Application de la tache verte de méthyle DNA-spécifique dans le Marquage fluorescent d'embryons

Résumé

Une méthode de coloration fluorescente de matériel biologique fixé avec le marquage spécifique de l’ADN vert de méthyle est décrite. Le vert de méthyle est utilisé dans une solution aqueuse diluée et est très résistant au photoblanchiment. Son émission rouge lointain permet d’imager des échantillons en profondeur, ce qui la rend particulièrement adaptée aux embryons entiers.

Résumé

< classe p = 'jove_content'> Le vert de méthyle est connu depuis longtemps comme une coloration histologique avec une affinité spécifique pour l’ADN, bien que ses propriétés fluorescentes soient restées inexplorées jusqu’à récemment. Dans cet article, nous illustrons la méthode de préparation d’une solution mère aqueuse de vert de méthyle qui, une fois diluée, peut être utilisée comme un marqueur nucléaire fluorescent très pratique pour les cellules et les tissus fixés. Des procédures simples pour étiqueter des embryons entiers de poisson-zèbre et de poussin sont détaillées, et des exemples d’images obtenues sont présentés. Le vert de méthyle est excité au maximum par la lumière rouge, à 633 nm, et émet avec un spectre relativement net qui culmine à 677 nm. Il est très peu coûteux, non toxique, très stable en solution et très résistant au photoblanchiment lorsqu’il est lié à l’ADN. Son émission rouge permet une imagerie confocale à balayage haute résolution inaltérée des noyaux dans des échantillons épais. Enfin, ce protocole de coloration au vert de méthyle est compatible avec d’autres procédures de coloration cellulaire, telles que le marquage d’anticorps ou le marquage des filaments d’actine avec de la phalloïdine conjuguée aux fluorophores.

Introduction

La coloration fluorescente de l’ADN est largement et couramment utilisée à la fois dans la recherche biologique et dans le diagnostic clinique, soit pour l’étude détaillée de la structure nucléaire et chromosomique, soit pour la contre-coloration des tissus et des cellules, soit pour l’étude des paramètres du cycle cellulaire¹. Bien que plusieurs colorants d’ADN soient disponibles, les plus largement utilisés ont été ceux excités par la lumière UV et émettant en bleu, qui s’intègrent dans les systèmes à trois filtres habituels utilisés dans la plupart des microscopes à épifluorescence conventionnels lorsqu’ils sont combinés avec des fluorophores émettant du vert et du rouge orangé, tels que des protéines fluorescentes ou de petites molécules attachées aux anticorps. Parmi ces colorants d’ADN émettant du bleu, les plus courants sont le DAPI et les agents de liaison de sillon mineurs de Hoechst^2,3. Néanmoins, l’incorporation d’une grande variété de raies d’émission laser et la détection spectrale dans les microscopes à balayage laser ont permis aux chercheurs de choisir l’utilisation de colorants nucléaires émettant du rouge lointain tels que l’iodure de propidium (PI) ou TO-PRO 3⁴. L’un des avantages de ces colorants est qu’ils surmontent le problème de l’autofluorescence présent dans de nombreuses cellules et tissus, en particulier dans les embryons⁵, mais beaucoup d’entre eux ont des problèmes différents tels que des profils d’émission larges ou une grande sensibilité au photoblanchiment⁶.

Le chercheur suisse Friedrich Miescher a découvert l’ADN en 1869, en l’extrayant des noyaux de globules blancs présents dans le pus. Il l’a appelé nucléine et a montré quelques années plus tard qu’il formait des précipités avec la coloration relativement nouvelle vert de méthyle. Le vert de méthyle est composé de trois cycles d’aniline, avec différents degrés de méthylation, et possède deux charges positives qui lui permettent de se lier fortement au sillon majeur de l’ADN^7,8. La coloration de l’ADN par le vert de méthyle s’est avérée très tôt spécifique, ce qui a conduit à la mise au point par Unna et Pappenheim d’une coloration combinée avec de la pyronine, qui marque spécifiquement l’ARN. Depuis lors, le vert-pyronine de méthyle a été largement utilisé dans les techniques histologiques de routine⁹.

Jusqu’à récemment, on savait très peu de choses sur les propriétés fluorescentes du vert de méthyle. Cependant, nos travaux antérieurs ont révélé certains des avantages spectraux du vert de méthyle⁶, tels que son excitation à 633 nm, un décalage de Stokes pratique, son émission sur la partie proche infrarouge du spectre électromagnétique, une photostabilité supérieure à celle des colorants d’ADN disponibles dans le commerce avec des propriétés spectrales similaires et à un coût très faible. C’est pourquoi nous avons décidé de le tester pour être utilisé comme marqueur fluorescent spécifique de très haute affinité et pour l’ADN sur les tissus embryonnaires et dans les embryons entiers. De plus, jusqu’à présent, la coloration nucléaire au vert de méthyle était réalisée à faible pH, ce qui la rendait difficile à combiner avec la coloration par anticorps. L’objectif de la méthode détaillée ici est de disposer d’un protocole de coloration fluorescente de l’ADN nucléaire qui surmonte l’inconvénient susmentionné en effectuant la procédure de coloration à pH physiologique, ce qui en fait une contre-coloration appropriée pour l’immunomarquage sur des coupes et des tissus entiers.

Protocole

1. La purification du colorant

1. Préparer une solution aqueuse à 4% de vert de méthyle par dissolution de 0,4 g de poudre de colorant dans 10 ml d'eau distillée. Mélanger soigneusement jusqu'à obtention d'dissoudre.
2. Sous un hottes, mélanger avec au moins 2 parties de chloroforme. Il est important de vérifier au préalable si les tubes sont résistants chloroforme.
3. Mélanger soigneusement et centrifuger pendant 1 min à 2000 xg pour accélérer la séparation de phase.
4. Après centrifugation, une phase supérieure aqueuse avec du vert de méthyle et une phase organique inférieure avec du chloroforme et du cristal violet de contaminant sont obtenus d'habitude.
5. Récupérer la phase supérieure et répétez cette étape jusqu'à la phase inférieure apparaît totalement dépourvu de cristal violet.
6. A la fin, la phase supérieure est récupérée et diluée dans de l'eau à une concentration finale de 2% de vert de méthyle. Cette solution stock est stable sur le plan de travail pour les mois et n'a pas besoin d'être protégé de la lumière.

2. Fluorescent nucléaire coloration plénier embryons de poissons zèbres en utilisant vert de méthyle

1. Fixer les embryons pendant une nuit à 4% de formaldehyde (à partir de paraformaldehyde) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   NOTE: Cela peut prendre de quelques heures à la nuit en fonction de l'épaisseur des embryons. Dans l'exemple, nous avons fixé 48 h après la fécondation (HPF) embryons de poisson zèbre nuit.
2. Laver les embryons trois fois dans du PBS-T (1% de Triton X-100 dans du PBS) pendant 5 min. La concentration élevée de détergent perméabilise la cuticule.
3. Préparer une solution à 1: 10.000 de vert de méthyle (à partir de 2% de solution de stock) dans du PBS-T: 5,000-1. La présence d'un détergent au cours de l'incubation est utile pour les échantillons épais, tels que des embryons de poisson zèbre et les larves.
4. Incuber les embryons dans la solution pendant au moins 6 heures à 4 ° C, avec des doux balancement. Encore une fois, l'épaisseur de l'embryon est le paramètre d'étalonnage de la longueur de l'incubation.
5. Laver les embryons 3 times avec du PBS pendant 30 min pour éliminer l'excès de détergent. Méthyl fluorescence verte est seulement évidente quand il est lié à l'ADN, donc fond à partir de la molécule non liée est négligeable.
6. Monter sur une lame de fouilles ou d'une chambre maison avec une solution de montage (75% de glycérol, 0,1 M Tris.HCl pH 8).
   NOTE: Si la coloration nucléaire doit être effectué après immunomarquage, vert de méthyle peut être incorporé à la solution de montage à la concentration de travail, sans avoir besoin de le laver.
7. Conserver au réfrigérateur ou démarrer imagerie immédiatement. Effectuer imagerie avec un confocal à balayage laser (ou autre fluorescence) microscope avec une excitation à 633 nm et de filtres d'émission fixés à inscrire à 650-750 nm en tenant compte que le méthyl émission verte atteint son maximum à 677 nm.
   NOTE: Nous fournissons les données mesurées du profil de méthyle d'émission verte, à être chargées dans le logiciel d'acquisition, comme matériel supplémentaire.

3. Fluorescent nucléaire StAining plénier embryons de poulet en utilisant vert de méthyle

1. Incuber les œufs de poule fécondés au stade de l'intérêt. Fixer les embryons nuit à 4% de formaldéhyde (de paraformaldéhyde) dans du PBS à 4 ° C. Laver les embryons trois fois dans du PBS-T pendant 2 heures.
2. Préparer une solution à 1: 10.000 de vert de méthyle (à partir de 2% de solution de stock) dans du PBS-T: 5,000-1. Incuber les embryons dans la solution de coloration nuit à 4 ° C. Laver les embryons 3 fois en PBS, 1 heure chacun. Mont dans la chambre avec 75% de glycerol, 0,1 M de Tris, pH 8.

4. imagerie marqué par fluorescence des noyaux dans des embryons entiers monté

1. Préparer une chambre d'imagerie par collage de plusieurs couches de ruban isolant sur une lame de microscope et soigneusement découper un trou dans le avec un scalpel pour placer les embryons à l'intérieur. Cela permettra d'éviter des embryons de l'écrasement lors de l'imagerie.
2. Soigneusement transférer les embryons à la chambre de l'imagerie et de remplir la chambre vers le haut avec 75% de glycérol, 0,1 M de Tris-HCl, pH = 8 à unvide la formation de bulles.
3. Couvrir avec un # 0 lamelle en évitant ou en éliminant débordement moyenne. Sceller avec du vernis à ongles.
4. Acquérir des images de l'échantillon sur un microscope à fluorescence équipé d'un filtre 633 ou la ligne d'excitation au laser.
   REMARQUE: les filtres d'émission devraient couvrir le maximum 677 d'émission de vert de méthyle.

Résultats

Coloration nucléaire des échantillons épais. Le protocole décrit ici permet la réalisation de coloration homogène de structures profondes dans des embryons entiers. Lentilles développement former des noyaux 48 hpf embryons de poisson zèbre sont étiquetés de façon homogène (figure 1).

Vert de méthyle coloration de l'ADN permet la discrimination des différences morphologiques dépendants du cycle cellulaire tels que l'identification des figures de mitose ou noyaux apoptotiques ...

Discussion

Le développement progressif des techniques de microscopie au cours des dernières décennies, avec un accent particulier sur les variations de la microscopie fluorescente, a conduit à la possibilité d’explorer la dynamique et la structure d’échantillons de tissus intacts, y compris des embryons entiers^10,11. Cependant, l’une des principales limitations a été la disponibilité de fluorophores de bonne qualité qui peuvent être utilisés pour colorer directement et rapidement les structures subcellulaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516
Vert de méthyle	Dr. G. Grü ; bler		a également testé Sigma-Aldrich 323829, qui est sans violet de cristal
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127
Microscopie confocale à balayage laser Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin&ndash ; Isothiocyanate de tétraméthylrhodamine B	Sigma-Aldrich	P1951  ;
chloroforme	Sigma-Aldrich	372978
Centrifugeuse 5810 R	eppendorf	5811 000.010  ;   ;
lames de microscope	Deltalab	D100004
lamelles Esco	optics	R525025