistrement. Assurez-vous que la température normale est de 37 ° C, la gamme de la respiration est 30 - 60 respirations par minute, et la fréquence cardiaque est d'environ 350 à 450 battements par minute.
3. procédures d'enregistrement
   1. Retirez le tampon de solution saline sur le cuir chevelu du rat et placer le prêt EEG mini-cap sur sa peau. Fixer le mini-bouchon avec des bandes de caoutchouc. Placer une bande de caoutchouc sur la face avant du cuir chevelu, généralement à l'avant des yeux, et une autre bande à l'arrière du cuir chevelu entre les oreilles et le cou. Utilisez un protecteur en plastique sous le cou pour faciliter la respiration normale.
   2. Mettez une couche de conductance élevée pâte d'électrode sur les deux électrodes de masse et de référence. Placez-les sur l'oreille respective.
      NOTE: L'électrode de référence peut être éventuellement placé dans d'autres endroits.
   3. Branchez le mini-bouchon EEG aux amplificateurs et d'observer un aperçu de l'atelier de l'impédance de l'électrode. Vérifiez la performance de toutes les électrodes. Pour un enregistrement de haute qualité, veiller à ce que la valeur d'impédance est de l'ordre de 5 à 30 kQ. Si des électrodes bruyants, fournir un meilleur contact avec le cuir chevelu, soit en les déplaçant à l'intérieur de l'échafaudage vers le cuir chevelu ou plus doucement injection gel à partir de la partie supérieure de l'électrode.
   4. Administrer DEXDOMITOR (0,25 mg / kg) intraperiintraperitoneale et immédiatement réduire le taux isoflurane à 0%. Si le taux de respiration est pas dans 30 - 60 respirations par ordre de la minute, commencer à augmenter doucement le taux isoflurane. Ne pas dépasser la valeur de 1% d'isoflurane. Surveiller attentivement cette étape parce que le mélange de l'isoflurane et DEXDOMITOR pourrait inciter les animaux à un état critique.
      NOTE: Sur le modèle préclinique de l'épilepsie focale, l'isoflurane affecte IED, alors que DEXDOMITOR ne fait pas. Questions à l 'isoflurane ont la propriété épileptogène plus faible, à savoir, relativement moins EEI peuvent être détecté par rapport à d'autres conditions ^7,14. La dose de DEXDOMITOR est efficace pour environ 2 heures. Ainsi, pour gagner du temps pour son effet, la préparation a été réalisée sous l'isoflurane.
   5. Mener des enregistrements EEG. Après l'enregistrement, marquer les positions des trois cercles en saillie de la mini-bouchon EEG sur le dessus de la peau en insérant un stylo de couleur à l'intérieur avant de la mini-bouchon EEG est retiré. Utilisez-les comme points de repère pour l'IRM co-enregistrement. Prenez une photo de la tête de rat avec les points de repère. Placez le rat à l'intérieur de la cage et de le surveiller jusqu'à la reprise complète de l'effet de DEXDOMITOR.
      NOTE: Dans cette expérience, la couleur rouge (couleur de l'adversaire au vert) a été utilisé pour distinguer les positions des électrodes (en vert). Cependant, il est recommandé d'utiliser d'autres couleurs (violet / vert) si petites taches hémorragiques sont observés dans la peau.

Figure 1. Une image de la mini-bouchon EEG placé sur un rat particulier.

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2. Cerveau Imaging Source

1. Classement IED
   NOTE: La détection et la classification IED sont réalisés en utilisant des codes auto-développé dans MATLAB sur la base duétude précédente ^15. Ce logiciel sera disponible sur demande.
   1. Jeter canaux bruités en inspectant visuellement les traceurs de l'EEG. Retirer artefacts ECG en utilisant une méthode de soustraction automatique de forme d'onde périodique, qui est basé sur un modèle et une analyse de corrélation.
      NOTE: Généralement, l'expérimentateur qui a enregistré l'EEG partage la feuille expérimentale écrite pour l'information du canal mauvaise observé sur la base des valeurs d'impédance. Logiciel pour supprimer les artefacts ECG sera également disponible sur demande.
      
      Figure 2. Un exemple de la trace EEG montrant différents types d'EEI. La boîte rouge indique un type d'engins explosifs improvisés.
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   2. Application d'un filtre passe-bande avec des fréquences de coupure de 3 à 150 Hz et une encochefiltrer pour enlever la fréquence de ligne (60 Hz en général et 50 Hz dans certains pays) de déconnecté composant.
   3. Détecter deux types d'EEI (pointes et tranchants-ondes). Pointes et francs-ondes constituent les grands événements électriques de 20 à 70 ms et de 70 à 200 ms en durée respectivement. Par conséquent, après application d'un filtre passe-bande respectif (fréquences de coupure de 15 à 50 Hz pour les pointes et de 5 à 15 Hz pour les francs-ondes), les IED sont détectées sur la base de seuils d'amplitude ^15.
      REMARQUE: Les seuils sont automatiquement mis à 4σ comme suggéré dans l'étude précédente de l'activité multiunit ^15. Ici, σ est un écart-type estimée du signal passe-bande filtrée, σ = {médian | signal filtré | / 0.6745}.
   4. Sous-classer les pointes et tranchants-ondes dans différentes grappes. Les caractéristiques distinctives de différentes pointes et tranchants-ondes sont extraites en utilisant la transformée en ondelettes ^15. Ils sont sous-classés en plusieurs clusters utilisant k-means,et le nombre optimal de cluster k est déterminée en utilisant silhouette.
   5. La moyenne des signaux de sous-classées dans le même cluster. Les signaux EEG moyenne pour chaque sous-type IED seront utilisés pour l'analyse de la source de cerveau.
2. modèle de conducteur de Volume
   NOTE: Pour les sections suivantes, le logiciel open source, Brainstorm ^12, sera utilisé avec l'atlas IRM pour rats Wistar ^9. Cependant, l'IRM de rat individuel peut également être utilisé pour générer le modèle de conducteur de volume si elle est disponible. L'atlas IRM ⁹ peut être téléchargé à http://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/ . Ce site fournit l'atlas que le format nifti section «rat Wistar IRM Atlas" en vertu, et il peut être accessible après inscription. Le logiciel nécessaire pour le pré-traitement peut également être trouvée dans ce site.
   1. IRM d'entrée et la surface du cerveau pour le logiciel ^12.
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   2. Générer surface de la tête avec le réglage par défaut.
      
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   3. Générer le cuir chevelu et les surfaces de crâne internes / externes sur la base de l'IRM pour le champ de calcul plomb ^12.
      NOTE: La résolution des sommets influence la précision de la source estimée, mais grand nombre de sommets résultats dans la complexité de calcul haute. Nombre recommandé de sommets de chaque couche est 642 pour une précision acceptable avec la complexité de calcul équitable. L'épaisseur du crâne peut être vérifiée à partir de l'IRM, et dans le cas de l'atlas IRM, il est d'environ 1 mm. Après l'insertion de valeurs ci-dessus dans le logiciel, triangle face-sommet correspondant mailles pour chaque surface sera créé.
      
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   4. Vérifiez l'orientation et l'emplacement de chaque surface par rapport à l'IRM en utilisant l'option de visualisation. Modifier en conséquence, si les surfaces ne sont pas co-enregistrées ^12.
      
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   5. En utilisant l'image de la tête de rat acquise en 1.3.5. co-enregistrer les positions des trois points de repère (R1, R2, R3) et à l'IAM. Utilisez les points de monuments de la grille comme des références à generate les positions d'électrodes que les électrodes sont fixées sur l'échafaudage (figure 3B).
      
      Figure 3. (A) Rat image de la tête utilisé pour obtenir des positions d'électrodes et (b) l'EEG mini-bouchon schéma avec le système de coordonnées. Les points rouges dans (A) indiquent les points de repère mentionnés dans 1.3.5. qui correspondent aux numéros rouges dans (B). En outre, les notes vertes dans (A) représentent les positions des électrodes 32, et elles correspondent aux numéros en bleu (B).
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   6. Générer N × 3 électrode matrice de position basée sur les 3 points de repère. Ici, N est le nombre de canaux (N = 32) et la colonne représente le x, y, z et les valeurs de coordonnées correspondant.
      NOTE: Le mini-bouchon EEG est un échafaudage rigide. Par conséquent, une fois que les grilles de référence 3 (R1, R2, et R3) sont obtenues, la position des électrodes est automatiquement réglée. L'utilisateur aura seulement besoin de redéfinir les valeurs Z sur une voie que le mini-bouchon est projeté de manière appropriée sur le cuir chevelu. Le point N grilles peuvent être numérotés comme le montre la figure 3B chiffres bleus. L'échafaudage standard pour le mini-bouchon EEG est disponible dans le commerce (Table des Matières). Le logiciel pour co-inscription est également disponible à la communauté.
   7. Entrez le fichier de canal généré.
      
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   8. Afficher et confirmer l'emplacement de toutes les électrodes. Modifiez les électrodes ¹² égarés. Le système de coordonnées finale pour l'électrode positions doivent coïncider avec le système de coordonnées utilisé pour les surfaces mentionnées ci-dessus.
      REMARQUE: Les surfaces créées peuvent être inspectés visuellement sur une IRM en utilisant l'option de visualisation, Et puis, une surface choisie seront affichés comme ligne jaune à l'IRM "enregistrement IRM Vérifiez IRM / Enregistrement de surface.". En outre, les 3 points de repère et les positions des électrodes 32 peuvent être affichées sur l'IRM en sélectionnant l'option de la boîte à outils, "Afficher Capteurs IRM Viewer." Les emplacements peuvent être inspectés visuellement en comparant les distributions basées sur les yeux et les oreilles des endroits du rat ( Figure 4).
      
      Figure 4. atlas (A) IRM avec surface de co-enregistrées cerveau (ligne jaune), (B) le modèle de conducteur de volume créé avec les alignés 32 électrodes et 3 points de repère (points rouges), et de l'atlas (C) IRM avec co-enregistrées ref érence grille R1.
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3. Brain Imaging Source
   1. Calculer plomb matrice de champ ^13. Entrez les valeurs de conductivité qui satisfont le rapport de la peau, du crâne et du cerveau comme 1: 1/80: 1. obtenir la matrice de champ à base de plomb sur le modèle de volume conducteur et les positions d'électrodes créés dans 2.2.
      REMARQUE: La boîte à outils propose ¹² l'interface avec les autres logiciels pour calculer BEM ^10. Par conséquent, seules les valeurs de conductivité sont nécessaires comme entrée.
      
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   2. Saisissez les signaux EEG moyenne pour chaque sous-type IED stockée dans 2.1.4.
      "Src =" / files / ftp_upload / 52700 / 52700vis7.jpg "/>
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   3. Obtenir solution sLORETA ¹³ sur la base de la matrice de champ de plomb calculée et entrée les signaux EEG. En sélectionnant l'option de procédé d'estimation de la source, la solution inverse peut être obtenue ^12.
      
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   4. Tracer les sources estimées.

Une fois que toutes les procédures sont correctement remplis, sources estimées peuvent être visualisées dans la surface du cerveau du modèle pré-clinique. La figure 5 montre les sources estimées d'un sous-type particulier de pointes (en haut) et une forte-ondes (en bas) de EEI. En outre, la figure 6 montre comment les changements de distribution de la source dans des délais séquentiels au cours d'une mise en place de la saisie. Ces résultats confirment la capacité des méthodes proposées pour enregistrer haute résolution EEG sur des rats souffrant d'épilepsie focale et de mener une analyse de source en utilisant la EEG enregistré.

Figure 5. Estimation source de cerveau emplacement des IED à l'égard de différents groupes en épis (en haut) et tranchants-ondes (en bas). (A) des séries chronologiques, (B) EEG topographie, et (C) de courant corticales aigreCES. L'évaluation est effectuée à un moment spécifique marqué avec une ligne verticale rouge dans (A).
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Figure 6. sources cérébrales estimé lors de la saisie. Les instants sont marqués comme des lignes verticales rouges.
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Aucun conflit d'intérêt déclaré.