Environnement microfluidique contrôlée pour Dynamic Investigation of Blood Red Cell Agrégation

Résumé

Le protocole décrit les détails d'une procédure expérimentale pour quantifier Red Blood Cell (RBC) agrégats sous un taux de cisaillement contrôlé et constant, basé sur des techniques de traitement d'image. L'objectif de ce protocole est de relier RBC tailles d'agrégats au taux de cisaillement correspondant dans un environnement microfluidique contrôlée.

Résumé

Le sang, comme un fluide biologique non newtonien, représente l'objet de nombreuses études dans le domaine de hémorhéologie. les constituants du sang comprennent les globules rouges, les globules blancs et de plaquettes qui sont en suspension dans le plasma sanguin. En raison de l'abondance des globules rouges (40% à 45% du volume du sang), leur comportement détermine le comportement rhéologique du sang en particulier dans la microcirculation. A taux de cisaillement très faibles, les globules rouges sont perçus à assembler et entités forment des agrégats appelés, ce qui provoque le comportement non-newtonien du sang. Il est important de comprendre les conditions de la formation d'agrégats de comprendre la rhéologie du sang dans la microcirculation. Le protocole décrit ici en détail la procédure expérimentale pour déterminer quantitativement les agrégats de RBC dans la microcirculation sous taux de cisaillement constant, basée sur le traitement d'image. A cet effet, RBC-suspensions sont testés et analysés en 120 x 60 um poly-diméthyl-siloxane (PDMS) microcanaux. Les suspensions sont RBC-entplu l'aide d'un deuxième fluide, afin d'obtenir un profil de vitesse linéaire à l'intérieur de la couche de sang et de réaliser ainsi une large gamme de taux de cisaillement constant. Le taux de cisaillement est déterminée en utilisant un système de micro Particle Image Velocimetry (μPIV), tandis que les agrégats de RBC sont visualisées en utilisant une caméra à haute vitesse. Les vidéos capturées des agrégats RBC sont analysées en utilisant des techniques de traitement d'image afin de déterminer les dimensions globales sur la base des intensités des images.

Introduction

Les globules rouges (hématies) jouent un rôle crucial dans la détermination du comportement rhéologique de sang. Ils sont presque singulièrement responsable des propriétés particulières du sang in vitro et in vivo. Dans des conditions physiologiques, les RBC occupent 40% à 45% du volume sanguin. Dans la microcirculation, les globules rouges ne occupent jusqu'à 20% du volume de sang en raison de diamètre des vaisseaux plus petits et le plasma écrémage effet ^1. Ce phénomène de réduction du plasma dans la microcirculation est connu comme l'effet Fahraeus. A des taux de cisaillement faibles, les globules rouges sont en mesure de combler ensemble et former une ou dimensions des structures tridimensionnelles appelés "rouleaux" ou agrégats, contribuant ainsi au comportement non-newtonien du sang. Cependant, le mécanisme d'agrégation RBC est pas complètement compris. Deux théories existent pour modéliser l'agrégation des globules rouges: le pontage de la théorie des cellules due à la réticulation des macromolécules ² et l'attrac de forcethéorie de l'épuisement tion provoquée par des molécules due au gradient osmotique ^3.

Typiquement, pour le sang humain, des agrégats se forment à des taux de cisaillement très faibles ⁴ allant de 1 à 10 s ^-1. Au-dessus de cette gamme, les globules rouges ont tendance à désagréger et de débit séparément dans le navire.

Comprendre les conditions de la formation d'agrégats est d'une grande importance pour le domaine de hémorhéologie en termes de définition comportement rhéologique de sang. Ces agrégats sont souvent vus au niveau de macrocirculation (> 300 um de diamètre) ^5. A cette échelle, le sang est considéré comme un fluide newtonien et d'un mélange homogène. Cependant, ces agrégats sont rarement observés dans le niveau capillaire (4-10 um de diamètre) et sont habituellement une indication d'états pathologiques tels que le diabète et l'obésité ^6. Autres conditions pathologiques qui pourraient changer l'agrégation RBC inclut conditions inflammatoires ou infectieuses,les maladies cardiovasculaires telles que l'hypertension ou l'athérosclérose, les maladies génétiques et des maladies chroniques ^7. Par conséquent, la compréhension du mécanisme d'agrégation RBC et l'analyse de ces entités (en définissant une relation entre la taille de ces agrégats et les conditions d'écoulement) peut conduire à la compréhension du comportement microrhéologiques de sang et par conséquent le relier à des applications cliniques.

RBC agrégats peuvent être modifiés par plusieurs facteurs tels que l'hématocrite (volume de globules rouges dans le sang), le taux de cisaillement, le diamètre du récipient, la raideur de la membrane RBC et la composition du milieu de mise en suspension ^10.8. Par conséquent, des conditions contrôlées sont nécessaires afin d'analyser efficacement les agrégats de RBC. Plusieurs méthodes sont capables d'analyser la formation d'agrégats en fournissant des mesures d'agrégation statiques (indice d'agrégation) qui offre des informations pertinentes sur le comportement de sang. Ces procédés comprennent, entre autres, la vitesse de sédimentationProcédé selon ^11, le procédé de transmission de lumière ^12, le procédé de réflexion de lumière ¹³ et la méthode de viscosité à faible cisaillement ^14.

Peu d'études ont tenté d'étudier l'agrégation RBC et de déterminer le degré d'agrégation dans des conditions d'écoulement contrôlées ^15-17. Cependant, ces études examinent indirectement RBC tailles agrégées par la détermination du rapport de l'espace occupé dans un système de cisaillement mesurée à partir d'images microscopiques du sang fournissant des informations sur le degré d'agrégation, ainsi que la viscosité locale.

Nous présentons donc une nouvelle procédure de quantifier directement RBC regroupe la microcirculation, dynamiquement, en vertu des taux de cisaillement constante et contrôlée. RBC-suspensions sont entraînés, dans un double Y-microcanaux (comme cela est illustré sur la figure 1), avec un tampon phosphate salin (PBS) créant ainsi un écoulement de cisaillement dans la couche de sang. Dans ce sang couche A karité constantetaux de r peut être obtenue. Les suspensions de RBC sont testés à différents hématocrite (H) des niveaux (5%, 10% et 15%) et sous différents taux de cisaillement (11/02 sec ^-1). La vitesse du sang et le taux de cisaillement sont déterminées en utilisant un système de micro Particle Image Velocimetry (μPIV) tandis que le flux est visualisée à l'aide d'une caméra à haute vitesse. Les résultats obtenus sont ensuite traités avec un code MATLAB sur la base des intensités de l'image afin de détecter les globules rouges et de déterminer les dimensions globales.

Protocole

Le sang est prélevé d'individus sains avec l'approbation du comité d'éthique de l'Université d'Ottawa (H11-13-06).

1. Microchannel Fabrication

Les microcanaux sont fabriqués selon les méthodes classiques de photolithographie ^18.

1. Concevoir la géométrie de microcanaux en utilisant une conception (CAO) assistée par ordinateur et imprimer la configuration sur un transparent photo-masque. Ces masques sont essentiels car ils déterminent le trajet de lumière pendant le processus de fabrication. Dans ce cas, les dimensions de microcanaux sont de 120 um d'épaisseur, 60 um de profondeur et 7 mm de longueur.
2. Dans une salle blanche, dépôt à la tournette une résine époxy à base de résine photosensible négative sur une plaquette de silicium à 2000 tours par minute pendant 30 secondes pour obtenir la profondeur désirée de microcanaux (60 um).
3. Exposer la tranche et le photo-masque sous une lampe UV à 650 mJ / cm ² à 70 sec. Assurez-vous d'exposer uniquement les zones transparentes de laphoto-masque à la lumière UV. L'exposition des zones transparentes permet la polymérisation des chaînes aboutissant à un durcissement de la résine photosensible. Immerger la pièce de silicium en un développeur pour enlever l'excès de résine photosensible.
4. Une fois que le moule est fabriqué, mélanger un élastomère à base de silicium et un agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 pour créer une solution de poly-diméthyl-siloxane (PDMS). Mettre la solution PDMS dans une chambre à vide pour dégazer. Verser dans le moule et faire chauffer à 60 ° C pendant 90 min pour créer microcanaux. Puis lier les canaux individuels à une lame de verre en utilisant une liaison par plasma d'oxygène pendant 90 secondes.
   REMARQUE: le processus de dégazage PDMS est effectuée afin d'éliminer les bulles d'air engendrés par le processus de mélange.
5. Veiller à ce que les dimensions de microcanaux permettent de tests avec succès. Dans ce protocole, les micro-canaux ont une section rectangulaire de 120 x 60 um. En comparaison, une moyenne de RBC a un diamètre de 8 um et une épaisseur de 2 um. Lerefore, la largeur de microcanaux suffit d'observer l'agrégation appropriée et de déterminer avec précision les profils de vitesse.

2. Préparation de sang

1. Prélever le sang de donneurs volontaires en bonne santé, après l'approbation d'un comité d'éthique. On traite le sang avec de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) présent dans les tubes de collecte (7,2 mg d'EDTA dans 4 ml de sang).
   NOTE: L'EDTA est utilisé pour éviter la coagulation du sang.
2. Centrifuger les échantillons de sang trois fois pendant 10 min à 1400 x g (3000 rpm) en vue de séparer les constituants du sang. À la suite de la centrifugation, observer trois couches distinctes.
   REMARQUE: Les trois couches sont la couche de RBC (situé au fond du tube), la couche leucocyto-plaquettaire (constitué par les cellules et les plaquettes sanguines blanches situées sur le dessus de la couche RBC) et la couche de plasma (qui se trouve au-dessus de tous les autres constituants).
   1. Après la première centrifugation, recueillir le plasma sanguin à l'aide d'une pipette de sang. Eviter tout contactez avec la couche leucocytaire.
   2. Ramasser et éliminer la couche leucocytaire dans un récipient avec l'eau de Javel diluée à 10%.
   3. Ajouter 3 ml de PBS pH 7,4 à chacun des tubes de la couche de RBC restant et assurer le bon équilibre de la centrifugeuse. Mélanger délicatement les tubes et centrifuger une fois de plus à 1400 xg (3000 rpm) pendant 10 min.
      NOTE: Assurez-vous que la solution de PBS ne contient pas de magnésium ou de calcium, car ils pourraient modifier l'adhésion cellulaire.
   4. Éliminer le PBS dans les tubes après la deuxième centrifugation et retirer la couche leuco-plaquettaire résiduelle si elle est présente. Répétez les étapes 2.2.3 et 2.2.4 pour la troisième centrifugation pour obtenir des globules rouges propres.
3. Mélanger la quantité requise (0,05, 0,1 et 0,15 ml) de globules rouges propres avec plasma (0,95, 0,9 et 0,85 ml) dans un tube de 1 ml pour obtenir RBC-suspensions avec le correspondant (5%, 10% et 15% ) hématocrite. Vérifiez hématocrites avec une microcentrifugeuse.

3. Fluides Préparation

Présentez deux fluides dans la double Y-microcanaux: RBC-suspensions et PBS.

1. Ajouter 60 ul de la solution de particules de traceur fluorescent (1% de matières solides, _particules d = 0. 86 pm, λ = 542 nm _abs et λ = 612 nm _émission) dans les tubes 1 ml RBC-suspension.
   REMARQUE: Les particules traceuses fluorescentes (teints à l'intérieur des particules de polystyrène) sont utilisés pour mesurer la vitesse de l'écoulement à l'intérieur du microcanal. Ces particules fluorescent lorsqu'il est exposé à la longueur d'onde correspondante du faisceau laser (λ = 542 nm).
2. Préparer une solution de PBS à pH 7,4 et ajouter 60 ul de la solution de même fluorescent particules de traceur dans 1 ml de la solution PBS.

4. Granulats Taille Dimensions

1. Pour insérer les fluides (RBC-suspensions et PBS) dans le microcanal, utiliser deux seringues en verre de 25 pi et 100 pi. Cette volontécontribuer à réduire la conformité du système. Connecter les microcanaux aux seringues via un tube et des connecteurs ajustés les trous d'entrée. Remplir les seringues en verre à l'aide de la différence de pression existant entre le réservoir de fluide et la seringue. Assurez-vous qu'aucun des bulles sont présentes dans le système. Comme méthode alternative, utiliser un système à pression contrôlée à conduire les deux fluides dans le microcanal.
2. Placez le microcanal sur une platine du microscope inversé relié à une caméra à grande vitesse et un système μPIV. Programme de la pompe de la seringue pour les débits souhaités (par exemple, Q = 2 pl / h pour le sang engendrant un débit de Q = 8 pi / h pour PBS).
   NOTE: Une seule pompe à seringue est utilisée. L'utilisation de deux seringues en verre différents, avec deux diamètres intérieurs différents, il est possible de faire varier le débit à l'entrée de chaque branche de l'Y-microcanal.
3. Insérer les deux fluides dans la double Y-microcanaux chacun d'une entrée branche différente et à différents débits comme indiqué dans Figure 1. Afin de tester différents taux de cisaillement, changer le débit de la pompe. Cela permet de maintenir le même ratio approprié (4 dans ce cas) entre les deux branches ¹⁹ (figures 2 et 3). Attendez que le débit pour atteindre l'état d'équilibre avant d'acquérir les mesures: inspecter visuellement les images de la caméra à haute vitesse pour un flux lisse.
   Remarque: Le ratio est crucial pour obtenir un profil de vitesse linéaire à l'intérieur de la couche de sang.
4. Visualisez les globules rouges à l'aide de la caméra haute vitesse. Branchez l'appareil photo à un ordinateur pour contrôler, enregistrer et enregistrer les images de l'écoulement du fluide. Une fois que les deux écoulements de fluides atteignent l'état d'équilibre, commencer l'enregistrement.
   1. Acquérir plusieurs images pour de meilleurs résultats de traitement. Déterminez un temps d'exposition de la caméra optimale pour une image claire des agrégats.
      NOTE: Le temps d'exposition de la caméra pour ce cas est de 0,5 ms. Le choix de l'intervalle de temps entre chaque trame est basée sur la fréquence d'image de la caméra et le débit en til microcanaux. Le temps entre chaque trame traitée dans cette procédure était de 60 msec. Par conséquent, un appareil capable d'enregistrer 18 images par seconde est suffisante.
      REMARQUE: Évitez décantation de sang dans le tube et la seringue, ce qui pourrait conduire à des mesures erronées.
5. En utilisant des techniques de traitement d'image (un programme MATLAB dans ce cas) pour améliorer la qualité d'image, de détecter les agrégats dans chacune des images sur la base des intensités de pixels (représentés sur la figure 4) comme suit:
   1. Améliorer les images contrastent avec la méthode histogramme de l'égaliseur pour obtenir une meilleure qualité d'image pour chaque trame.
   2. Convertir les images en niveaux de gris en images binaires. A cet effet, définir une valeur de seuil, compris entre 0 et 1, qui dicte la conversion de chaque pixel. Tout pixel dans l'image ci-dessous de la valeur seuil sera détecté comme un pixel noir, tandis que les pixels avec des valeurs plus grandes que le seuil sera détecté comme pixels blancs.
   3. Remplissez ledes trous (si elle est présente et nécessaire) correspondant aux écarts dans l'agrégat pour de meilleurs résultats.
   4. Détecter les cellules en déterminant des pixels blancs voisins dans l'image binaire de sorte que les cellules adjacentes sont associés sous forme d'agrégats.
   5. Étiqueter les différents agrégats détectés et convertir l'image binaire en une image rouge-vert-bleu (RVB) pour une meilleure visualisation. Combiner les trames originales avec chacune des images traitées correspondant à vérifier l'efficacité de la technique de traitement d'image et de veiller à ce que toutes les cellules sont prises en considération, comme le montre la Figure 5. Effectuer les étapes 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 et 4.5.5 pour toutes les trames capturées.
   6. Calculer l'aire de chaque agrégat détecté dans la trame sur la base du nombre de pixels détectés. Basé sur le grossissement de l'objectif utilisé, calculer le facteur de conversion, en utilisant un réticule d'étalonnage, et de convertir les résultats de ² um. La moyenne des tailles d'agrégats détectés dans chaquecadre, puis la moyenne des résultats pour tous les cadres pour obtenir la taille moyenne globale pour chaque enregistrement de RBC-suspensions.
   7. Calculer l'aire d'un RBC pour déterminer un nombre estimatif représentant de globules rouges dans chaque agrégat détecté. A partir de ces résultats, le calcul de la répartition du pourcentage de globules rouges à l'intérieur de chaque agrégat en fonction de la taille d'agrégat (représentés par une estimation du nombre de cellules dans chaque agrégat), comme représenté sur la Figure 6.
      NOTE: Pour mesurer les agrégats de RBC, le logiciel ImageJ pourrait être utilisé (au lieu de MATLAB) pour effectuer les mêmes tâches sur chaque trame.

5. Fluide de vitesse et la vitesse de cisaillement Mesures

Déterminer la vitesse du fluide et donc le taux de cisaillement en utilisant un système μPIV.

1. Une fois que les données sont acquises en utilisant la caméra haute vitesse, passer à la caméra à double pulsé utilisé pour le système μPIV. Utilisez un logiciel d'imagerie pour l'image acquisition de l'écoulement et le traitement d'image pour la détermination du champ de vitesse.
2. Prenez toutes les précautions nécessaires, en fonction de la classe du laser, avant de se tourner sur le laser. Puis tourner sur le système, la caméra et le laser.
3. Calibrer l'appareil en fonction de l'agrandissement de l'objectif utilisé. A cet effet, utiliser un micro-précision de 10 um sous le microscope et définir la taille de 1 pixel dans l'image.
4. Lancer le laser et de visualiser les particules dans les deux fluides. Trouver le plan médian des microcanaux en se concentrant sur ​​les particules les plus rapides dans le débit (à savoir, les particules les plus rapides devraient être les plus brillants).
5. Réglez le dt (intervalle de temps entre deux trames consécutives) pour assurer le bon déplacement de la particule. Les particules les plus rapides doivent se déplacer environ 5 à 10 pixels entre les deux images.
6. Commencer l'enregistrement du flux. Réglez le logiciel à acquérir 100 paires d'images, 5 ms d'intervalle. Effectuer les étapes 5.4, 5.5 et 5.6 pour tous les difdiffé- RBC-suspensions et pour les différents taux de cisaillement.
   NOTE: Plus de détails de la méthode sont donnés dans l'étude de Pitts et Fenech ^20.
7. Traiter les enregistrements acquis en utilisant la méthode de corrélation croisée avec le logiciel d'imagerie.
   REMARQUE: Elle consiste à discrétiser la paire d'images en petites fenêtres de taille prédéterminée (par rapport à l'écoulement de fluide et l'intervalle de temps choisi par l'utilisateur) appelé de fenêtres de corrélation et en suivant le déplacement des particules dans chaque fenêtre.
   1. Tout d'abord, de déterminer si les images acquises nécessitent de pré-traitement (y compris la soustraction de fond, "base-clipping" ²¹ ou l'image se chevauchent ^22,23) pour un meilleur traitement des données.
   2. Ensuite, choisissez la taille de la fenêtre de corrélation et la forme, ainsi le pourcentage des images qui se chevauchent. Une étude détaillée a été réalisée par Pitts et al. ²⁴ afin de déterminer les paramètres optimaux et techniques image pré-traitement pour le sangcirculer dans des configurations de canaux différents. Exprimer les résultats en un champ de vitesse moyenne calculée à partir des 100 paires d'images et l'erreur quadratique moyenne (RMS) de la vitesse.
8. Extraire un profil de vitesse à la sortie du canal, à partir des données traitées comme montré sur la figure 7. Pour un meilleur profil, en moyenne le champ de vitesse dans l'espace.
   REMARQUE: Les barres qui composent le profil de vitesse correspond à la taille de fenêtre de corrélation choisi par rapport à la largeur du canal. L'erreur RMS de la vitesse est également représenté sur la figure 7, représentant l'erreur dans l'estimation de vitesse expérimentale.
9. Éteignez le laser une fois que toutes les mesures et les traitements sont effectués ,. Arrêtez tous les composants du système: logiciels, caméras, stade déplacement, les ordinateurs et laser.
10. Pour calculer la vitesse de cisaillement, d'une part détecter et estimer l'épaisseur de sang dans le microcanal sur la base de l'enregistrement de la caméra grande vitesse. A cet effet, la moyenne de toutesles trames spécifique dans l'enregistrement afin d'obtenir une image d'arrière-plan de la vidéo. Délimiter la couche de sang (comme représenté sur la figure 8 pour les RBC-suspensions fluides à 10 ul / h lorsqu'il est en suspension à 5%, 10% et 15% hématocrite). Obtenir la valeur de la vitesse de l'épaisseur de la couche de sang correspondant et calculer la vitesse de cisaillement en divisant la valeur de la vitesse par l'épaisseur de la couche de sang.

Résultats

Un exemple de l'écoulement à deux fluides dans le double Y-microcanal est représenté sur la Figure 2 pour les globules rouges humains en suspension à 5%, 10% et 15% d'hématocrite et circulant à 10 ul / h. La Figure 3 montre la différence dans les tailles agrégées lorsque l'écoulement dans le canal est réduite de 10 ul / h à 5 ul / h pour un hématocrite de 10%. Cela donne une notion qualitative de la taille des agrégats en variant l'hématocrite et du taux de cisaillement. La figu...

Discussion

En utilisant la méthodologie actuelle, il est possible d'analyser qualitativement et quantitativement la RBC regroupe sous différentes conditions d'écoulement et hématocrites. Pour le test avec succès et la détection globale, il est essentiel de déterminer le rapport de vitesse approprié entre les deux fluides à l'entrée du microcanal. Ce rapport est très important pour obtenir une épaisseur de couche de sang optimal où le profil de vitesse est quasi-linéaire ^19.

Un au...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SU8-50 Photo-resist négatif à base d’époxy	MicroChem Corp.
SU8-50 développeur	MicroChem Corp.
Poly(diméthylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
PE-50 series Système plasma  ;	Plasma Etch		PE-50
Tubes de prélèvement sanguin avec K2-EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique)	FisherSci	B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F
Poshpate sérum physiologique tamponné (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Tracer fluorescent solution de particules (15 ml)	FisherSci	R800
Aggregometer	RheoMeditech	Rheo Scan AnD300
Seringues en verre (50 µ ; l)	Tube Hamilton	80965
(Tygon)	FisherSci	AAA00001
Caméra haute vitesse (Basler)	Graftek Imaging Inc.	basler acA2000-340km	Une caméra capable d’enregistrer 18 images par seconde a pu être utilisée.
Caméra à double impulsion		LaVision Imager Microscope intense
MITAS	LaVision	MITAS
Laser Nd :YAG	New Wave Research	Solo-II
Pousse-seringue (Nexus3000 et PicoPlus)	Chemyx Inc. et Harvard Apparatus	Nexus3000 et PicoPlus
Logiciel DaVis	LaVision	Davis