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Article de méthode

Étiquetage et à médiation virale transplantation de Medial ganglionnaire Eminence (MGE) Cellules pour

11.1K vues

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DOI :

10.3791/52740

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23 avril 2015

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1Department of Psychiatry, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco

Dans cet article

Résumé

GABAergiques progéniteurs des interneurones corticaux dispersent, développer et synaptique intégrer dans un cortex hôte après la transplantation. Ces cellules peuvent être facilement transduites avant la transplantation pour les études in vivo de précurseurs GABAergiques génétiquement modifiés. Ici, nous montrons les techniques de marquage viraux pour cibler des sous-groupes de interneurones spécifiques utilisant des lignes existantes et les journalistes Cre Cre-dépendantes.

Résumé

GABAergiques interneurones corticaux, provenant de la médiane embryonnaire et éminences ganglionnaires caudale (MGE et CGE), sont fonctionnellement et morphologiquement diversifié. Incursions ont été réalisés dans la compréhension des rôles des différents sous-groupes de interneurones corticaux, cependant, il ya encore de nombreux mécanismes pour être élaborés qui peuvent contribuer au développement et à la maturation des différents types de cellules GABAergiques. De plus, la signalisation GABAergique modifié peut contribuer à des phénotypes de l'autisme, la schizophrénie et l'épilepsie. Lignes Cre-pilote spécifique ont commencé à morceler les fonctions de sous-groupes de interneurones uniques. Malgré les progrès réalisés dans des modèles de souris, il est souvent difficile d'étudier efficacement des interneurones GABAergiques progéniteurs corticale avec des approches moléculaires in vivo. Une technique importante utilisée pour étudier la programmation autonome des cellules de ces cellules est une transplantation de cellules dans le cortex MGE hôtes. Ces cellules transplantées migrent largement, différencier, une intégrer fonctionnellement. En outre, les cellules peuvent être efficacement MGE transduites avec des lentivirus immédiatement avant la transplantation, ce qui permet une multitude d'approches moléculaires. Ici, nous en détail un protocole de transduire efficacement des cellules MGE avant la transplantation pour l'analyse in vivo, en utilisant des lignes disponibles Cre-conducteur et des vecteurs d'expression Cre-dépendantes. Cette approche est avantageuse car elle combine la manipulation génétique précise de la capacité de ces cellules à se disperser après la transplantation, ce qui permet une plus grande résolution spécifique de type cellulaire in vivo.

Introduction

GABAergiques interneurones corticaux comprennent ~ 20-30% de neurones dans le néocortex des mammifères, tandis que le reste correspond aux neurones excitateurs principaux glutamatergiques. Interneurones sont très diverses dans les propriétés électrophysiologiques, axone et la morphologie des dendrites et synaptique ciblage 1, et les déséquilibres dans le ton excitateur / inhibitrice sont émis l'hypothèse à la base des phénotypes de troubles neuropsychiatriques / neurologiques, y compris l'autisme, la schizophrénie et l'épilepsie 2. L'objectif global du protocole décrit ici est de fournir un moyen de modifier efficacement génétiquement GABAergiques progéniteurs des interneurones corticaux avant la transplantation in vivo analyses.

Interneurones corticaux GABAergiques sont nés dans les éminences ganglionnaires médial et caudal (MGE et CGE, respectivement) 3,4 ainsi que l'aire préoptique 5. Progéniteurs des interneurones corticaux subissent longue distance la migration tangentielle suiviepar la migration radiale pour atteindre leurs objectifs finaux. À l'arrivée à leur destination, ces interneurones corticaux doivent intégrer correctement dans le réseau neuronal existant, et chaque sous-groupe de interneurone uniques contribueront à circuit cortical de manière spécifique. Quatre sous-groupes principaux peuvent être distingués par marqueurs moléculaires: la somatostatine MGE dérivés (SST) + et parvalbumine (PV) + sous-groupes, et le peptide dérivé CGE-intestinal vasoactif (VIP) + et + Reelin; SST - 6 sous-groupes. Différents sous-groupes des interneurones corticaux sont nés au cours des moments différents au cours du développement embryonnaire dans la CGE et MGE 7, 8. Ceux-ci et d'autres marqueurs corticales d'interneurones GABAergiques ont été utilisées pour générer des lignées Cre-pilote spécifique pour bon nombre de ces sous-groupes 9-11.

La transplantation de progéniteurs de MGE a émergé comme une thérapie à base de cellules potentiel pour traiter les troubles qui peuvent être causés par des déséquilibresdans l'excitation / inhibition 12-24. Ces avantages thérapeutiques peuvent être dues en partie à la capacité unique de progéniteurs de MGE (pour disperser, de se différencier et de se intégrer dans un cerveau de l'hôte), ou potentiellement parce que beaucoup de péri-somatiques PV inhibitrice + cellules sont dérivées de la MGE. MGE cellules peuvent également être rapidement et efficacement transduction avec lentivirus avant la transplantation 15, permettant aux cellules qui sont génétiquement modifiées in vitro pour être étudiées in vivo. La justification de l'élaboration de cette approche était de surmonter les obstacles à l'étude GABAergique développement des interneurones corticaux et la maturation. En particulier, MGE transplantation a permis aux chercheurs d'étudier le développement de cellules mutantes in vivo, lorsque la souris mutante aurait autrement mort à un point de contrôle d'avance. En outre, par l'introduction de gènes d'intérêt avant la transplantation, les effets de gènes spécifiques d'un phénotype mutant ont pu être évalués dans un effmanière isant.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la transduction de cellules MGE avec lentivirus avant la transplantation. En outre, nous montrons comment cette technique peut être adaptée pour exprimer un gène d'intérêt dans les sous-groupes des interneurones spécifiques dans un groupe hétérogène de précurseurs des interneurones corticaux, en utilisant une combinaison de lentivirus d'expression Cre-dépendantes et des lignées de souris Cre-pilote disponibles. En outre, ce protocole introduit des techniques et une plateforme pour les chercheurs à modifier génétiquement des interneurones GABAergiques précurseurs corticale pour les études in vivo d'une manière unique. Un avantage de cette technique par rapport à d'autres approches actuelles est que les cellules transplantées MGE se disperser à distance du site d'injection. Aussi, contrairement à injections virales focaux, après que les cellules de MGE dispersent leur morphologie est plus facile à évaluer. Cette approche peut être utilisée pour étudier l'effet de l'introduction de gènes d'intérêt dans le type sauvage ou cellules mutantes, l'introduction d'un type de cellule spécifiquereporter pour évaluer la morphologie, ou potentiellement pour étudier l'effet d'allèles pathologiques in vivo.

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Protocole

Déclaration éthique: Les procédures suivantes ont été approuvées par notre protocole de l'institution et animale. Assurez-vous d'obtenir l'approbation pour toutes les procédures impliquant des chirurgies de survie avant de commencer les expériences et de vérifier tous les protocoles sont à jour.

1. Préparation lentivirus (étape optionnelle)

  1. Fractionner trois plaques de 10 cm de cellules HEK293T pour chaque lentivirus à faire, en présence de 10 ml de DMEM / FBS à 10%, et de croître à ~ 60-70% de confluence. Cultiver les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  2. Transfecter les plasmides suivants d'ADN (10 pg au total) dans chaque plaque en utilisant ne importe quel réactif de transfection: 6,4 ug CAG-Flex-GFP vecteur lentiviral (séquence de vecteur d'ADN fournis dans le tableau 1), 1,2 ug pMD2.G (encode VSV-g), 1,2 pg pRSV-Rev, et 1,2 ug pMDLg / pRRE. Les trois vecteurs lentiviraux d'emballage sont disponibles dans le commerce (tableau
    Remarque: Cette approche particulière utilise 3e génération lentivirvecteurs al mais vecteurs de 2ème génération et plasmides associés fonctionnera également.
  3. Préparer un conteneur de déchets contenant une solution d'eau de Javel à 10% dans un BSL2 certifié hotte pour inactiver des solutions ou des dispositifs qui ont communiqué ou qui contiennent des lentivirus. Ensuite, supprimer complètement les médias 4-6 heures après transfection dans la solution d'eau de Javel, le remplacer par le même volume de nouveaux médias, et permettent aux cellules de se développer.
  4. Après quatre jours, recueillir des médias dans 50 ml tubes et centrifuger coniques à 1 000 g pendant 15 min à agglomérer toute débris cellulaires. Ensuite, filtrer le surnageant à travers une membrane de 0,45 um. Tout filtre liaison faible en protéines, comme le PVDF, fonctionne bien. Attention: place à la fois des déchets solides et liquides virale dans la solution d'eau de Javel.
  5. Charge 30 ml filtrés surnageant dans des tubes ultracentrifugation et dans une ultracentrifugation. Centrifuger à 100 000 x g pendant 2,5 heures à 4 ° C. Ouvrez les tubes à centrifuger dans une hotte de BSL2 et retirez surnageant dans 10% Bleach. Ajouter ~ 100 pi de PBS à la pellet, ce qui donne des titres de 1x10 ^ infectieux 8.7 unités / ml. Aliquoter la journée et magasin suivant à -80 ºC. Des aliquotes de lentivirus sont stables à -80 ° C pendant au moins six mois.
  6. Considération importante: de nombreuses institutions ont désormais cores viraux. Acquérir virus concentré avec un titre minimum de 1x10 7 infectieuses unités / ml, pour des résultats optimaux.

2. souris donneuses pour MGE Dissection

  1. Tout d'abord, mettre en place un accouplement chronométré entre une ligne exprimant Cre d'intérêt et d'un type sauvage (WT) ou une souris qui exprimera un journaliste après recombinaison Cre-médiation.
    Remarque: De nombreuses lignes Cre-pilote sont transgéniques et sont maintenus et élevés dans l'état hémizygote. Ainsi, seule la moitié des embryons contient le transgène Cre. L'ADN peut être rapidement préparé à partir des embryons pour une courte PCR pour détecter l'allèle Cre. Les Cre + embryons peuvent ensuite être récoltées de sorte que seul le tissu MGE du génotype désiré est utilisé. AlternatiVely, un journaliste Cre dépendant peut être utilisé, pour sélectionner les embryons pour MGE dissection et la transplantation.
  2. Calculer jours qui correspondra à E13.5. Si les animaux ont été jumelés la veille, le jour de la fiche est de 0,5. Ordre souris chronométré enceintes ou une femelle WT avec chiots P1 pour le temps ayant postnatal (P) une souris sur le jour où le tissu du donneur sera E13.5. Sinon, mettre en place ces accouplements dans la maison une semaine avant appariement des animaux donneurs.
    Remarque: La première stratégie de générer à la fois et E13.5 embryons P1 / chiots pour le même jour est souvent difficile de faire de manière fiable.

3. Préparation des médias, outils et équipements.

  1. Préparer les réactifs et des outils pour la préparation de cellules MGE (tableau 2).
    1. Préparer une surface propre et placez pinces propres, des ciseaux et un couteau soit microchirurgicale ou une pince fine (pour la dissection des tissus précise) sur la surface.
    2. Préparer la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS), fou dissection, et le milieu de Eagle modifié de Dulbecco de (DMEM) avec 10% surem bovin fœtal (FBS), par transduction.
    3. Préincuber 20-30 ml de DMEM / 10% de FBS dans une culture tissulaire C incubateur à 37 ° C pendant environ 1 heure. Le couvercle doit être desserré pour permettre l'échange de gaz et pH équilibration des médias.
      Remarque: Le pré-incubation des médias peut être préparé juste avant de commencer la dissection.

4. Préparation des cellules MGE

  1. Sacrifiez la souris enceinte selon un protocole animale approuvé et enlever les embryons dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant glacée HBSS.
  2. Retirer le cerveau de chaque embryon en utilisant un microscope à dissection (faire un à la fois, en laissant le reste des embryons dans glacée HBSS), puis passez à découper le tissu MGE.
    Remarque: détaillée ci-dessous, et à la figure 1, sont des étapes clés montrant comment retirer le MGE. En outre, la figure 2 est un film montrant l'ensemble de la dissectionprocédure.
    1. Positionner le cerveau avec le côté ventral vers le haut (figures 1A, A '). Remarque: il est également normal d'avoir la face dorsale vers le haut. Couper le cerveau en deux le long du plan sagittal pour générer deux pièces. Un exemple hemisected cerveau est représenté (figures 1B, B '), notez que dorsale (le cortex sus-jacente) et ventrale du couvercle du cerveau et entourer le tissu éminence ganglionnaire (GE).
    2. Ensuite, avec une main dominante, détenir soit des pinces très fines ou un stabknife (tableau 2), tandis que l'hémisphère immobiliser avec des pinces détenues par une main non-dominante. (Face interne de l'hémisphère doit être orientée vers le haut). Dépliez la dorsale et ventrale tissus avec une pince et un coup de couteau à révéler le tissu sous-jacente GE (figure 1C et schématisé à la figure 1C).
      Remarque: la suppression des médias de dissection le plat de Pétri, il peut être plus facile à stabiliser le tissu tout en performing la dissection MGE.
    3. Faire des coupes droites avec le stabknife ou pinces fines pour séparer la CGE, LGE et les tissus du septum (voir l'exemple des réductions indiquées par les pointillés rouges, les figures 1D et D '). Ces coupes peuvent être faites dans ne importe quel ordre.
      Remarque: Imaginez le MGE comme une «boîte» qui est coupé sur le tissu environnant. Cela contribue à rendre reproductible réductions similaires pour chaque dissection, réduisant ainsi la variabilité dans les dissections de tissus.
    4. Enfin, tourner la MGE sur le côté et couper le bas (ce qui était l'aspect latéral du cerveau). Cela supprime la zone du manteau de la MGE (jeter dans les figures 1E et 1E ') du reste de la MGE. Le dernier élément de MGE zone contient principalement ventriculaire et des parties de la zone sous-ventriculaire MGE, qui contient la quasi totalité des cellules progénitrices MGE. Procéder à ce tissu.
  3. Considération importante: L'addition de gel de silicone sur le fond d'une boîte de Pétri can servir une excellente surface de dissection, car il protège les conseils délicates de pince et fournit une surface douce pour les tissus épinglant avec une pince.

4,3 stratégies supplémentaires pour MGE dissection.

  1. Couper la peau de l'embryon en utilisant des pinces comme des ciseaux pour enlever rapidement le cerveau. Comme l'embryon fixe sur le côté, maintenir le tissu à la base de la tête avec les pinces utilisées pour ancrer le tissu. Premièrement, couper antérieure ventrale du cerveau et postérieure ventrale au cerveau, puis connectez les deux coupes le long du côté de l'embryon. Ensuite, prenez le lambeau de peau et tirez sur la partie supérieure du cerveau. Le cerveau peut alors être rapidement disséquée à partir du tissu restant.
  2. En variante, l'ancre de la face postérieure de l'ensemble du cerveau du cortex. Pendant ce temps, saisir chaque hémisphère à l'aspect le plus caudale dorsale du cortex et déchirer le cortex loin du tissu ancré dans une direction antérieure. De cette manière, les deux cOrtices peuvent être retirés et les éminences ganglionnaires bilatérales sont révélés, encore attaché au reste du tissu préserver l'anatomie médio-latérale.
  3. Passer au coup-couteau pour faire des coupes précises autour de la MGE sur chaque hémisphère. Utilisez soit un ensemble propre distincte de forceps pour recueillir le MGE ou d'une pipette avec une grande pointe (ie., P1000).
    Remarque: Gardez le tissu prélevé loin de tout autre matériel disséqué, comme certains médias est inévitablement transféré lorsque le MGE est recueilli.
  4. Recueillir le MGE et mettre le tissu dans un tube de 1,5 ml de collecte contenant DMEM / 10% de FBS, (un volume de 500 ul est suffisante pour recueillir les MGES). Répétez l'opération pour l'autre hémisphère et le lieu dans le même tube de collecte. Garder les échantillons sur la glace jusqu'à ce que tous les tissus sont recueillis.

5. étiquetage Lentiviral et la transplantation

  1. Déplacer les tubes de tissu MGE dans un BSL2 certifié capot et retirez le support.
    Note:Tissus MGE est assez grand pour être visible à l'œil et se déposent au fond du tube permettant pour les médias froids pour être retiré facilement et en douceur.
  2. Ajouter ~ 500 ul de milieu DMEM / FBS 10%, qui a été pré-incubés dans une culture incubateur à 37 ° C de tissu. Ensuite, ajouter le polybrène à faciliter la transduction de chaque tube à une concentration finale de 8 pg / ml. Triturer le tissu MGE pour créer une suspension de cellule unique, en utilisant une pointe de pipette P1000. Enfin, ajouter ~ 15-20 ul de concentré lentivirus à chaque tube.
  3. Considération importante: Une trituration de 10-12 fois est suffisante pour briser le tissu MGE à partir d'un seul embryon, mais plus triturations peut être nécessaire si plusieurs MGES sont regroupées. Essayez différentes conditions de trituration pour déterminer ce qui fonctionne le mieux.
  4. Fermez soigneusement chaque tube, mélanger par inversion, que son lieu tous les tubes dans un incubateur à 37 ° C. Incuber les cellules à lentivirus pendant au moins 30 minutes et jusqu'à une heure. Des temps plus longs ont entraîné dela viabilité des cellules froissé. Inverser les tubes toutes les 10 min jusqu'à ce que le temps est écoulé.
  5. Après incubation avec lentivirus, enlever les tubes de l'incubateur et centrifuger à ~ 700 g pendant 3 min pour sédimenter les cellules. Dans la hotte de BSL2, éliminer le surnageant et jeter dans l'eau de Javel à 10%. Ensuite, ajouter 1 ml de DMEM / FBS à 10% et on triture le culot 2-3 fois pour laver, puis centrifuger de nouveau à la même vitesse pour sédimenter les cellules. Répétez cette étape de lavage 2-3 plusieurs fois pour éliminer le virus excès.
    Remarque: Effectuer les étapes de centrifugation à 4 ° C, cependant, la viabilité réduite n'a pas été observé lorsque les tours courts sont effectués à température ambiante.
  6. Après le lavage final, éliminer autant que possible les médias et de mettre chaque tube sur la glace. En raison de médias résiduelle sur les parois du tube, 3.2 ~ ul de milieu finira recouvrant le culot cellulaire au moment de la procédure de transplantation a commencé.

6. transplantation et validation

  1. Acquérir accueil chiots de P1 et de préparer la procédurezone par pulvérisation vers le bas avec 70% d'éthanol. Pour maintenir la stérilité au cours de la procédure, il est recommandé d'effectuer ces procédures dans une salle dédiée de la procédure de nettoyage. En outre, utilisent soit des outils chirurgicaux autoclaves stérilisent surfaces que les chiots seront en contact avec l'utilisation de 70% d'éthanol. Un exemple d'équipements représentatifs nécessaire pour effectuer les transplantations et une aire de procédure représentatif est montré à la figure 3.

Remarque: Si cette procédure est une injection de petits volumes, et non une procédure chirurgicale qui exigerait une incision, d'une plaie ouverte ou sutures, il est toujours recommandé qu'une nouvelle micropipette est utilisé pour chaque souris à injecter. Les micropipettes sont stérilisés à la chaleur lorsqu'elle est tirée et biseautée sur une surface qui a été pulvérisé avec de l'éthanol 70% étant stockée dans un récipient fermé.

  1. Générer micropipettes à avoir un diamètre à la pointe entre 40 à 80 um. Suite à ces dimensions sera un rendement optimalrésultats. Chaleur stériliser les micropipettes lorsqu'il est tiré et biseautée sur une surface et pulvériser avec 70% d'éthanol avant de stocker les micropipettes dans un récipient hermétique.
    Remarque: vous pouvez, si l'accès aux appareils nécessaires pour créer ces aiguilles (tableau 2) est de limiter, utiliser tout autre dispositif d'injection. Toutefois, ceux-ci peuvent ne pas être aussi bien placés que les micropipettes en raison de différents diamètres.
  2. Dresser huile minérale dans une seringue de 1 ml, et avec une aiguille 30 G 1/2, remplir la pipette en verre complètement avec de l'huile minérale. Ensuite, montez le piston sur le dispositif stéréotaxique, puis fixez la pipette en verre à l'appareil de stéréotaxie et la charge sur le piston. Utilisation de l'unité hydraulique, déplacer le piston à mi-chemin dans la pipette en verre, enlever l'huile minérale qui se déverse avec un chiffon propre une serviette en papier propre.
    1. En variante à l'aide d'une seringue, immerger l'extrémité arrière de la pipette dans l'huile minérale et rempli par action capillaire. Pour éviter que des bulles d'air dans le pipette, de maintenir une pression positive sur la seringue jusqu'à complètement hors de la pipette en verre.
      Note: D'autres dispositifs peuvent être utilisés pour transplanter avec succès des cellules de MGE 14. Tout dispositif qui peut fournir un volume inférieur ou proche de 100 œuvres nl ainsi pour cette procédure.
  3. Ensuite, utilisez une serviette en papier stérile, ou toute matière absorbante, avec le coin tordu en une pointe fine pour enlever délicatement les supports en excès au-dessus du culot cellulaire MGE. Cette étape se concentre la densité de cellules de sorte que les volumes d'injection plus petits peuvent être obtenus. Ensuite, utilisez un volume faible (P2 est préférable) pipette de tirer lentement le culot cellulaire et triturer 1-2 fois avant de passer la suspension cellulaire sur une surface hydrophobe. Le volume devrait être un peu moins de 1 pl. Déplacez la pointe de l'aiguille dans la suspension de cellules et en utilisant la commande hydraulique, dresser la suspension cellulaire dans la pipette.
  4. Anesthésier un chiot de P1 par l'hypothermie (envelopper dans un gant de latex et de mettre sur la glace pendant ~ 2-4 min).Vérifier l'efficacité de l'anesthésie avec un stimulus nociceptif. Pincer la peau entre les orteils avec des pinces fines: le chiot doit être répondre si pincé. Ensuite, placez le chiot sur un moule qui est sous le dispositif d'injection, puis tendre la peau en tirant la peau sur la tête et la fixer avec la bande de laboratoire standard.
    Remarque: Bien que l'hypothermie est très efficace sur des souris néonatales et les résultats en faible taux de mortalité, des procédures doivent être faits rapidement, que les chiots vont commencer à se redresser en moins de 10 min. En outre, 4 min sur la glace est une limite supérieure de ce qui peut être toléré. Essayez seulement d'induire une hypothermie, une fois si un temps plus long est nécessaire pour les injections. Toutefois, si un chiot récupère début, laissez d'abord le chiot de se rétablir complètement avant de provoquer à nouveau l'hypothermie. En outre, seulement induire une hypothermie une fois de plus pour effectuer des injections. Chiots récupérer dans 5-10 min d'hypothermie. Cela peut être facilité en plaçant les chiots avec la litière et maman ou en plaçant le chiot sur une surfac chaudee pour récupérer.
  5. En utilisant un dispositif stéréotaxique, positionner la pointe de la pipette de verre sur la surface sur la tête du chiot, perpendiculaire à la surface de la tête. Lorsque la pipette est en contact avec la tête, considérer cela comme «0». Ensuite, pousser la pipette à travers la surface de la peau et le crâne dans le cortex, puis insérer et retirer la pipette ~ 2 fois avant de se arrêter. Pour optimiser le ciblage des cellules dans le néocortex, les injections sont effectuées lorsque la micropipette est à une profondeur de 0,1 mm. Toutefois, cela devrait être optimisée par l'utilisateur (voir note ci-dessous).
    Note: Bien que cette profondeur cible de manière fiable les couches plus profondes du néocortex avec les dispositifs décrits ci-dessus, quelques profondeurs devraient être testés déterminées empiriquement. En outre, une gamme de profondeurs position différente rostro-caudale et médio-latérale doit être testé pour déterminer quelle profondeur est optimale à chaque site. En outre, la ponction initiale doit être rapide, que la pénétration lente dans le néocortex diminue la capacité de cleanly pénétrer le tissu. Essayez différentes vitesses lors du premier démarrage de cette procédure pour trouver ce qui fonctionne le mieux. En outre, pour les coordonnées d'essai, il n'y a pas de véritable substitut à l'aide de cellules marquées, comme colorants ne sont pas fiables pour indiquer la position.
  6. Une fois que l'aiguille est en position, faire tourner le dispositif hydraulique pour faire avancer le piston dans la pipette en verre, en poussant un volume déterminé de suspension de cellules dans le cortex. Injecter 50-70 nls par site. Répétez cette procédure à 3-6 sites différents à différents niveaux de rostrales-caudale si l'objectif est d'obtenir une large distribution de cellules dans tout le néocortex.
    Remarque: Les volumes de 100 nl ou plus peuvent provoquer des lésions et conduire à de grosses touffes de cellules injectées qui ne migrer efficacement sur le site d'injection. Ainsi, les volumes d'injection plus petits (~ 70 nl ou moins) sont optimales, sur plusieurs sites, si le temps le permet.
  7. Lorsque les injections sont terminée, retirez le chiot de la scène et marquer (tep écrêtage est un moyen fiable pour identifier le pups plus tard). Une fois que le chiot a récupéré et est capable de se déplacer sur son propre (cela se produit en quelques minutes de les retirer de la scène), le remettre avec la maman et de la litière.
    Remarque: Puisque ce est une procédure minimalement invasive il ne existe aucune procédure post-chirurgicales fois le chiot se déplace librement et réchauffé. Cependant, les chiots doivent être vérifiées non seulement après la procédure, mais aussi le lendemain pour se assurer qu'ils ne présentent aucun signe de détérioration de la santé.
  8. Avant de commencer la procédure sur le prochain chiot, arroser la zone avec 70% d'éthanol pour maintenir une zone de travail stérile. Laissez les petits injectés pour développer et évaluer ensuite le tissu au stade de développement approprié (s).

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Résultats

Comme les cellules de MGE ont la capacité unique de migrer et intégrer lorsqu'elles sont transplantées dans un néocortex hôte 16, ils fournissent un excellent système modèle pour la manipulation génétique avant que des études in vivo. Ici, nous montrons comment on peut isoler les tissus MGE partir d'embryons de E13.5 (figures 1 et 2), qui peut ensuite être transduites avec lentivirus in vitro ou d'une manière rapide avant la transplantation pour les études in...

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Discussion

L'utilisation de précurseurs des interneurones GABAergiques corticale des éminences ganglionnaires embryonnaires (GES) pour les thérapies à base de cellules est prometteuse pour de nombreuses affections 12 -1 4. Techniques moléculaires précises sont nécessaires pour suivre et exprimer des gènes d'intérêt dans les sous-groupes des interneurones spécifiques. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour le marquage des cellules embryonnaires MGE avec lentivirus avant la transplantation et montrons co...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été financé par des subventions à JLRR de: Autism Speaks, Nina Irlande, Weston Havens Fondation, NIMH R01 MH081880 et NIMH R37 MH049428. PRW a été soutenue par une bourse de la National Science Council de Taiwan. SFS a été soutenu par F32 (MH103003).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactifs et matériel pour la transplantation de cellules MGE
Seringue de 1 mlREF 309602BD, Becton Dickinson et compagnie
30 1/2 Gaiguille 305106BD, Becton Dickinson et compagnie
Alésage de précision pour livrer 5 µ ; l (livré avec piston)5-000-1005Drummond scientific company
ParafilmPM-999Polysciences, Inc.
Stéréomicroscope avec perche **MZ6Leica
Digital juste pour souris instrument stéréotaxique **51725DStoelting company
Micromanipulateur fin hydraulique à huile mono-axe **MO-10Narishige
Biseauteurfabriqué en interne
Extracteur de pipette à aiguille730Kopf instruments
HuileToute droguerie ou pharmacie
Toute pipette et embouts pouvant être fiables mesure 1 & micro ; l de volume
** Ce sont les modèles particuliers que nous utilisons, mais de nombreuses autres configurations devraient fonctionner
Réactifs optionnels (pour la fabrication de lentivirus)
25 mm, 0.45 µ ; Filtre m09-719BFisher Scientific
Tubes à centrifuger ultra-clairs (25 x 89 mm)344058Beckman Coulter® ;
Lipofectamine 2000 (format 1,5 ml)11668019Invitrogen
Autres fournitures disponibles dans le commerce
pMDLg/pRRE plasmide codant pour gag/pol12251Addgene
pRSV-Rev codant pour le plasmide Rev12253Addgene
pMD2.G plasmide codant pour VSVG12259Addgene
pAAV-Flex-GFP28304Addgene
rotatif diamanté minérale

Références

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