Le séquençage de prochaine génération pour la détection des Actionable mutations dans les tumeurs solides et liquides

Summary

Ce manuscrit décrit les protocoles cliniques de deux panels de séquençage de nouvelle génération. Un panel interroge les tumeurs malignes hématologiques tandis que l’autre panel cible les gènes couramment mutés dans les tumeurs solides. La classification moléculaire des mutations motrices dans les tumeurs malignes humaines offre des informations pronostiques et prédictives précieuses.

Abstract

Au fur et à mesure que notre compréhension des mutations conductrices nécessaires à l’initiation et à la progression des cancers s’améliore, nous obtenons des informations essentielles sur la façon dont des profils moléculaires spécifiques d’une tumeur peuvent prédire la réponse aux agents thérapeutiques ou fournir des connaissances sur le pronostic. Dans notre établissement, un programme de génotypage tumoral a été mis en place dans le cadre des soins cliniques de routine, dépistant à la fois les tumeurs hématologiques et solides pour un large spectre de mutations à l’aide de deux panels de séquençage de nouvelle génération (NGS) : un panel personnalisé de 33 tumeurs malignes hématologiques génétiques à utiliser avec le sang périphérique et la moelle osseuse, et un panel de tumeurs solides produit commercialement pour une utilisation avec des tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine qui cible 47 gènes couramment mutés dans le cancer. Notre flux de travail comprend un examen de la biopsie par un pathologiste pour s’assurer qu’il y a une quantité adéquate de tumeur pour le test, suivi d’une extraction personnalisée de l’ADN sur l’échantillon. Le contrôle de la qualité de l’échantillon comprend des étapes pour la quantité, la qualité et l’intégrité et ce n’est qu’une fois que l’ADN extrait a passé ces paramètres qu’une bibliothèque d’amplicons est générée et séquencée. Les données résultantes sont analysées par le biais d’un pipeline bio-informatique interne et les variantes sont examinées et interprétées pour déterminer leur pathogénicité. Nous vous donnons ici un aperçu de l’utilité de chaque panel à l’aide de deux cas cliniques afin de donner un aperçu de la façon dont un flux de travail NGS bien conçu peut contribuer à optimiser les résultats cliniques.

Introduction

séquençage de nouvelle génération (NGS) de spécimens cliniques en oncologie est devenu plus largement disponibles au cours des dernières années, de plus en plus de points de la littérature scientifique sur l'importance d'identifier les changements génétiques ciblés et des marqueurs moléculaires prédictifs / pronostiques. Analyse panel multi-génique et des études complètes de séquençage de l' exome dans les deux épithéliales ^1,2 et hématologique ³ tumeurs malignes ont solidifié le concept d'hétérogénéité de la tumeur et l' évolution clonale que la maladie progresse et les rechutes. En outre, contrairement aux technologies concurrentes , telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou par séquençage Sanger, NGS peut détecter la plupart des altérations génomiques dans tous les gènes du cancer cliniquement pertinents dans un seul dosage ^4.

Le Centre de diagnostic personnalisés initialement lancé avec deux panneaux cliniques de NGS, une mesure Panel hématologique (Heme-NGS Panel) et un hors-the-shelf Cancer Panel pour les échantillons FFPE (Solid-NGS Panel) (voir

Figure 1:. Liste des gènes couverts dans les panneaux de préparation Library est effectuée en utilisant soit la coutume Panel hématologique (Panel Heme-NGS) de 33 gènes ou off-the-shelf amplicon Cancer Panel (Solid-NGS) de 47 gènes. Pas tous les gènes ou exons sont couverts dans leur intégralité, car certains amplicons ne peuvent couvrir certains points chauds. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. </ A>

Le contenu du Panel Heme-NGS a été dérivée à partir de plusieurs sources, mais se concentre autour de 16 gènes mutés dans la leucémie myéloïde aiguë (LMA) précédemment décrit comme démontrant un haut niveau d'utilité clinique ^5. Le Solid-NGS Panel est produit commercialement avec les régions ciblées basées sur les gènes couramment mutés dans le cancer tel que rapporté dans le catalogue de Somatic mutations dans le cancer base de données (COSMIC) ^6.

Plusieurs étapes clés caractérisent le flux de travail global pour NGS cliniques. Après le clinicien ordonne le test, un pathologiste détermine l'adéquation de l'échantillon suivant l'analyse du pourcentage de la tumeur et le volume de l'échantillon. Dans notre institution, nous avons besoin d'au moins 10% la tumeur en raison du taux de séquençage de l'arrière-plan d'erreur ( «bruit») de la technologie et l'efficacité de l'approche ciblée. Si le tissu est suffisant pour les essais, l'ADN génomique est extrait. Cet ADN est ensuite soumis à un contrôle de qualité multiples (QC) étapes. Si l'ADN passe QC, une bibliothèque d'amplicon est généré et séquencé. Les données obtenues sont analysées par un pipeline interne bioinformatique. Suite à l'analyse de la bioinformatique, les variantes sont examinées manuellement et interprétées pour pathogénicité avant l'incorporation dans un rapport clinique. Ci-dessous, nous décrivons deux cas qui sont passés par ce flux de travail rigoureux et ont finalement abouti à des changements dans la gestion clinique.

Cas 1 - leucémie myéloïde aiguë

Une biopsie de la moelle osseuse d'un patient A était de diagnostic pour AML, sans maturation. Les études cytogénétiques ont été envoyés sur l'échantillon de moelle osseuse et ont démontré un caryotype féminin normal. Il y avait 95% de blastes circulants présents, donc un échantillon de sang périphérique a été envoyé pour les tests de diagnostic personnalisé sur le panneau Heme-NGS.

la leucémie myéloïde aiguë (LMA) est une hémopathie maligne de la lignée myéloïde des globules blancs. la détectiondes mutations du gène dans AML est devenu de plus en plus important pour le pronostic et le traitement, avec des mutations génétiques récurrentes reconnues comme important dans la pathogenèse et le pronostic ^7. Des mutations dans CEBPA NPM1 et ont été associés à un risque de pronostic favorable, tout en interne duplications en tandem (ITD) dans FLT3 ont été associées à une issue moins favorable ^8. Un nombre croissant de preuves soutient un rôle pathogène de ces et d' autres mutations dans AML ^9.

Cas 2 - Lung adénocarcinome

Une biopsie d'une masse sus-claviculaire gauche d'un patient B a montré un adénocarcinome pulmonaire. matériel de biopsie de la paraffine (FFPE) masse ganglionnaire fixés au formol a été envoyé pour les tests génomiques (Panel Solid-NGS) en rouleaux / boucles avec plus de 50% la tumeur, afin de déterminer si une mutation était présente pour une intervention thérapeutique ciblée.

Lung cancer est la principale cause de mortalité liée au cancer aux Etats-Unis et est divisé en types principaux, non-petit cancer du poumon à deux cellules (NSCLC) et le cancer du poumon à petites cellules (SCLC). NSCLC peut encore être définie comme étant soit un adénocarcinome ou un carcinome à cellules squameuses, basé sur l'histologie de la lésion. Lung adénocarcinome est le sous - type le plus commun de cancer du poumon, vu chez les fumeurs et les non-fumeurs, et est la forme la plus courante de cancer du poumon chez les non-fumeurs ^10. Des études moléculaires de adénocarcinomes pulmonaires ont identifié une mutation dans plusieurs oncogènes ^11. Les mutations du pilote les plus communs identifiés chez les fumeurs sont des mutations dans KRAS et BRAF. Les mutations les plus fréquentes chez les non-fumeurs sont des mutations EGFR et réarrangements impliquant les gènes ALK, RET et ROS1. Des tumeurs pulmonaires ont été décrits avec un exon 20 insertion dans le cadre de l'ERBB2 gène (HER2 / neu). L'anomalie la plus fréquente chez les HER2 / neu est une amplification de ce locus dans le cancer du sein pour lesquels une thérapie ciblée est disponible (trastuzumab: un anticorps monoclonal humanisé dirigé contre HER2 / neu). HER2 / neu exon 20 d' insertion qui est observé chez 2 - 4% du poumon adenocarcimomas ¹² a montré une réponse partielle à la thérapie de combinaison avec HER2 / neu et des inhibiteurs de mTOR (temsirolimus nératinib et, respectivement) ^13.

Protocol

Ce protocole comprend les étapes saillantes de deux essais en laboratoire développé validées pour le profilage génomique des tumeurs solides et liquides, respectivement. Les tests effectués dans le laboratoire se fait en conformité avec les exigences des cliniques Modifications de l'amélioration des laboratoires (CLIA) de 1988.

1. Extraction de l'ADN à partir du sang périphérique ou de moelle osseuse

1. Déterminer la quantité de sang ou de moelle osseuse à prendre basé sur le tableau 1.

Sample / WBC	Montant à être traité comme 1 ml de sang
Moelle osseuse	250 ul
WBC Blood 12,000 - 50,000	1 ml
WBC Blood 50,000 - 100,000	500 ul
WBC Blood 100 000 - 200 000	200 ul
WBC Blood> 200000	100 ul
* For Blood WBC <12.000, prendre 2 ml de sang

Tableau 1:. Sang / Bone Marrow Volume pour utiliser Graphique Depuis le sang numération des globules blancs varie d' un échantillon à l'autre , il est difficile de spécifier un volume spécifique de sang à utiliser. Par conséquent, la quantité de sang à utiliser pour le dosage doit être déterminée en examinant le nombre de globules blancs du sang (WBC) avant de commencer l'essai. Bien que moins de sang est utilisé, il devrait encore être traitée comme si ses 1 ml depuis le volume de sang utilisé est réduite parce que le nombre de cellules présentes est supérieure à la normale.

2. Suivre le protocole du kit disponible dans le commerce pour isoler l'ADN génomique.

2. Extraction de l'ADN de paraffine (FFPE) tissus fixés au formol

1. Basé surrégion de la tumeur le pathologiste encerclé sur la diapositive H & E, aligner les lames non colorées avec le guide H & E diapositive et définir une zone similaire pour l'extraction. Pour macro-dissection, processus qu'un seul spécimen / l'ensemble des patients de diapositives à la fois.
2. Chauffer les lames sur un bloc C de chaleur de 45 ° pour faire fondre légèrement la paraffine. racler délicatement le tissu dans les lignes qui sont marquées sur la diapositive, en utilisant un nouveau scalpel pour chaque échantillon à extraire. Placez les raclures de cire dans le tube de 1,5 ml étiquetés de manière appropriée. Soyez prudent parce que la cire est très éraflé électrostatique et peut sauter hors du tube.
3. Ajouter 320 pi de déparaffinage Solution pour tous les cinq à six 5 um sections (25 - 30 um au total). Par exemple, si un tube contenant 3 sections de 10 um rouleau / boucle va être traitée, puis utiliser 320 pi, mais si 5 sections à la même épaisseur ont été obtenus alors utiliser 640 pi.
4. Vortexer vigoureusement pendant au moins 10 secondes et d'effectuer aqrotation uick dans une microcentrifugeuse pour éliminer le tissu / la cire sur les côtés et capuchon et dans la solution. Incuber à 56 ° C pendant 3 min, puis on incube à la température ambiante pendant 5 -. 10 min.
5. Après l'incubation température ambiante, ajouter 180 ul de tampon ATL pour chaque 320 pi de solution a été ajoutée déparaffinage. Émincer le tissu dix fois l'aide d'un mini-pilon stérile en utilisant un nouveau pilon pour chaque échantillon. Assurez-vous qu'il n'y a pas de tissu collé à pilon, car il peut être très collant. Vortex la suspension vigoureusement pendant 3 secondes, puis centrifuger à vitesse maximale pendant 1 min.
6. Ajouter 10 pl de Proteinase K à la phase claire inférieure. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas pour assurer le tissu est remis en suspension. NE PAS vortex. Incuber à 56 ° C pendant une nuit sous agitation à 400-500 tours par minute.
7. Le lendemain matin, vérifier si le tissu est complètement dissous (ce qui a eu lieu si la solution inférieure est clair). Si la solution inférieure est pas claire, puis vortex vigoureusement pendant 3 secondes et centrifuger à vitesse maximale for 1 min. Ajoutez un 5 supplémentaire - 10 pl de Proteinase K et incuber à 56 ° C pendant encore 30 - 60 min.
8. Incuber à 90 ° C pendant 1 heure pour aider à inverser le formaldehyde réticulation. Laisser les échantillons refroidir à la température ambiante pendant 5 à 10 min, puis centrifuger brièvement chaque tube pour consolider le liquide.
9. Transférer la phase claire inférieure dans un tube de 1,5 ml étiqueté. Si plusieurs tubes du même échantillon de patient (comme le cas si plusieurs rouleaux sont utilisés), recombiner les phases inférieures dans un tube à ce point. Remarque: Le transfert de petites quantités de la solution Déparaffinage ne devrait pas interférer avec la procédure de purification, mais il y a un risque si une grande quantité est transférée.
10. Ajouter 2 pl de RNase A solution. Vortex doucement ou inverser 25 fois et tour rapide dans une microcentrifugeuse. Incubation à température ambiante pendant 5 min.
11. Ajouter 200 pi de solution de protéines de précipitation. Si faire un ou deux rouleaux, utiliser 200 pi. Si vous le faites à trois rouleauxs à la fois, puis utiliser 400 pi. Vortex vigoureusement à grande vitesse pendant 30 secondes pour mélanger uniformément les tampons de lyse. Incuber sur la glace pendant 5 min ou les échantillons peuvent rester sur la glace jusqu'à une heure.
12. Centrifuger à 5000 xg pendant 5 min. La protéine précipitée doit former, une pastille blanche serrée. Verser le surnageant dans un tube de 1,5 ml marqué, et ensuite incuber les échantillons sur de la glace pendant au moins 3 min. Centrifuger à 5000 xg pendant 3 min.
13. Ajouter 200 pi de 2-propanol (alcool isopropylique) pour 180 ul de tampon ATL ajoutés précédemment à un tube de 1,5 ml marqué (il peut être nécessaire d'utiliser un tube de 2 ml). Par exemple, si trois rouleaux faisant ajouter 600 ul d'isopropanol. Ajouter 1 pl de glycogène pour chaque 180 pi de tampon ATL ajouté précédemment à l'isopropanol et inverser le tube plusieurs fois pour mélanger.
14. ajouter délicatement le surnageant de l'étape Protein de précipitation dans le mélange Isopropanol. Mélanger le tube en retournant doucement au moins 50 fois.
15. Centrifugeuse à un maximum speed pendant 3 min. L'ADN sera visible en tant que petite pastille blanche au fond du tube.
16. Verser ou aspirer le surnageant dans le tube de récupération approprié. Gardez un tube de 1,5 ml de déchets séparés pour chaque échantillon dans le cas où le culot vient délogé de sorte qu'il ne sera pas perdu ou mélangé avec les déchets d'autres spécimens. Égoutter le tube sur une serviette en papier et assurez la majorité de la Isopropanol est supprimée.
17. Ajouter 300 ul de fraîchement préparé 70% d'éthanol. Inversez doucement le tube plusieurs fois pour laver le culot. Essayez de vous assurer le culot vient délogé pour assurer un nettoyage plus approfondi.
18. Centrifugeuse à vitesse maximale pendant 5 min. puis retirez soigneusement l'éthanol. Le culot peut être lâche, donc verser ou aspirez lentement et regarder le culot. Éliminer l'excès d'éthanol à partir de l'intérieur du tube, sans toucher à la pastille. Laisser les échantillons sécher à l'air pendant 5 - 15 min, en prenant soin de ne pas trop sécher l'échantillon.
19. Ajouter entre 25-100 ul d'Hydratation Solution ADN pour ehaque échantillon en fonction de la taille du culot d'ADN et de la quantité de départ de tissu. Vortex les tubes vigoureusement et rapidement tourner dans une microcentrifugeuse. Incuber pendant 1 heure à 65 ° C pour réhydrater complètement l'ADN.

3. Contrôle de la qualité de l'ADN génomique

Remarque: Il y a trois étapes indépendantes pour le contrôle de la qualité de l'ADN (QC). Voir le tableau 2 pour plus d' explications sur la raison pour laquelle chaque étape de QC est effectuée.

Instrument	Résultat	Indication	Plage idéale
DropSense96	A260 / A230	Identification des contaminants chimiques (par exemple, l' éthanol)	1,50 à 2,2
DropSense96	A260 / A280	Identification des contaminants protéiques	1,60 à 2,2
DropSense96	La concentration	quantification de l'ADN	> 1 ng / ul
TapeStation	ADN Smear	Détermination de l' intégrité de l' ADN (par exemple, la dégradation / fragmentation de l' ADN extrait)	50%> 1000 pb
Qubit 2.0	La concentration	Plus précise la quantification de l'ADN	> 1 ng / ul

Tableau 2:. ADN QC Résultats attendus Toutes ces valeurs sont prises en compte avant d' exécuter un échantillon permettant de procéder à la phase de préparation de la bibliothèque.

1. En suivant le protocole du fabricant, l'essai 2 ul de l'ADN extrait sur un fluoromètre pour obtenir la concentration de travail (ng / ul) de l'échantillon.
2. Exécutez 1 - 2 pi de chaque échantillon sur un spectrophotomètre UV / VIS pour vérifier la qualité de l'échantillon (A260 / A230 et A260 / A280 ratios) selon les instructions du fabricant.
3. Pour les échantillons FFPE: A la suite des instructions du fabricant, exécutez 1 pl de chaque échantillon sur un système d'électrophorèse sur gel microfluidique pour évaluer la dégradation / fragmentation de l'ADN. Voir la Figure 2 pour les exemples.

Figure 2:. L' ADN génomique QC Gel Exemple La ligne verte sur les bandes inférieures est d'indiquer le marqueur inférieur. La ligne rouge ajoutée en est d'indiquer environ 1000 pb. Lane A2 représente l' ADN intact, comme on pouvait s'y attendre de la part sue tis frais (par exemple, du sang périphérique ou de moelle osseuse). Lanes B1, C1, D1, B2, C2, E2 sont des exemples de bonne ADN FFPE, intact. L'ADN dans la voie F2 semble être intact, mais à une concentration trop faible. L'ADN dans la voie G2 est dégradé ou fragmenté et ne fonctionnera pas dans le dosage. Lanes E1, F1, G1, H1, D2,H2 représentent l' ADN qui tombe dans la «zone grise» qui signifie que le test pourrait bien fonctionner, mais une partie de l'ADN pourrait être trop endommagé ou réticulé et donc il ne fonctionnera pas bien dans le test. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

4. Bibliothèque amplicon Préparation

1. Hybridation de Oligo Pool and Extension-Ligation des oligos Bound
   1. Dans la salle de pré-PCR, ajouter le volume nécessaire de Low EDTA TE, 5 pi de Oligo Tube du Groupe spécial (par exemple, Solid-NGS Panel ou Heme-NGS Panel), et 100-250 ng d'ADN génomique à chaque correspondant bien une 96 bien-plaque de semi-jupe étiqueté comme le (HYB) plaque hybridation.
   2. Ajouter 40 ul d'Oligo Hybridation pour le séquençage de réactif 1 (OHS1) pour chaque échantillon dans la plaque HYB. pipette doucement vers le haut et vers le bas au moins 5 - 6 fois pour mélanger. Modifier conseils après chaque colonne pour éviterla contamination croisée.
   3. Sceller la plaque HYB avec une feuille d'aluminium adhésive et centrifuger à 1000 g pendant 30 sec.
   4. Incuber la plaque HYB dans l'incubateur d'hybridation préchauffé à 95 ° C pendant 1 min. Régler la température de l'incubateur d'hybridation à 40 ° C. Continuer à faire incuber aussi longtemps qu'il faut diminuer l'incubateur à 95 ° C à 40 ° C (~ 90 min). Remarque: Ce refroidissement progressif est essentiel pour une hybridation correcte.
   5. Pendant les 15 dernières - 20 min de l'incubation d'hybridation, pré-laver l'unité filtre à plaques (FPU). Préparer seulement les puits pour être utilisés dans l'essai en cours, à savoir, utiliser uniquement des puits frais / inutilisés d'une plaque de filtre précédemment ouvert, mais jamais réutiliser les puits qui ont été utilisés. Note: Ceci doit être clair sur la base du kit Nombre sur la plaque de filtre, les marquages ​​sur la plaque de filtre, et le mastic utilisé à travers la plaque.
      1. En utilisant une pipette à canaux multiples, ajouter 45 pl de lavage stringent 1 (SW1) à chaque puits.
         
      2. Si le liquide résiduel existe, tourner la FPU 180 ° et répétez l'étape de centrifugation à nouveau pendant 3 minutes supplémentaires. Si le liquide résiduel tourne à travers la deuxième fois, puis passez à l'étape suivante, sinon il peut y avoir un défaut dans la plaque de filtre et la plaque actuelle devra être remplacé.
   6. Une fois que l'incubateur d'hybridation a refroidi à 40 ° C, de centrifuger la plaque à 1000 x g pendant au moins 30 secondes à 20 ° C pour recueillir la condensation. Transférer la totalité du volume de chaque échantillon de la plaque HYB sur le centre du puits prélavés correspondants de la FPU. Modifier conseils après chaque colonne pour éviter la contamination croisée. Couvrir le FPU et centrifuger à 2250 xg pendant 3 min à 20 ° C.
   7. Ajouter 45 ul de SW1 et centrifuger à 2250 xg pendant 3 min à 20 ° C. Répétez l'opération pour un total de deux lavages. Tournez la FPU 180 ° et centrifuger à nouveau à 2.250 xg pendant 3 min pour éliminer complètement tous les SW1.
   8. Désassembler le FPU. Jeter toutes les actions accréditives (contenant du formamide) dans le conteneur à déchets approprié. Remontez le FPU en utilisant une autre plaque MIDI Collection des déchets. Ajouter 45 pi de tampon universel 1 (UB1) pour chaque échantillon et centrifuger à 2250 xg pendant 3 min à 20 ° C. ATTENTION: formamide Contient.
   9. Ajouter 45 ul d'extension Ligation Mix 3 (ELM3) pour chaque échantillon sur la plaque de FPU et la pipette de haut en bas 3 fois pour mélanger. Remarque: La réaction d'extension-ligature a lieu sur la membrane de la plaque filtrante.
   10. Sceller la plaque FPU avec une feuille d'aluminium adhésif et incuber l'ensemble de FPU ensemble dans un pré-chauffé à 37 ° C incubateur pendant 45 min.
2. Indexation et Amplification PCR
   1. Aliquote les indices utilisés pour les puits correspondants dans le Répertorié Amplification Plate (IAP) en disposant les amorces dans le Fixture Indice de plaque, disposées de la manière suivante: tubes d'amorces i5 (bonnets blancs, solution limpide) verticalement, alignés avec des rangées A à H, tubes d'amorces i7 (les bouchons orange, solution jaune) horizontalement , aligné avec les colonnes 1 à 12. Utilisation d'un multi-canal pipette p10, ajouter 4 pi d'amorces i7 (solution jaune) à chaque rangée du PEI et ajouter 4 pi d'amorces i5 (solution limpide) pour chaque colonne du PEI.
   2. Sur la glace ou un bloc de refroidissement, préparer le PCR Master Mix en ajoutant 0,5 pi de l'ADN Polymerase 1 (PCSRA1) à 25 pl de PCR Master Mix 2 (PMM2) par échantillon. Inverser, rapidement vortex et centrifuger brièvement le PCR Master Mix pour mélanger.
   3. Ajouter 22 ul de la PCR Master Mix à chaque puits de l'IAP et la pipette de haut en bas 3 fois pour mélanger. Changer conseils entre les puits. Gardez l'IAP à 4 ° C.
   4. Après 45 min Extension-Ligation réaction (étape 4.1.10), retirer la FPU de l'incubateur et retirez soigneusement le aluminum opercule en aluminium. Couvrir avec le couvercle et centrifuger à 2250 xg pendant 3 min à 20 ° C.
   5. Ajouter 25 pi de NaOH 50 mM à chaque puits d'échantillon sur la FPU. Pipeter haut et en bas au moins 6 fois; assurer que les pointes de pipette entrer en contact avec la membrane. Modifier conseils après chaque colonne. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
   6. échantillons de transfert élues de la FPU au PEI comme suit:
      1. En utilisant une pipette multi-canal p100 réglé sur 20 pi, pipetter le NaOH sur la plaque de FPU monter et descendre au moins 6 fois. Inclinez légèrement la plaque de FPU pour assurer l'aspiration complète de la plaque.
      2. Transférer 20 ul de la FPU à la colonne correspondante de l'IAP. pipeter doucement vers le haut et vers le bas au moins 6 fois pour bien mélanger l'ADN avec le PCR Master Mix. Sceller le PEI avec un film adhésif et centrifuger à 1000 g pendant 1 min à 20 ° C.
   7. Apportez la plaque PCR dans la chambre post-PCR et charger la plaque sur un cycleur thermique. Exécutez le p PCRROGRAM consistant en une étape de chauffage à 95 ° C pendant 3 min dénaturant; suivie par 25 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 62 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 60 secondes; suivie d'une extension finale de 72 ° C pendant 5 min; finition avec un maintien à 10 ° C. Si ne pas procéder à l'étape suivante après l'achèvement de la PCR, la plaque peut rester sur le cycleur thermique pendant la nuit, ou il peut être stocké entre 2 et 8 ° C jusqu'à deux jours.
3. Purification PCR et Normalization Bead-Based
   1. Retirer les perles de purification magnétiques, Elution Buffer (EBT), et réactifs gel électrophorèse à partir de la 4 ° C réfrigérateur et lieu à température ambiante au moins 20 minutes avant l'étape suivante.
   2. Une fois que la PCR est terminée, centrifuger à 1000 g pendant 1 min à 20 ° C pour recueillir la condensation. Transfert 1 pl de chaque réaction PCR à dépouillent tubes / puits de plaques contenant 4 ul d'eau pour diluer les échantillons 1/5. Pipeter haut et en bas pour mélanger.
   3. Ajouter 2 ul de laéchantillons dilués PCRed à 2 pi de tampon microfluidique-gel. Sceller les bandes / plaque. Agiter à 1800 rpm pendant au moins 30 secondes et centrifuger à 1000 xg pendant 30 sec. Après le protocole du fabricant, exécutez le mélange sur un gel microfluidique pour évaluer si la préparation de la bibliothèque a abouti à une bibliothèque acceptable (voir Figure 3).
   4. Vortex les perles de purification magnétiques jusqu'à ce qu'ils soient bien suspendus et la couleur apparaît homogène. Ajouter 45 ul des billes à chaque échantillon.
   5. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent et agiter la plaque à 1800 rpm pendant 2 min. Incuber à température ambiante, sans agitation pendant 10 min.
   6. Placer la plaque sur un support magnétique. Une fois que le surnageant a autorisé, soigneusement retirer et jeter le surnageant. Si toutes les billes sont aspirés par inadvertance dans les conseils, distribuer les perles de retour à la plaque et laisser la plaque d'appui sur l'aimant pendant 2 minutes et confirmer que le surnageant a été compensé.
   7. Avec la plaque sur til support magnétique, ajouter 200 pi de fraîchement préparé 80% d'éthanol pour chaque échantillon. Déplacer la plaque avant et en arrière à quelques reprises. Incuber la plaque sur le support magnétique pendant 30 sec. Retirez délicatement et jeter le surnageant. Répétez l'opération pour un total de deux lavages.
   8. Retirer l'excès d'éthanol par centrifugation brièvement la plaque à 1000 xg pour faire baisser toute l'éthanol sur les côtés du tube, en plaçant la plaque arrière sur le support magnétique, et à l'aide d'une pipette p10 multi-canal réglé sur 10 pi pour éliminer l'éthanol. Autoriser les perles à l'air libre pendant 5-8 min.
   9. En utilisant une pipette à canaux multiples p100, ajouter 30 ul de BAI à chaque puits. Pipeter haut et en bas quelques fois pour assurer les perles viennent sur le côté du tube. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent et agiter la plaque à 1800 rpm pendant 2 min.
   10. Incuber à température ambiante sans agitation pendant 3 min. S'il y a des échantillons dans lesquels les perles ne sont pas complètement remises en suspension, pipette doucement monter et descendre pour remettre en suspension les perles.
   11. Placer la plaque sur un support magnétique. En utilisant une pipette multi-canaux p100, transférer 20 pi du surnageant à une toute nouvelle plaque appelée plaque Bibliothèque Normalization (TNL). Transférer les 10 pi restants ~ des bibliothèques de séquençage individuelles à une plaque séparée appelée restante Nettoyé-Up Library Plate (RCLP). Conservez cette plaque avec la bibliothèque de préparation finale, car il peut être utilisé comme une réserve pour une deuxième manche de séquençage, le cas échéant. Sinon passer à l'étape suivante, la LNP et RCLP peuvent être stockés à -15 à -25 ° C.
   12. Vigoureusement vortex et resuspendre la Bibliothèque Normalization Perles 1 (LNB1). Il est essentiel pour remettre en suspension le culot complètement LNB1 de talon au fond du tube. Préparer la normalisation Mix, en mélangeant 8 pi de LNB1 avec 44 pi de bibliothèque Normalization additifs 1 (LNA1) par échantillon. Vigoureusement vortex le Normalization Mix pour 10 - 20 sec.
       ATTENTION: LNA1 contient formamide.
   13. Avec intermittente inversion unee tourbillonnement du mélange de normalisation, ajouter 45 ul de chaque échantillon de la TNL. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent et agiter la plaque à 1800 rpm pendant 30 min. Cette incubation de 30 minutes est indispensable pour la normalisation de la bibliothèque appropriée en tant que incubations de plus ou moins 30 minutes peuvent influer sur la représentation bibliothèque et la densité de la grappe.
   14. Pendant les 30 minutes d'incubation, préparer les réactifs pour le séquençage par décongélation de la cartouche de réactif et le tampon Hyb (en HT1) [MISE EN GARDE: Les deux contiennent du formamide]. En outre, obtenir de la glace pour une étape ultérieure et d'assurer un bloc thermique approprié pour tubes de 1,5 ml de centrifugeuse est réglé à 96 ° C.
   15. Lorsque l'étape de mélange de 30 min est terminée, placez le TNL sur un support magnétique. Une fois que le surnageant a autorisé, utiliser une pipette multi-canal pour enlever soigneusement et jeter le surnageant dans le conteneur de déchets.
   16. Retirez la LNP du support magnétique et laver les billes avec Bibliothèque Normalization Wash 1 (LNW1) comme suit:
       1. Ajouter 45pi de LNW1 à chaque échantillon.
          ATTENTION: formamide Contient. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent et agiter la plaque à 1800 rpm pendant 5 min. Répétez l'opération pour un total de deux lavages. Assurez-vous de supprimer tous les LNW1 après le second lavage.
   17. Retirer la LNP du support magnétique et, à l'aide d'une pipette multicanaux, ajouter 30 pl de NaOH 0,1 N (moins d'une semaine) dans chaque puits pour éluer l'échantillon. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent et agiter la plaque à 1800 rpm pendant 5 min.
   18. Au cours de la 5 min élution, ajouter 30 pi de tampon de stockage Bibliothèque Normalization 1 (LNS1) à chaque puits pour être utilisé dans une nouvelle plaque nommée la plaque de stockage (SGP).
   19. Placez le TNL sur le support magnétique. Une fois que le surnageant a autorisé, transférer l'élution de 30 ul du LNS1 dans le PSC. Changer des conseils entre les échantillons afin d'éviter la contamination croisée.
   20. Sceller la plaque avec un film adhésif et centrifuger à 1000 g pendant au moins 30 secondes.
   21. Ajouter 51, l de chaque échantillon à sequencer à un Pooled amplicon marqué bibliothèque (PAL) du tube de 1,5 ml. Vortex PAL pour mélanger et brièvement centrifuger dans une microcentrifugeuse.
   22. En fonction de ce que la chimie de séquençage utilisée (V2 ou V3), ajouter 4 - 10 pi de PAL à 590 - 596 ul de HT1. En général, ajouter 5,8 pi de PAL à 595 pi de HT1 pour la chimie de V2 et 8,5 pi de PAL à 592 pi de HT1 pour la chimie V3. Nommez ce tube comme l'amplicon Library (DAL) Tube dilué.
   23. Vortex du DAL et brièvement centrifuger dans une microcentrifugeuse. Incuber la DAL à 96 ° C pendant 2 min. Inverser le tube DAL 3 fois et mettre le DAL sur la glace pendant au moins 5 min, tout en préparant le séquenceur pour le séquençage. Après les 5 minutes, le DAL est prêt à être chargé.
   24. Si vous avez terminé avec le PSC, sceller la plaque avec un film de feuille adhésive en aluminium et l'étiqueter avec la date et la plaque d'identité. Stocker le SGP scellé et PAL à -15 à -25 ° C.

Figure 3:. Library Prep QC Gel Exemple La ligne verte sur les bandes inférieures est d'indiquer le marqueur inférieur et la ligne violette sur les bandes supérieures est d'indiquer le marqueur supérieur. Tout a bien fonctionné pour les voies H1, A2, B2, C2, E2, et G2. La bibliothèque de préparation ne fonctionnait pas de manière optimale, pour les voies D2, F2 et H2, mais les résultats seront encore obtenus ils pourraient ne pas avoir une couverture adéquate. Pour A3, la bibliothèque prep marchait à peine et très probablement cet échantillon d'ADN n'a pas été suffisante pour le dosage. Les bandes inférieures au-dessus du marqueur inférieur sont les amorces non utilisées, parce que la partie aliquote est prélevée directement du PCRed bien. L'échantillon NTC ne devrait avoir la bande d'apprêt utilisé, et rien d' autre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

5. séquençage

1. Assurer une SampleSheet.csv correcte a été faite pour la course. Voir Figure 1 supplémentaire pour un exemple.
2. Rincer et sécher la cellule d'écoulement et ajouter 600 ul de la DAL à la cartouche de réactif décongelé.
3. Préparer le séquenceur pour le séquençage en suivant les instructions à l'écran.

Analyse 6. Données

1. Exécutez le pipeline bioinformatique. Utiliser le pipeline bioinformatique en interne, conçu sur mesure pour identifier des mutations, des insertions, délétions et amplifications ^18.
2. Après le pipeline terminé, vérifiez les fichiers journaux d'erreurs / avertissement, comme toute aide significative erreurs / avertissements dans le QC du traitement de pipeline.
3. Analyser les statistiques d'exécution (tableau 3) pour assurer la bibliothèque séquencée a passé le laboratoire déterminé QC métriques (Figure 4). Examiner manuellement chaque variante en consultant les fichiers .bam dans un visualiseur de données génomiques (par exemple, la génomique intégrative Viaiguière ¹⁶ (IGV)).
   NOTE: Seules les variantes dans la gamme allèle-fréquence validé et au-dessus de la profondeur minimum de couverture après le filtrage de la qualité sont rapportés (en utilisant (poids lourds) la nomenclature de Human Genome Variation Society). Pour le rapport final, chaque variante exonique a été classé en: pathogène, probablement une maladie associée, variante de signification inconnue (VUS), probablement bénigne, et bénigne. Toutes les variantes ci-dessus les critères de déclaration de 5% la fréquence des allèles, à l'exception de ces variantes bénignes réputés et des changements synonymes, ont été signalés.

Figure 4. Présentation des étapes de contrôle de la qualité pour NGS. Contrôle de la qualité de chaque étape du processus est nécessaire pour assurer le séquençage donnera des résultats tels que les paramètres pré et post séquençage sont considérés. le traitement de l'échantillon approprié est essentiel pour l'ADN de haute qualité. sang etla moelle osseuse dans des fixateurs inappropriés peut produire l'ADN de faible qualité. Fixation inappropriée des échantillons de tumeurs solides peut dégrader l' ADN (par exemple, la fixation dans B5). la qualité de l'ADN devrait être évaluée pour les protéines et la contamination de l'ARN par spectrophotométrie et évalué avec précision le montant et l'intégrité de l'ADN. Les mesures de séquençage doivent être déterminées de manière empirique dans le laboratoire de mise en séquence et ensuite pour chaque réaction de séquençage et chaque échantillon. Avant la présentation des résultats de séquençage pour chaque échantillon doit être évalué pour la couverture, la profondeur et la performance adéquate des contrôles positifs et négatifs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Results

Cas 1 - Heme-NGS Panel

L'ADN extrait du sang périphérique leucémique était de qualité suffisante et de la quantité (176 ng / ul) pour le Groupe Heme-NGS. La profondeur moyenne globale de la couverture était 4,933x (dessus de la profondeur moyenne minimale de la couverture des 1,000x). Statistiques d'exécution supplémentaires sont dans le tableau 3. Sur les 8 régions ci - dessous la couverture de 250x, 3 étaient dus à une mauvaise parage des amorces (ie, la séquence d'amorce n'a pas été correctement supprimé en raison d'erreurs de séquençage), 1 était un artefact connu de l'essai, et les 4 autres étaient des zones partielles d'exons de gènes différents sans variantes isolables. Bien que notre protocole clinique ne comprend les variantes couvertes par au moins 250 lectures de rapports, toutes les données avec au moins 100 lectures sont importées dans la base de données pour examen.

Traitement des données from pipeline bioinformatique détecté trois, des mutations associées à des maladies à déclaration obligatoire; une mutation faux - sens dans FLT3, une mutation faux - sens dans IDH2, et une mutation par décalage de cadre dans NPM1. Les variantes exons avec leurs fréquences d'allèles sont décrits dans le tableau 4. Une mutation commune dans FLT3 est le FLT3 -interne duplication en tandem (ITD) , qui est pas automatiquement appelé par notre pipeline et exige une inspection visuelle de l' exon 14. Contrôle visuel de l' exon 14 de FLT3 n'a montré aucune insertion ou duplication dans l'échantillon soumis. Le FLT3 I836del était à 1% la fréquence des allèles et n'a pas été inclus dans le rapport final , car il est tombé en dessous de la fréquence de l' allèle minimum validé de 5%. Cette mutation est pas sur la même molécule d'ADN que le changement FLT3 de D835Y (ie, observé dans la même région de amplicon, mais pas en «cis» dans l' un de séquençage lit) et il n'a été observé par un examen manuel de la fi .bamles lors de la vérification du changement de p.D835Y. Les fréquences des allèles inférieures des deux mutations FLT3 suggère que ces mutations peuvent représenter l' hétérogénéité et / ou l' évolution clonale; cependant, la différence pourrait être due à la performance du test pour ce amplicon ou d'un polymorphisme d'un seul nucléotide (SNP) à proximité ou chevauchant la séquence d'amorce qui a affecté l'amplification de cet allèle.

Les résultats du Panel Heme-NGS pour le cas 1 avec AML identifié des mutations dans FLT3, IDH2 et NPM1, trois gènes couramment mutés dans AML. Des mutations FLT3 sont observées dans environ 25% des patients adultes atteints de LAM (base de données COSMIC ¹⁷⁾ et sont soit duplications en tandem interne (DTI) ou des mutations faux-sens dans le domaine tyrosine kinase. Les FLT3-ITD sont la mutation plus commune et sont associés à une mauvaise réponse à la chimiothérapie standard, alors que la signification pronostique de la kinase FLT3 dmutations ponctuelles omain, comme on le voit chez ce patient AML, a un impact clair sur le pronostic ^14. Isocitrate déshydrogénase 2 (NADP +), mitochondriale (IDH2) est un gène qui code pour un agent de modification épigénétique qui est couramment muté dans la LMA. Des mutations dans les modificateurs épigénétiques sont relativement fréquentes dans les LAM, avec des mutations dans IDH1 et Dnmt3a représentant d' autres mutations dans cette classe de gènes qui conduisent à une dysrégulation du gène. Des mutations dans le gène de la nucléophosmine (NPM1) sont l' une des mutations acquises les plus courantes en matière de LBC et sont généralement considérés comme un facteur de bon pronostic (en l'absence d'un FLT3 - ITD).

Co-mutations du NPM1 et IDH2 ont été décrits dans la littérature comme un indicateur pronostique favorable ^5, avec une survie globale de 89% de 3 ans. Cela représente un avantage significatif de survie par rapport à la survie globale à 3 ans detype sauvage NPM1 et IDH2 de 31%. Par exemple, la norme des pratiques de soins comprend l' analyse de mutation NPM 1 et mutations FLT3-ITD. Dans ce scénario, la détection de seulement une mutation NPM1 échouerait à appropriée des patients stratifier pour le risque, comme les mutations secondaires peuvent être favorables (par exemple, IDH2) ou défavorable (par exemple, TET2), ce qui réduit la confiance pour soulager une greffe de moelle osseuse.

Cas 2 - Solid-NGS Panel

ADN extrait à partir du tissu FFPE était de qualité et en quantité suffisante pour que le solide NGS panneau, avec une concentration de 252 ng / pl et seulement 4% de l'ADN au-dessous de 1000 paires de bases (pb). Après l'analyse des données de la profondeur moyenne de la couverture a été 9167 lectures (bien au-dessus de notre profondeur seuil minimum de 1000 lectures) sans régions inférieures à 250 profondeur de lecture. métriques QC supplémentaires sont shown dans le tableau 3.

Les données traitées par le pipeline bioinformatique détecté deux mutations associées à la maladie: une insertion dans le cadre de l'exon 20 de ERBB2 (Her2 / neu) et une mutation faux - sens dans TP53. Toutes les variantes exons avec leurs fréquences d'allèles sont représentés dans le tableau 5. L'insertion dans ERBB2 représente en fait un tandem dupliqué (Her2 / neu) séquence, comme indiqué dans la nomenclature. Identification et confirmation de l'examen manuel en cadre insertion nécessaire du séquençage lit par IGV. La détection de la fréquence des mutations de plus de 50%, comme on le voit pour les deux TP53 et Her2 / mutations neu suggère une perte d'hétérozygotie (LOH) événement (voir la discussion).

Les résultats Solid-END Panel pour Case 2 avec des mutations adénocarcinome pulmonaire détectés in ERBB2 (HER2 / neu) et TP53, deux gènes pas couramment testés pour dans le cadre de la norme-of-care actuelle pour les patients atteints de cancer du poumon. HER2 / neu code pour un récepteur tyrosine kinase similaire à un autre gène couramment muté dans le cancer du poumon, EGFR . L' activation de HER2 / neu exon 20 insertions sont observées dans 2-4% des adénocarcinomes du poumon, représentent la majorité des HER2 mutations / neu observées dans le cancer du poumon, et sont généralement vus dans les tumeurs sans mutations dans d' autres gènes du pilote , tels que l' EGFR et ALK ¹² . Il existe plusieurs sources de données montrant le potentiel des différentes options de traitement pour les patients atteints d'activation insertions HER2 / neu, y compris une réponse partielle à la thérapie de combinaison avec HER2 / neu et inhibiteurs de mTOR ¹³ et le contrôle des maladies importantes avec l'anticorps monoclonal trastuzumab en association avec la chimiothérapie ^15. La découverte d' un changement de TP53 est pas uncoMmon dans le cancer, mais à ce moment il n'y a pas de thérapies action.

	Cas 1	cas 2
Démarrage Nombre de lectures	2215926	2129110
Pourcentage de lectures Mapping	98.42%	98.29%
Pourcentage de lectures sur la cible	99.01%	97.29%
Pourcentage de lectures sur la cible Après Filter	97,60%	95.45%
Pourcentage de Utilisable Lit	94,87%	91.79%
Pourcentage des bases ci - dessus Couverture 250x	98.40%	100%
Un pourcentage de basesLa couverture de bove	95.90%	99,70%
La couverture ci - dessous 250x - Nombre amplicon	8	0

Tableau 3:. Séquençage Run QC Metrics Ceci est un résumé des statistiques les plus importantes d'exécution, non compris la couverture moyenne, qui sont utilisés pour l' examen des données pour déterminer si un échantillon bibliothèque de préparation a passé QC. L'ensemble du processus est réussie si tous les pourcentages sont supérieurs à 90%, mais il est possible, avec report de SW1 ou UB1 dans l'étape FPU de lavage ou diaphonie primaire, d'avoir plus faible »pourcentage sur la cible» dans la gamme de 80 - 90%. Si le «pourcentage mappée» est trop faible, cela indiquerait une contamination par des bactéries ou d'un autre ADN, comme tous les échantillons doivent être alignés à l'homme. Lorsque l'une de ces spécifications sont en dessous de 80%, l'échantillon est marqué pour un examen plus approfondi afin de déterminer comment procéder et améliorer le processus.

Tableau 4:.. Cas 1 Résultats Détecté pathogènes, les maladies associées, des variantes de signification inconnue (VUS) et des variants exons probablement bénignes au- dessus des critères de déclaration de 5% la fréquence des allèles sont répertoriés S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5:.. Cas 2 Résultats Détecté pathogène, maladie associée, variante de signification inconnue (VUS) et les variantes exons probablement bénignes au- dessus des critères de déclaration de 5% la fréquence des allèles sont énumérés S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure supplémentaire 1: Un exemple d'un SampleSheet.csv basé amplicon. Cette feuille transmet au séquenceur ce que la chimie de fonctionner (dans ce cas amplicon), ce flux de travail (par exemple, GenerateFastq), ce que l' application et de dosage (par exemple, FastqOnly), combien de bases (ou lit) à séquence (dans ce cas 186 pb x 186 pb), et enfin que les échantillons sont associés à certains indices (dans ce cas la double indexation). Les parties qui sont mis en évidence en jaune peuvent être modifiées à tout ce que l'expérimentateur veut, mais dans ce cas , le laboratoire utilise ces paramètres. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Discussion

Comme les deux tests de NGS décrits dans ce manuscrit sont offerts en clinique, l'examen pratique la plus importante est le contrôle de la qualité. Plus précisément, un examen attentif doit être accordée à la qualité et la quantité d'ADN extrait. Ceci est particulièrement important pour les échantillons FFPE qui sont souvent fortement dégradée, avec un rendement d'ADN variable. Une méthode de précipitation d'isopropanol a été développé afin de maximiser le rendement de l'ADN à partir d'échantillons FFPE ont été trouvés comme des méthodes basées sur des colonnes à conduire parfois à l'ADN de cisaillement avec des volumes d'élution limitée. Par conséquent, la plupart du temps quand un échantillon donne une concentration trop basse ou trop dégradées pour l'essai, il est très probablement due à la taille des tissus, le type ou la fixation et non au processus d'extraction. Pour les échantillons de sang / de la moelle osseuse, s'il y a une panne d'extraction, il est généralement due à un échantillon étant hemodilute (ie, ne pas avoir suffisamment de globules blancs ou tumorales dans ce tirage) ou chimio ablation.

. Nt "> Lors de la validation, les seuils d'acceptabilité de la qualité de l'ADN et de la quantité devrait être établie L'entrée recommandée de 100-250 ng est souvent utilisé dans l'essai, mais si la qualité de l'ADN est bon, alors les montants d'entrée inférieurs peuvent réussir. En outre, si la qualité de l' ADN est pauvre (ie, la quantité d'ADN amplifiable est inférieur à 100-250 ng) , puis des montants plus élevés d'entrée peuvent améliorer la qualité des résultats de séquençage (puisque la quantité d'ADN amplifiable atteindra l'entrée recommandée) . Données pour la qualité de l' ADN et la quantité doit être appliqué à chaque échantillon avant d' avancer l'ADN dans la préparation bibliothèque. Ces échantillons dans une «zone grise» (voir la figure 2) doit être exécuté à la discrétion du directeur du laboratoire ou la personne désignée. Actuellement , le meilleur façon de prédire si l'ADN ne fonctionnera pas bien pendant le séquençage consiste à effectuer un test à base de qPCR qui permet la quantification et évaluation de la qualité de l'ADN d'entrée. Cette approche porte sur la bioavailabilité de fragments de tailles différentes dans l'échantillon, grâce à l'amplification de fragments de tailles différentes (par exemple, 100 pb, 150 pb, 200 pb et 300 pb) et la comparaison du rendement.

Actuellement, la préparation bibliothèque implique un grand nombre d'étapes manuelles où un faux pas à l'une de plusieurs moments peut causer la bibliothèque soit échouer ou d'être de mauvaise qualité. L'analyse de gel microfluidique est le seul QC étape pour vérifier un problème de bibliothèque de préparation avant le séquençage. Par conséquent, il y a plusieurs étapes critiques où l'attention supplémentaire peut augmenter la probabilité d'une réaction réussie. Il est impératif de garantir l'échantillon correct et la piscine d'oligonucléotides sont utilisés pour chaque échantillon. Assurer et correctement l'enregistrement que chaque échantillon contient une des 96 combinaisons uniques de paires d'amorces à double indexées PCR réduit les risques pour un échantillon mix up. En outre, il est important de veiller à la plaque de filtre (FPU) draine correctement; si elle ne vidange pas correctement, cela peut provoquer l'extel'étape nsion ligature de la préparation de la bibliothèque pour effectuer des sous-optimale et conduisent à des données de mauvaise qualité de séquençage. Après que la bibliothèque cr, il est essentiel de veiller à ce que les perles de LNB1 sont entièrement remis en suspension et que la solution LNB1 / LNA1 est bien mélangé avant de l'ajouter aux échantillons comme étant la concentration de ce mélange permet de déterminer la molarité de la bibliothèque. Enfin, si l'étape consistant à bourrelet d'élution conduit à une quantité sous-optimale de la bibliothèque en éluant au large des billes, il diminue la densité de regroupement et éventuellement provoquer la bibliothèque de ne pas obtenir une couverture moyenne adéquate. A l'inverse, un excès de bibliothèque conduira à moins bonne qualité lit. Par conséquent, il est important d'être cohérent à l'étape de normalisation sur la base de bourrelet pour assurer la mise en commun optimale et le regroupement des bibliothèques du séquenceur.

En plus de la préparation de bibliothèque, il est essentiel de valider un pipeline de bioinformatique qui produira précises appels des, fichiers bruts de multiplexé fastq mutation. Le choix d'unsolution sur mesure peut prendre du temps car il y a beaucoup open source et disponibles dans le commerce, les appelants aligners variantes, et des progiciels NGS que l'on pourrait avoir à passer au crible. algorithmes personnalisés devront être conçus pour extraire les statistiques de performance essentiels, d'identifier des mutations récurrentes uniques qui échappaient des outils sources les plus ouvertes, et déterminer le statut du nombre de copies sur chacun des loci. Pendant le processus de validation d'un pipeline de bio - informatique, il est important de déterminer les seuils à déclaration obligatoire pour les variantes qui répondent ou dépassent à la fois une profondeur minimum de couverture après affinement de la qualité (par exemple, un minimum de 250 lectures) et une fréquence de l' allèle minimum (par exemple, 4 %). Depuis ce un dosage à base de amplicon multiplexé, il est important de déterminer le minimum profondeur moyenne de la couverture (par exemple, 1,000x) que la bibliothèque doit atteindre pour être en mesure d'obtenir l'amplicon moins performant à la profondeur minimum de lectures. En outre, la nature de l'essai multiplexe fait cause hors effets cibles et ces «artefacts» devront être découvert et pleinement Info brute avant le lancement. Une autre limitation importante à l'analyse décrite est nécessaire pour les échantillons contiennent plus de 10% tumeur afin d'obtenir la fréquence allélique minimale validée.

La détection de basse fréquence, 1%, insertions FLT3 est la preuve que l' examen manuel est toujours souhaitable dans ce processus. Même avec une fréquence allélique de coupure de 5%, des mutations importantes peut-être manqué et donc un examen manuel seront essentielles pour déterminer ces variantes. Pour FLT3-ITD, une inspection visuelle de l' exon 14 est réalisée pour tous les patients atteints de LAM à assurer un niveau faible ou grande insertion / duplication ne passe pas inaperçu. En outre, HER2 exon 20 insertions qui sont généralement à côté de la séquence d'amorce, ont besoin d'une intervention manuelle. En dépit d'un pipeline de bioinformatique robuste, certaines variantes pourraient aller négligés qui est juste la nature d'avoir une coupe duroff pour la plupart des statistiques mentionnées ci-dessus. Mieux bioinformatique seraient nécessaires pour aider à atténuer ce problème, de même que la préparation et / ou séquençage des méthodologies mieux bibliothèque, car il est plus avantageux d'avoir des données de bonne qualité à des seuils encore plus bas qui contiennent moins d'artefacts et de faux positifs.

La détection et l'interprétation des fréquences alléliques peuvent être difficiles en raison de la difficulté à déterminer la tumeur en pourcentage et le biais de l'amplification de certaines régions du génome. En outre, la fréquence des allèles plus de 50% peuvent être détectés, comme on l'observe dans le cas 2. Cela est interprété comme une perte d'hétérozygotie (LOH) événement, soit en raison de la perte de l'allèle normal, conduisant à l'augmentation apparente du mutant lit, un le gain de l'allèle mutant (par exemple 2 mutant et une copie normale) ou d' autres mécanismes. Ces mécanismes peuvent être élucidées en utilisant une hybridation génomique comparative matrice (aCGH ¹⁹⁾ et / ou un tableau de génotypage de SNP. ^20.

Les méthodes d'enrichissement cible actuelles reposent sur les procédures d'une journée complète de capture soit hybride inefficace ou des techniques de PCR multiplex qui se traduisent par la nécessité d'une plus grande couverture de séquençage d'un échantillon unique et plus large séquençage cible lit. Des applications supplémentaires pour l' oncologie moléculaire NGS attendus dans un proche avenir comprendront plus facilement les méthodes de préparation des bibliothèques qui peuvent être entièrement automatisable et être en mesure de traiter des échantillons avec de très faibles quantités d'ADN d'entrée (soit moins de 1 ng) ainsi que des échantillons avec très dégradés ADN. Pour relever ces défis, la plupart des méthodes seront vraisemblablement fondées PCR, soit être une approche PCR plusieurs étapes ou une approche PCR singleplex massivement parallèle. En outre, barcoding moléculaire de amplicons individuels a été montré pour réduire considérablement le bruit de séquençage de fond et permettra de tester des échantillons avec des proportions plus faibles de cellules tumorales pour atteindre la fréquence des allèles inférieurs et se déplacer vers la capture circulattion des cellules tumorales.

La détection de mutations associées à la maladie dans des échantillons de cancer a été la norme de soins pour les décennies. Historiquement, les gènes sont souvent testées de façon séquentielle, d'un gène / exon à la fois, avec l'identification d'une mutation conduisant à la fin de la séquence de test. L'avènement de la centrale nucléaire a permis une approche moins biaisée pour le séquençage de gènes multiples associés à de nombreux cancers en parallèle, conduisant à l'identification de mutations multiples qui sont associés à une néoplasie. L'utilité clinique de la centrale nucléaire pour la détection de mutations somatiques dans le cancer se manifeste de plus. En effet, l'analyse des échantillons de tumeurs à base de NGS représente un nouveau paradigme qui remet en question les tests génétiques traditionnel, unique, mais l'utilité clinique est très claire. Les laboratoires cliniques d'aujourd'hui ont la possibilité excitante de se marier attention validation de la méthode et l'interprétation des tests avec l'application de cette technologie puissante.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ScreenTape d’ADN génomique	Technologie Agilent	5067-5365
Réactifs d’ADN génomique	Technologie Agilent	5067-5366
Haute sensibilité D1000 ScreenTape	Technologie Agilent	5067-5584
Haute sensibilité Réactifs D1000	Technologie Agilent	5067-5585
TapeStation 2200	Technologie Agilent	G2965A
Logiciel d’analyse TapeStation	Technologie Agilent	A.01.04 ou supérieur
Supports de stockage de tubes à 96 puits	N’importe quel fournisseur
Rack de tubes 15/50 ml	N’importe quel fournisseur
Rack à plaques à 96 puits	n’importe quel fournisseur
Pipette, monocanal, 0,5&ndash ; 2,5 &mu ; l	n’importe quel fournisseur
, monocanal, 1&ndash ; 10 &mu ; l	tout fournisseur
, monocanal, 2 po 20 &mu ; l	n’importe quel fournisseur
, monocanal, 10&ndash ; 100 &mu ; l	tout fournisseur
, monocanal, 20&ndash ; 200 &mu ; l	tout fournisseur
, monocanal, 100&ndash ; 1 000 &mu ; l	Tout fournisseur Pipette
sérologique	Tout fournisseur
Vortexer	Tout fournisseur
Seau à glace	Tout fournisseur Microcentrifugeuse
(pour tubes et tubes à bandelettes)	Tout fournisseur
Congélateur, -20 ° ; c	Tout fournisseur
4 ° ; C Réfrigérateur	Tout Vendeur Bain
d’eau ou de perles Tout	Vendeur Incubateur
(37 ° ; c)	de tout fournisseur
, 1  ; ml	de n’importe quel fournisseur
, 5  ; ml	N’importe quel fournisseur
Pipettes sérologiques, 10  ; ml	N’importe quel fournisseur
Pipettes sérologiques, 25  ; ml	Tout vendeur
Lames de rasoir/Scaples	Tout fournisseur Tout fournisseur
KimWipes	Tout fournisseur
Tube conique de 15 ml	Tout fournisseur
Tube conique de 50 ml	Tout fournisseur
Serviettes en papier	N’importe quel fournisseur
Éthanol à 200 degrés	Tout fournisseur		Magasin dans une armoire inflammable
2-Propanol (isopropanol)	Tout fournisseur		Magasin dans une armoire inflammable
Réservoirs de 25 ml	Tout fournisseur 10
N NaOH	Tout fournisseur
Pipette, 8 canaux, 1 &ndash ; 10 &mu ; l	Pipette de n’importe quel fournisseur
, 8 canaux, 10 &ndash ; 100 &mu ; l	Pipette n’importe quel fournisseur
, 8 canaux, 20 &ndash ; 300 &mu ; l	n’importe quel seau
	n’importe quel fournisseur
Bouteille d’eau n’importe	quel fournisseur
Bouteille d’eau d’alcool	n’importe quel fournisseur
Papier de nettoyage de lentille	n’importe quelle
, PCR à 96 puits, semi-jupe	n’importe quel fournisseur
Bandes de tube, 8 puits, 0,2 ml	Any Vendor
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881
BioShake IQ ou 3000-T elm	Bulldog Bio/Q.Instruments	1808-0506/ 1808-0517
DropPlate96 S - LabChipDS	Caliper	128876
DropPlate96 D - LabChipDS	Caliper	132848
DropSense96	Caliper (Trinean)
DropQuant	Software Pied à coulisse (trinéen)
Film d’étanchéité de plaque	Denville	B1212-5S
Feuille d’étanchéité en aluminium	Denville	B1212-6S
Système d’eau pure sans nucléase, centrifugeuse	EMD Millipore
5424	centrifugeuse Eppendorf	22621408
5804R	Eppendorf	22623508	Rotateurs de tubes et de plaques de 15 ml, de préférence une centrifugeuse pouvant aller jusqu’à 2 500 x g.
Tube Safe-Lock 1,5 ml,	Eppendorf	22431021
Tube de 5 ml, Tube DNA LoBind	Eppendorf	30108310
5430R Centrifugeuse	Eppendorf	022620645 N’importe	quelle centrifugeuse à rotation de plaques fonctionnera
Incubateur de micro-échantillons Hybex	Fisher Scientific	1057-30-0
Bloc de tube Hybex 0,2 ml	Fisher Scientific	1057-31-0
TruSeq Amplicon &ndash ; Cancer Panel	Illumina	FC-130-1008	96 réactions
TruSeq Custom Amplicon	Illumina	PE-940-1011	96 réactions
TruSeq Custom Amplicon Index Kit	Illumina	FC-130-1003	96 indices, 384 échantillons
MiSeq Reagent Kit v3, 500 cycles	Illumina	MS-102-3003
MiSeq Reagent Kit v2, 300 cycles	Illumina	MS-102-2002
Kit de réactifs MiSeq v2, 500 cycles	Illumina	MS-102-2003
Gestionnaire d’expériences	Illumina	1.3 ou supérieur
MiSeq Reporter	Illumina	2.0 ou supérieur
Visionneuse d’analyse de séquençage Illumina		1.8 ou supérieur
TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit	Illumina	FC-130-1007
MiSeq v2	Illumina	SY-410-1003
TruSeq Custom Amplicon Filter Plate	Illumina	FC-130-1006
Index Adapter Capuchons de rechange	Illumina	11294657
Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Qubit 0,5 ml Tubes	Invitrogen	Q32856
Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit	Invitrogen	Q32853
DynaMa6-96 Support magnétique, jupe latérale	Invitrogen	120.27
GeneAmp PCR System 9700 (bloc or/argent)	Life Technologies	N8050200
Gentra Puregene Blood Kit	Qiagen	158489
Solution de déparaffinisation (16 ml)	Qiagen	19093
Buffer ATL (4 x 50ml)		de 939011
(50 ml)	Qiagen	158910
(100 ml)	158914		Qiagen
(500 ; &mu ; l)	Qiagen	158930
Qiagen Proteinase K	Qiagen	19133
Rnase (5 ml)	Qiagen	158924
Eau sans nucléase (10 x 50 ml)  ;	Qiagen	129114
Pestles	USA Scientific	1415-5390
TipOne RPT 10 µ ; l Pointes de pipette filtrante allongées dans des portoirs stérilisés, 10 portières de 96 pointes (960 pointes).	États-Unis Scientifiques	1180-3810
TipOne RPT 100 µ ; l pointes de pipette filtrantes naturelles biseautées dans des portoirs stérilisés, 10 portières de 96 pointes (960 pointes)	USA Scientific	1180-1840
TipOne RPT 200 &mu ; l Naturel, pointes de pipette filtrantes biseautées dans des portoirs, portières stérilisées, 10 portières de 96 pointes (960 pointes)	USA Scientific	1180-8810
TipOne RPT 20 &mu ; l Pointes de pipette filtrantes naturelles biseautées dans des portoirs, Grilles stérilisées, 10 Grilles de 96 pointes (960 pointes)	USA Scientific	1180-1810
TipOne RPT 1,000 &mu ; l pointes de pipette filtrantes XL naturelles et graduées aux	États-Unis Scientific	1182-1830