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En Vivo Dynamique de la rétine microglial activation cours neurodégénérescence: confocale ophtalmoscopique Imaging and Cell Morphometry dans Souris glaucome

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DOI :

10.3791/52731

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11 mai 2015

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1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah

Dans cet article

Résumé

activation de cellules microgliales et microgliose sont des réponses clés à la neurodégénérescence chronique. Ici, nous présentons les méthodes pour in vivo, la visualisation à long terme de la rétine CX3CR1-GFP + cellules microgliales par ophtalmoscopie confocale, et pour le seuil et analyses morphométriques d'identifier et de quantifier leur activation. Nous surveillons changements microgliales durant les premiers stades de glaucome liée à l'âge.

Résumé

Microglie, qui sont des cellules neuro SNC-résidents, transforment leur morphologie et la taille en réponse aux dommages CNS, le passage à un état activé avec des fonctions distinctes et les profils d'expression génique. Les rôles de l'activation de la microglie dans la santé, les blessures et la maladie restent encore mal compris en raison de leur régulation dynamique et complexe en réponse à des changements dans leur microenvironnement. Il est donc essentiel de surveiller de manière non invasive et analyser des changements dans l'activation microgliale au fil du temps dans l'organisme intact. Des études in vivo de l'activation de la microglie ont été retardés par des limitations techniques de suivi du comportement des microglies sans altérer l'environnement CNS. Cela a été particulièrement difficile pendant la neurodégénérescence chronique, où les changements à long terme doivent être suivis. La rétine, un organe CNS prêtent à l'imagerie en direct non-invasive, offre un puissant système de visualiser et de caractériser la dynamique de l'activation de la microglie lors de troubles chroniques.

l'imagerie in vivo de la rétine de la microglie, en utilisant ophtalmoscopie confocale (ALSC) et souris / + rapporteurs CX3CR1 GFP, de visualiser la microglie avec une résolution cellulaire. Aussi, nous décrivons des méthodes pour quantifier les changements mensuels dans l'activation des cellules et de la densité dans les grands sous-ensembles de cellules (200-300 cellules par la rétine). Nous confirmons l'utilisation de la zone de autosomique une mesure utile pour le suivi en direct de l'activation de la microglie dans la rétine en appliquant automatisé analyse morphométrique basé sur un seuil d'images in vivo. Nous utilisons ces acquisition d'images en direct et des analyses des stratégies pour surveiller les changements dynamiques dans l'activation de la microglie et microgliose durant les premiers stades de la neurodégénérescence rétinienne dans un modèle de souris du glaucome chronique. Cette approche devrait être utile pour enquêter sur les contributions de la microglie à baisse neuronale et axonale dans les troubles chroniques du système nerveux central qui affectent la rétine et du nerf optique.

Introduction

Ces cellules microgliales neuroimmunes qui résident exclusivement dans le système nerveux central (SNC), depuis le développement embryonnaire précoce et tout au long de l'âge adulte. Equipé d'un répertoire complexe de récepteurs, l'activité de la microglie et l'hétérogénéité régionale sont régies par leur interaction bidirectionnelle avec les neurones voisins, gliales, barrière hémato-encéphalique et infiltrant les cellules neuro-inflammatoires 1,2. Fonctions microgliales basales contribuent à l'entretien et la réparation physiologique, comme ils échantillonnent leur territoire pour des perturbations de l'homéostasie 3,4. Pendant une lésion du SNC ou de la maladie, les microglies sont les premiers intervenants à des signaux neuronaux qui déclenchent alors leur transition vers un phénotype réactif, appelé "activé microglie 2,5-7. l'activation de la microglie implique un cycle complexe de gènes et expression de la protéine, qui sont couplés à soma des cellules et processus de redimensionnement et le remodelage 6-9. activation de cellules microgliales, ainsi que la redistribution de la cellule etclustering, peut être accompagnée de l'augmentation globale locale dans le nombre de cellules (de microgliose appelé). Cela peut résulter de la prolifération cellulaire et l'auto-renouvellement, avec ou sans le recrutement de monocytes dérivés du sang 3,4,7,10-14. Dans un large éventail de maladies du SNC, chroniques dépendant de l'âge, soutenue microgliose et l'activation de la microglie maladie parallèle progression 15-19. Comment microglie l'impact neurodégénérescence reste incertaine, principalement parce qu'ils jouent deux rôles neuroprotecteurs et délétères qui peuvent avoir diverses contributions à l'apparition et la progression de la maladie. Études d'imagerie en direct visant à comprendre la maladie chronique du système nerveux central ont surveillé le comportement de la microglie dans le SNC endommagé des modèles animaux et des humains, et a démontré que des altérations microgliales sont début détectable à des stades précoces de la maladie 15-17,19,20. Ainsi, il est essentiel de développer des approches pour détecter et surveiller l'activation des microglies in vivo.

Dete non-invasivection des changements régionaux dans l'activation des microglies du cerveau a été créé comme un indicateur important dans vivo de progression de la maladie neurodégénérative, en utilisant l'imagerie moléculaire ou bioluminescence et la tomographie par émission de positons ou imagerie par résonance magnétique 18,21,22. Ces méthodes d'imagerie moléculaire et nucléaire hautement quantitatives et non invasives détectent gliose avec une résolution régionale. Alternativement, deux photons imagerie confocale en CX3CR1 GFP / + souris a permis l'observation de la microglie du cerveau avec une résolution cellulaire 3,4,9,20,23-28. Cependant, cette approche limite à long terme et l'observation répétée d'altérations microgliales chroniques, étant donné le risque potentiel de perturber leur comportement par des procédures d'imagerie cérébrale, même minimalement invasives 29. Alternativement, la rétine offre des conditions optimales pour la visualisation directe, dans vivo et la surveillance répétée de la microglie dans leur niche CNS intact tout au long vieillissement, suite à une blessure aiguë, etpotentiellement au cours de maladies neurodégénératives chroniques. Ainsi, des études récentes ont prouvé la faisabilité d'imagerie à haute résolution de la microglie rétiniennes exprimant la GFP en adaptant la ophtalmoscopie confocale à balayage laser (ALSC) à l'image en direct CX3CR1 GFP de souris / +. Cela a été utilisé pour suivre les variations hebdomadaires GFP + cellulaires numéros dans les souris individuelles pour un maximum de 10 semaines après une lésion aiguë induite ou d'hypertension oculaire 30-36.

Nous avons étendu cette approche pour réaliser une imagerie à long terme sur plusieurs mois, et de suivre quantitativement les changements dans l'activation de la microglie basés sur la taille de soma en utilisant une analyse morphométrique. Somal taille a été définie comme une mesure utile de l'activation de la microglie dans les études d'imagerie en direct à deux photons en utilisant la microscopie confocale en tranches corticales pour effectuer l'imagerie in vivo de CX3CR1-GFP + 9 microglie. Ces et d'autres études ont également démontré la corrélation entre la taille de autosomique et les niveaux d'expression de la protéine Iba1, which augmente également avec l'activation 9,37. Ainsi, la microglie activée peut être identifiée dans des souris vivantes, et leur nombre et leur répartition contrôlée dans le temps au cours de la santé et de la maladie du SNC.

Ce protocole décrit des méthodes pour ALSC acquisition d'images en direct et d'analyse pour surveiller le nombre de cellules microgliales, la distribution et l'activation morphologique au cours cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) de la dégénérescence (Figure 1). Ainsi, cette étude utilise: 1) un modèle de souris du glaucome héréditaire (DBA / 2J) qui subit dépend de l'âge du nerf optique et de la neurodégénérescence rétinienne et présente une variabilité remarquable progression de la maladie entre 5 et 10 mois de 38,39 ans, 2) mois ALSC imagerie in vivo pour la visualisation à long terme de cellules GFP + dans la rétine et du nerf optique non myélinisées de hétérozygotes CX3CR1 GFP / + DBA / 2J souris âgées de 3 à 5 mois, 3) en temps réel une analyse de formation d'image par segmentation et d'un seuil pour isoler des corps cellulaires des cellules et mesure lazone ir. Ces stratégies sont appliquées pour évaluer la cinétique de états d'activation de la microglie rétiniennes durant les premiers stades de glaucome chronique.

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Protocole

Imagerie in vivo est effectuée dans des installations exemptes d'agents pathogènes en utilisant des protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université de l'Utah.
Remarque: Ce protocole d'imagerie est utilisé pour des souris rapporteurs dans lequel la microglie rétiniennes et les monocytes / macrophages infiltrants expriment la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du locus du récepteur de la fractalkine (CX3CR1).

1. imagerie in vivo de la rétine GFP + microglie par microscopie confocale à balayage laser ophtalmologique (ALSC)

  1. Allumez le système de chauffage contrôlé par l'eau, mettre à stabiliser la température de la souris entre 35-37 ºC durant la procédure, et de connecter deux coussins chauffants.
    1. Démarrer le système confocal ophtalmoscope laser à balayage (ALSC) (figure 2A). Ouvrez le programme d'ALSC, entrez les informations qui permettra d'identifier la souris individuelle et en une courbure cornéenne de 2 mm (menu Données du patient).
  2. Préparez-vous à imaGing. Adapter en toute sécurité un grand champ 55º lentille propre objectif sur son socket. Préparer la plate-forme d'imagerie de ophtalmoscope en obtenant un coussin chauffant recouvert de papier propre. Utilisez des pinces pour aplatir le tampon et le papier et les empêcher de bloquer le mouvement de l'objectif.
  3. Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de 1,3% de 2,2,2-tribromoéthanol et 0,8% d'alcool tert-amylique (250 mg / kg de poids corporel; 0,5 ml / 25 g de poids corporel) en utilisant une aiguille G 30½ monté sur un 1 ml à usage unique seringue. Souris revenir à sa cage, gardé sur un coussin chauffant.
    NOTE: La livraison de l'anesthésie par injection contre l'inhalation permet un positionnement plus facile de la souris pour l'imagerie et un libre accès pour les yeux, libre de cônes de nez et les tubes.
  4. Une fois l'animal arrête de bouger et ne répond pas au pincement de la queue, de provoquer la dilatation des pupilles avec Tropicamide et la phényléphrine (0,5% chacun), en positionnant l'animal couché et couvrant à la fois les yeux avec des gouttes pour 7 min.
  5. Après 5 min, placer la souris sujettes au centre de la plate-forme de ophtalmoscope, et lentilles de contact ajustement sur les deux yeux, en appliquant une pression minimale.
    NOTE: Les lentilles de contact sont petites et fragiles, mais peuvent être manipulés avec soin avec les doigts, bien forceps peuvent être utilisés à la place 40. L'utilisation de lentilles de contact est facultative, mais recommandée, car elle minimise la sécheresse oculaire et préserve la transparence de la cornée lors de l'imagerie.
  6. Après 7 minutes, orienter la souris avec l'œil droit face à l'objectif et l'orbite parallèle à la lentille de l'objectif, en gardant l'animal effrénée près du bord de la plate-forme (figure 2B). Pour récupérer des images de la saturation et de l'orientation comparable, de maintenir constamment la distance de l'œil à lentille d'objectif, ainsi que l'alignement de l'œil à la trajectoire de la lumière tout au long de sessions d'imagerie. Clips longues moustaches interférant avec l'observation de l'œil.
    NOTE: Pour la prochaine 8-10 min, la souris ne se déplace pas ou clignote, et la volonté souffle avec mouvement doucements, qui sont suivis par l'ALSC Eye Tracking ART mode (automatique en temps réel), qui ajuste la position de la tête de balayage sur la base de points de repère du fond d'œil avec un contraste élevé. Passé ce moment-là, les souris commencent à clignoter et haletant, faisant imagerie impraticable.
  7. Si l'imagerie est réalisée sans utiliser des lentilles de contact, appliquer PBS tombe à deux yeux tous les 2-3 min pour les empêcher de sécher.
  8. Récupérer une image de fond de la vascularisation de la rétine et de la papille optique, axée sur la rétine interne.
    1. Sélectionnez le mode infrarouge (IR) et ajuster les paramètres à 820 nm excitation, 100% de la puissance laser, 40-60% de sensibilité (figure 2C).
    2. Travailler en mode haute vitesse (12,6 images / sec), de localiser l'œil en utilisant le joystick pour conduire l'ophtalmoscope. A faible grossissement, inspecter la cornée et le cristallin de blessure ou de l'opacité, et exclure des yeux de l'étude avec des défauts ou des blessures qui affecteront l'imagerie de la rétine (figure 3A).
    3. Localisez la zone de disque optique (la surface dela tête du nerf optique, ONH) en rapprochant l'œil de l'objectif, puis centrer l'image sur elle et verrouiller cette position par vissage de la manette. Cet alignement de l'œil à l'ophtalmoscope est la clé pour obtenir même se concentrer et d'émission à travers l'image.
    4. Visualiser les plans intérieurs de la rétine, ainsi que la ONH, en utilisant les principaux vaisseaux sanguins situés sur la surface vitréenne de la rétine comme un plan de référence central (59 et 60 D), ou plus profond (55 D) dans les yeux montrant optique excavé les disques. La mise au point optimale devrait résoudre les cellules sanguines circulantes dans les principaux vaisseaux sanguins, avec leur lumière et les murs bien distinctes.
    5. Optimiser saturation de l'image en ajustant la molette sur le panneau de contrôle à écran tactile, jusqu'à un halo blanc d'éclairage uniforme couvre dans la plupart du champ 55º de fond autour du disque optique (à l'aide légère surexposition). Ensuite, abaisser la saturation pour optimiser le contraste jusqu'à ce que les cellules sanguines se déplacent le long des grands navires peuvent être clairement résolus. Si sombre focalezones persistent, pas due à des lésions rétiniennes, réaligner l'œil à la caméra jusqu'à ce qu'une image uniformément lumineux est obtenue. Cet ajustement est fondamentale pour capturer ensembles reproductibles d'images en position et la qualité.
    6. Recueillir une image infrarouge à haute résolution de la rétine centrale (1,4-1,7 mm de diamètre, en fonction de l'âge), avec une moyenne de 30 images en temps réel (4,7 images / s; normalisé), pour améliorer le rapport signal-sur-bruit (figure 2D ).
  9. Immédiatement, acquérir une image de fluorescence de GFP + microglie et / ou monocytes infiltrants localisées aux plans internes de la rétine et de la papille optique.
    NOTE: L'optimisation de l'image du fond d'oeil IR de la rétine détermine la résolution de l'image de fluorescence de cellules GFP +, ainsi que l'étendue de la rétine interne étalonné. Défaut de concentrer les plans intérieurs de la rétine, qui peut être détectée par une faible résolution de la vascularisation, se traduira par GFP + cellulaires vues grisés (figure 3B). Un mauvais réglage IR saturation affecte correctement et uniformément l'image de fluorescence (FA), présentant des variations d'artefact dans GFP + intensité et la taille des cellules (figure 3C).
    1. Swich à la fluorescence mode d'imagerie (FA) dans le panneau de l'écran tactile, en utilisant du bleu, l'excitation de 488 nm laser (de 460 à 490 nm filtre barrière de jeu), et les paramètres d'acquisition (100% de la puissance laser et 100-125% de sensibilité), qui sont maintenues constante pour toutes les souris (figure 2E).
    2. Recueillir un seul point xy, image de fluorescence bidimensionnelle de la rétine, et de capturer immédiatement une image de fond à la position identique (100x moyenne de balayage; 55º angle de balayage pour les deux images; Figure 2F).
    3. Capturer une image multipoint en sélectionnant «composite» dans le panneau de contrôle (Figure 2G) et en déplaçant le droit de ophtalmoscope et à gauche, panoramique de la rétine à travers l'axe nasal-temporelle (figure 2H).
      Remarque: Après la numérisation d'une seule image xy point (s 100xpeut en moyenne), le logiciel automatiquement moyennes nouveaux scans du même et de nouveaux domaines (circonscrites avec un cercle vert pendant la numérisation optimale, ou rouge lorsque l'analyse est impossible), et tous les points xy-positions en temps réel. L'image composite résultant couvre 1,5-1,7 mm sur l'axe horizontal x 3-4 mm de l'axe vertical (55º x 120-124º d'angle de balayage).
  10. Imagerie complète de chaque souris dans les 15 min après l'induction de l'anesthésie, avant de clignoter et redémarre de mouvement.
  11. Enlever les lentilles de contact, les yeux d'hydrate avec du PBS et le réexpédier vers sa cage réchauffé, vérifier le comportement jusqu'au rétablissement complet de la motilité.
  12. Pour les études longitudinales utilisant sessions ALSC-imagerie intermittents dans la même souris individuelle, répéter imagerie pas moins de 3 jours d'intervalle pour éviter la toxicité cumulative de l'anesthésie, ainsi que l'irritation de la cornée.

2. direct Traitement et analyse d'images

  1. Alignement de l'image séquentielle:
    1. Alignerles images du fond d'œil pour une série chronologique de l'oeil en utilisant le même système vasculaire et le disque optique comme des sites d'intérêt. Ouvrez toutes les images dans un programme de présentation du diaporama commerciale, en faisant glisser chaque image au cours de la précédente jusqu'à ce que leurs disques optiques alignés sur le plan xy (l'image du haut apparaît semi-transparent tout en étant traîné), puis faites pivoter l'image du haut jusqu'à ce que son les principaux vaisseaux sanguins se chevauchent avec le système vasculaire dans l'image suivante (mise au point sur des navires les plus éloignés de la papille optique). Notez l'angle de rotation pour chaque image et enregistrer cette série de temps pour référence future, garder la trace de l'identité de la souris et les yeux.
    2. Aligner la série correspondante d'images de fluorescence xy-point unique en appliquant l'angle enregistré pour corriger la rotation xy à chaque point de temps, en utilisant un programme d'édition graphique de trame. En outre, régler la résolution à 300 dpi (sans mise à l'échelle) et le fond (en mode RVB, sélectionnez Niveaux et goûter à la lumière d'un vaisseau sanguin en noir). Enregistrer ces imagescomme des fichiers TIF, ajoutant "aligné" à leurs noms.
  2. Microglie segmentation cellulaire:
    1. Pour identifier les cellules GFP + dans la rétine centrale, ouverte en FluoRender la "aligné" fichier TIF correspondant au premier point dans le temps / l'âge. Agrandir l'image pour remplir l'écran, puis définir la vue Render (composite, orthogonale, interpolée) et ses propriétés (0,58 gamma, 255 point de saturation, 255 luminance, 195 alpha et 1,00 ombrage), sélectionnant les deux canaux de RG que visible (hide B canal en double-cliquant dessus dans le cadre de l'espace de travail; la figure 4A).
    2. Pour sélectionner des cellules individuelles, seuil du canal rouge (doit être mis en évidence sur le cadre de l'espace de travail), en augmentant le seuil bas jusqu'à ce que la majorité des cellules sont masqués (blanc) avec des processus de recouvrement et de cellules minimales (cyan), tout en maintenant constant le seuil haut (255). La faible valeur de seuil varie entre 100 et 170, en fonction de l'intensité de fluorescence (Figure 4B </ Strong>).
    3. Enregistrer ce point de vue avec le canal rouge visible uniquement (commande Capture) comme un nouveau fichier TIF, ajoutant "cellsegm" à son nom d'origine (figure 4C). L'utilisation d'un logiciel d'édition graphique de trame générique, inverser son échelle de gris et d'ajuster la résolution à 300 dpi comme ci-dessus, et enregistrer à nouveau en tant que RVB (figure 4D).
      REMARQUE: Supprimez les dossiers (projets) créés automatiquement par FluoRender, et sauver le seuil appliqué pour référence future.
  3. Microglie segmentation du soma et morphométrie:
    1. Pour identifier GFP + corps cellulaires pour la zone quantification, utiliser un logiciel d'analyse d'image avec des mesures automatisées d'intensité et les capacités de seuil, ainsi que basé sur un seuil objet comptage et mesure. Ouvrez le fichier TIF "de cellsegm", et sélectionnez la méthode de rééchelonnement (spline) et le canal rouge (cliquez sur l'onglet rouge en RVB). Améliorer la visualisation en décochant "vue canal de couleur" (clic droit sur le RG rougeonglet B), et en sélectionnant "complètent couleurs" (Image / Ajuster l'image) pour inverser l'échelle de gris et de voir les cellules en gris / noir sur fond blanc (figure 4E).
    2. Calibrer l'image à 1,4-1,7 mm en fonction de l'âge, en traçant une ligne horizontale à travers la totalité de l'image (calibrage, étalonnage rapide).
    3. Segment cellule individuelle corps cellulaires par l'application d'un seuil d'intensité (Figure 4B). Pour cela, le travail sur le canal RVB rouge et ouvrir la fonction seuil d'intensité (Count objet; sélectionnant commande "update de comptage") afin de suivre les paramètres bidimensionnels pour chaque région seuillées d'intérêt (ROI) représentant somata individu.
    4. Définir le seuil d'intensité de l'histogramme d'intensité, en notant le bas de 50 à 60% des niveaux 255, et d'affiner la valeur de seuil finale en évaluant visuellement le chevauchement entre le masque seuil de couleur (bleu) et du périmètre du corps cellulaire (gris) dans les cellules individuelles (Figure 4E).
    5. Estimer la précision des masques de soma cellulaire pour représenter les dimensions Somal en mesurant la surface avant et après la segmentation en 10 cellules et accepter la plage de seuil sélectionné si les mesures diffèrent moins de 10% (utiliser la barre d'outils binaire et mesures annotées).
    6. Identifier manuellement ROI de Somal qui comprennent plusieurs cellules et séparent ces éléments (éliminer ou ROI séparés en utilisant les contrôles binaire barre d'outils, ou le catalogue d'objets), tandis que le basculement / désactiver le binaire de visualiser directement les cellules (Figure 4F).
    7. Classer les cellules microgliales que ROI avec des zones de Somal plus grand et plus petit que 50-60 um 2 à discriminer soma de cellule correspondant à la microglie activé et désactivé la microglie, respectivement, en utilisant la région Restriction.
      Remarque: chaque sous-ensemble de Somal cellulaire est identifié par une couche binaire pseudocolored différent, et peut être caractérisé en outre d'autres paramètres morphologiques (périméter, la circularité, etc.), ainsi que dans les secteurs de la rétine quantifiée discrets (figure 4G). Enregistrer l'image analysée comme un fichier ND2.
    8. Vérifier le processus et la complexité de branchement dans les cellules microgliales activées individuelles, en superposant le masque de autosomique et l'image -point unique xy (contraste augmenté de 50%; Figure 4H). Compter manuellement les processus étendant directement à partir du corps cellulaire ou mesurer le diamètre du polygone englobant l'arbre (utiliser la barre d'outils et de mesures binaire annotées).
      REMARQUE: Les cellules activées manquent de processus ou portent peu (<4) et court ( 3-10x diamètre de Somal) entourant leur relativement petite soma.
    9. Identifier manuellement des cellules avec somata inférieure à <20 um 2 et / ou l'expression de GFP sous la limite de détection, qui ne sont donc pas détecté par enintensité seuil. Utilisez la commande de la taxonomie dans les annotations de compter éléments identifiés manuellement.

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Résultats

Nos récentes études in vivo ont utilisé ces méthodes d'acquisition et d'analyse d'image en direct de visualiser et de suivre la cinétique et les modèles de ONH et les changements microgliales rétiniennes durant les premiers stades de glaucome chronique et leur relation à la fin de la neurodégénérescence 59. Ici, nous illustrons un protocole d'acquisition d'image ALSC pour visualiser les cellules microgliales sur une grande surface de la rétine centrale dans les différents jeunes h...

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Discussion

Le suivi direct du nombre de cellules de la microglie et morphologique au cours de l'activation d'une maladie neurodégénérative nécessite l'utilisation de procédés d'imagerie non invasifs permettant la visualisation détaillée des caractéristiques de la cellule. Après l'imagerie, les cellules microgliales doivent être isolés (segmenté) pour l'analyse morphométrique par l'utilisation de plusieurs étapes de seuil pour évaluer la taille de autosomique et / ou de la complexité des processus de lec...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Scientific Computing and Imaging Institute de l’Université de l’Utah pour l’utilisation du logiciel FluoRender (R01GM09815). Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de recherche sur le glaucome, de la Fondation Melsa M. et Frank Theodore Barr et de l’Institut national de la santé des États-Unis (R01EY020878 et R01EY023621) à M.L.V., et (R01EY017182 et R01EY017950) à B.K.A.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souris DBA/2J et CX3CR1-GFP/+Les souris Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME000671 et 00582sont élevées en interne, introduisant de nouveaux reproducteurs toutes les 3 à 4 générations pour éviter la dérive génétique.
30½ ; Aiguille G et seringue à pointe glissante à la tuberculine de 1 mlBD, East Rutherford, NJ305106 et 309659
2,2,2-tribromoéthanol, alcool tert-amylique à 99 % et tampon phosphate en comprimés salinsSigma-Aldrich, St. Louis, MOT48402, 152463 et P4417solution d’Avertin (pH 7,3, filtrée stérile) doit être une solution fraîchement préparée ou conservée à 4 ° ; C jusqu’à 1 semaine.
Thérapie par la chaleur T/PumpGaymar Industries, Orchard Park, NYTP-650
Applicateurs à embout de cotonFisher Scientific, Pittsburgh, PA23-400-100
Tropicamide 1 %Bausch & Lomb, Rochester, NYNDC 24208-585-64
Lentilles de contact PMMA, courbe de base de 1,70, diamètre total de 3,2 mm, centre de 0,40 mm d’épaisseurCantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, Royaume-UniG003709Les verres sont rincés avec du PBS stérile et stockés dans des boîtes en polypropylène.
Ophtalmoscope laser à balayage confocal HRA/Spectralis et logiciel Eye ExplorerHeidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CAVersion 1.7.1.0
PowerPointMicrosoft, Redmond, WAVersion 14.4.3
Adobe PhotoshopAdobe, San Jose, CAVersion CS3
FluoRenderScientific Computing and Imaging Institute, Université de l’UtahVersion 2.13Logiciel gratuit. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements CNikon, Melville, NYVersion 4.30.01
La

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