Souris Naïf CD4 + Isolement des cellules T et In vitro Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Résumé

Les lymphocytes T CD4⁺ naïfs se polarisent en divers sous-ensembles en fonction de l’environnement au moment de l’activation. La différenciation des lymphocytes T CD4⁺ naïfs en divers sous-ensembles effecteurs peut être réalisée in vitro par l’ajout de stimuli des récepteurs des lymphocytes T et de signaux spécifiques de cytokines.

Résumé

Antigène Les lymphocytes T CD4⁺ inexpérimentés (naïfs) subissent une expansion et une différenciation en sous-ensembles effecteurs au moment de la reconnaissance par le récepteur des lymphocytes T (TCR) de l’antigène apparenté présenté sur le CMH de classe II. Les signaux cytokiniques présents dans l’environnement au moment de l’activation du TCR sont un facteur majeur dans la détermination du devenir effecteur d’un lymphocyte T CD4⁺ naïf. Bien que l’environnement des cytokines lors de l’activation des lymphocytes T naïfs puisse être complexe et impliquer à la fois des signaux redondants et opposés in vivo, l’ajout de diverses combinaisons de cytokines lors de l’activation des lymphocytes T CD4⁺ naïfs in vitro peut facilement favoriser l’établissement de lignées T auxiliaires effectrices avec l’expression caractéristique des cytokines et des facteurs de transcription. De telles expériences de différenciation sont couramment utilisées comme première étape pour l’évaluation de cibles censées favoriser ou inhiber le développement de certains sous-ensembles auxiliaires de CD4⁺ T. L’ajout de médiateurs, tels que des agonistes de signalisation, des antagonistes ou d’autres cytokines, au cours du processus de différenciation peut également être utilisé pour étudier l’influence d’une cible particulière sur la différenciation des lymphocytes T. Ici, nous décrivons un protocole de base pour l’isolement des lymphocytes T naïfs de souris et les étapes ultérieures nécessaires pour polariser les cellules naïves à diverses lignées effectrices T auxiliaires in vitro.

Introduction

Le concept de lignées ou sous-ensembles de CD4 ⁺ T auxiliaires distinctes (Th) cellules a été autour depuis la dernière partie du 20 ^e siècle ^1. Reconnaissance de l'antigène correspondant à la présence de signaux de co-stimulation dans les résultats de plusieurs cycles de la prolifération cellulaire et la différenciation ultérieure dans les cellules Th effecteur. Le type de cellule Th générée lors de ce processus dépend de l'environnement de cytokines présentes lors de l'activation ^2. Initialement, les cellules Th naïves étaient considérés polariser en deux lignées distinctes suivantes récepteur de cellule T (TC....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales sont effectuées en utilisant les protocoles approuvés par le bureau de la santé et de la sécurité de l'environnement à l'Université Franklin Rosalind de médecine et des sciences. C57BL / 6 (acheté chez NCI) utilisé pour ce protocole ont été logés dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques, et toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en utilisant des protocoles approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux (IACUC) au Franklin Université Rosalind de médecine et Science.

1. Préparation des instruments, des fournitures et réa....

Résultats

Le point de temps pour l'analyse de la différenciation peut varier en fonction de l'état en cours de test Th, ainsi que la force de l'activation du récepteur de cellule T. Après 2-3 jours de différenciation, les cellules peuvent être visualisées par microscopie optique afin de déterminer l'étendue de la prolifération des lymphocytes T. Wells présentant vaste prolifération et l'agglutination des cellules sera probablement prêt pour l'analyse au jour 4. conditions de différenciation reposant sur l'addition de IL-2 exogène.......

Discussion

Bien que la rate contient des cellules Th naïves, la proportion de cette population dans les ganglions lymphatiques est beaucoup plus élevé. L'incapacité d'identifier correctement et enlever les ganglions lymphatiques dans ce protocole se traduira par un mauvais rendement des cellules naïves. Cela peut être particulièrement difficile dans les souris des souris mâles âgés ou qui ont plus de tissus gras. Comme le montre la figure 1, une fixation correcte et piégeage des membres et de la peau anima.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI complet :			Réchauffer dans un bain-marie de 37 oC avant utilisation
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10 % FBS	Life Technologies	26140-079
1000X 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100X Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100X L-glutamine	Life Technologies	25030081
maille en nylon de 120 microns	Amazon	CMN-0120-10YD	Coupé en carrés de 2 cm2 et autoclave
Alternative : crépines à cellules de 100 microns	Fisher	08-771-19	Alternative à la découpe du tampon
de roulement autoMACS	Miltenyi	130-091-221	Réchauffer dans un bain-marie de 37 oC avant utilisation
solution de rinçage autoMACS	Miltenyi	130-091-222	Réchauffer dans un bain-marie de 37 oC avant utilisation
billes CD4	Miltenyi	130-049-201
Tampon de lyse ACK	Life Technologies	A10492-01
Cytokines :
Humaines (h) IL-2	Peprotech	200-02
Souris recombinante (rm) IL-4	Peprotech	214-14
rmIL-6	R & D Systems	406-ML-025
rmIL-12	Peprotech	210-12
hTGFb	R & D Systems	240-B-010
Anticorps :
2C11 (anti-CD3)	BioXcell	BE0001-1
37.51 (anti-CD28)	BioXcell	BE0015-1
11B11 (anti-IL-4)	BioXcell	BE0045
XMG1.2 (anti-IFNg)	BioXcell	BE0055
anti-CD62L-FITC	BioLegend	104406	Utilisation à 1:100
anti-CD25-PE	BioLegend	102008	Utilisation à 1:400
anti-CD4-PerCP	BioLegend	100434	Utilisation à 1:1000
anti-CD44-APC	BioLegend	103012	Utilisation à 1:500
Phorbol  ; 12-myristate 13 acétate (PMA)	Sigma-Aldrich	P-8139	Préparer une pâte à 0,1 mg/ml dans du DMSO et congeler les aliquotes à -20 oC
Ionomycine	Sigma-Aldrich	I-0634	Préparer une mère à 0,5 mg/ml dans du DMSO et congeler les aliquotes à -20 oC
Brefeldin A	eBioscience	00-4506-51	Utiliser à 1:1000