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Article de méthode

Mesure de extracellulaire Ion flux Utilisation de l'Ion sélectif microélectrodes Technique d'auto-référencement

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DOI :

10.3791/52782

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3 mai 2015

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1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience, University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

Dans cet article

Résumé

Les transporteurs dans les membranes cellulaires permettent la ségrégation différentielle des ions à travers les membranes cellulaires ou les couches cellulaires et jouent un rôle crucial dans la physiologie, la réparation et la pathologie des tissus. Nous décrivons la microélectrode autoréférencée sélective aux ions qui permet de mesurer des flux d’ions spécifiques au niveau de cellules et de tissus uniques in vivo.

Résumé

Les cellules provenant d'animaux, des plantes et des cellules individuelles sont entourées par une barrière dite de la membrane cellulaire qui sépare le cytoplasme de l'extérieur. des couches de cellules telles que les épithéliums forment également une barrière qui sépare l'intérieur ou de l'extérieur des compartiments différents d'organismes multicellulaires. Une caractéristique clé de ces obstacles est la répartition différentielle des ions à travers les membranes cellulaires ou des couches de cellules. Deux propriétés permettent cette distribution: 1) les membranes et les épithéliums afficher perméabilité sélective aux ions spécifiques; 2) les ions sont transportés à travers des pompes à travers les membranes cellulaires et les couches de cellules. Ces propriétés jouent un rôle crucial dans le maintien de la physiologie des tissus et agissent comme des signaux de signalisation après les dommages, lors de la réparation, ou sous condition pathologique. L'auto-microélectrode référence à sélectivité ionique permet la mesure de flux spécifiques des ions tels que calcium, de potassium ou de sodium à des niveaux de cellules et de tissus simples. Le microélectrodes contient un cocktail de ionophore qui estsélectivement perméable à un ion particulier. La solution de remplissage interne contient une concentration d'ensemble de l'ion d'intérêt. Le potentiel électrique de la micro-électrode est déterminée par la concentration à l'extérieur de l'ion. Comme la concentration en ions varie, le potentiel de la micro-électrode varie en fonction du logarithme de l'activité des ions. En cas de déplacement d'avant en arrière près d'une source ou un puits de l'ion (par exemple dans un gradient de concentration en raison de flux d'ions) le potentiel de microélectrodes fluctue à une amplitude proportionnel au flux d'ions / gradient. L'amplificateur amplifie le signal de micro-électrodes et dont la sortie est enregistré sur l'ordinateur. Le flux ionique peut alors être calculée par la loi de diffusion de Fick en utilisant l'électrode de potentiel de fluctuation, l'excursion de micro-électrodes, et d'autres paramètres tels que la mobilité d'ions spécifique. Dans cet article, nous décrivons en détail la méthodologie pour mesurer les flux d'ions extracellulaires en utilisant l'auto-référencement microélectrodes un sélective d'ionsD présenter quelques résultats représentatifs.

Introduction

Toutes les cellules animales sont entourées d'une membrane de bicouche lipidique, qui sépare le cytoplasme de l'environnement extérieur. La cellule maintient un potentiel de membrane électrique, négative à l'intérieur, par transport actif des ions 1. Le potentiel de membrane est une source d'énergie stockée qui peut utiliser la cellule pour faire fonctionner divers dispositifs moléculaires dans la membrane 2. Les neurones et les autres cellules excitables ont de grands potentiels de membrane. Ouverture rapide des canaux sodiques potentiel effondre la membrane (dépolarisation) et produit le potentiel d'action qui est transporté le long de la longueur du neurone 2. En plus de ces changements rapides électriques, de nombreux tissus et organes et à maintenir génèrent des potentiels électriques significatifs à long terme. Par exemple, la peau et la cornée épithélium génèrent et entretiennent potentiels trans-épithéliales et des courants électriques extracellulaires par le pompage des ions directionnelle (principalement de sodium et de chlorure) 3.

tente "> Bien que les mesures de courant électrique extracellulaire endogène en utilisant la sonde vibrante 6/4 et des mesures de la membrane ou trans-épithéliales potentiels à l'aide du système de micro-électrodes 7-10 permettre la mesure des paramètres électriques des membranes cellulaires et des couches de cellules épithéliales, ils ne donnent pas de indication de l'espèce d'ions concernés.

Microélectrodes avec ionophore sélectif peuvent mesurer la concentration d'ions en solution spécifique. Gradients d'ions ou de flux peuvent être mesurés avec deux ou plusieurs électrodes à différentes positions. Cependant, la variation de la tension intrinsèque de chaque sonde serait différent, causant des mesures inexactes ou même la détection d'un gradient qui était absent. Une électrode unique est utilisé en mode "auto-référencement" grâce à quoi il se déplace à basse fréquence entre deux points permet de résoudre ce problème. Maintenant, le flux d'ions peut être vu dans le contexte d'une dérive du signal relativement lent et stable (voir la figure 3B).

Le système de mesure sensible aux ions utilise microélectrodes auto-référence à sélectivité ionique pour détecter de petits flux extracellulaires des ions près des tissus ou des cellules individuelles. Le système est constitué d'un amplificateur qui traite le signal de la microélectrode et un micro-moteur pas à pas et le pilote pour commander le mouvement de la microélectrode. Le micro-électrodes à sélectivité ionique et l'électrode de référence qui ferment le circuit sont connectées à l'amplificateur par l'intermédiaire d'un pré-amplificateur headstage (figure 1A). Logiciels détermine les paramètres du mouvement de micro-électrodes (fréquence, distance) et enregistre également la sortie de l'amplificateur. Le moteur pas à pas commande le mouvement de micro-électrodes par l'intermédiaire d'un micropositionneur tridimensionnel. Une faible fréquence de vibration microélectrodes sélectives d'ions a été développé en 1990 pour mesurer le flux de calcium spécifique 11. Ainsi que du calcium, des cocktails ionophores commercialement accessibles sont maintenant disponibles pour faire MICRoelectrodes sensible au sodium, chlorure, potassium, l'hydrogène, le magnésium, le nitrate d'ammonium, le fluorure de lithium, ou du mercure.

Fondamentalement, la technique de micro-électrodes à sélectivité ionique auto-référencement convertit l'activité d'un ion spécifique dissous dans une solution à un potentiel électrique, qui peut être mesurée par un voltmètre. Le cocktail d'ionophore est un liquide non miscible (, organique lipophile) de phase ayant des propriétés d'échange d'ions. L'ionophore forme un complexe se lie sélectivement (ions spécifiques) et les transfère de façon réversible entre la solution aqueuse contenue dans la micro-électrode (électrolyte) et la solution aqueuse dans laquelle est immergée la microélectrode (Figure 1D). Ce transfert d'ions conduit à un équilibre électrochimique et une variation du potentiel électrique entre la micro-électrode et l'électrode de référence est mesurée par le voltmètre. La tension est proportionnelle au logarithme de l'activité spécifique d'ions selon la Nernst equation permettant le calcul de la concentration d'ions (Figure 2A et B).

À l'heure actuelle, plusieurs systèmes permettent la mesure du flux d'ions en utilisant un concept ou un principe similaire. Par exemple, l'électrode Technique Scanning Ion sélectif (SIET) 12,13 ou le (MIFE) technique microélectrodes Ion Flux Estimation développé par Newman et Shabala 14-16 sont disponibles dans le commerce et largement utilisé par la communauté de recherche afin de déterminer ion spécifique fondants se produisant à la membrane cellulaire et tissulaire à travers une variété d'animaux, de plantes et de modèles cellulaires de vie simples. Microélectrodes ioniques sélectives ont été utilisées pour mesurer l'hydrogène, le potassium et le flux de calcium dans les racines des plantes 17, le chlorure de flux dans rat artères cérébrales 18 et dans les tubes polliniques 19, flux d'hydrogène dans des cellules rétiniennes patin 20, le flux de calcium dans les os de la souris 21, divers ions flux dans hyphes 22 et dans rà 23 cornée, et enfin le flux de calcium pendant la plaie d'une cellule unique de guérison 12,24. Voir aussi le commentaire pour plus d'informations sur l'auto-référencement microélectrodes sélectives d'ions 25.

L'article suivant décrit en détail la façon de préparer et d'effectuer la mesure des flux d'ions extracellulaires endogènes en utilisant la technique de micro-électrodes ion-sélective auto-référencement au niveau de la cellule unique.

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Protocole

1. Ion sélectif auto-référencement microélectrodes Préparation

  1. Préparation de micro-électrodes à sélectivité ionique
    1. Chaleur tirer minces capillaires de borosilicate paroi sans filament (diamètre extérieur de 1,5 mm, 1,12 mm de diamètre interne) à l'aide d'un extracteur de microélectrodes.
      Remarque: Cela donne des conseils 3-4 m de diamètre. Les petites pointes ont une résistance plus élevée qui le rend plus sensible aux micro-électrodes bruit électronique et est également associée à une réponse plus lente à un changement de concentration d'ions. Des informations utiles peuvent être trouvées dans le document publié par Smith et al. 26.
    2. Silaniser les électrodes pour rendre la surface hydrophobe interne pour faciliter la rétention de l'ionophore cocktail lipophile. Placez les microélectrodes dans un support en métal et la chaleur O / N dans un four à> 100 ° C pour les sécher. Le rack est une plaque de métal avec des trous de 2 mm de diamètre foré partie du chemin à travers. Placer les électrodes dans les trous bascule vers le haut avec un 250 ml gbécher lass sur eux.
    3. Dans la matinée, éteindre le four et, tout en portant des gants isolants, retirez avec précaution le support en métal avec les électrodes et bécher en place. Fermez la porte du four pour conserver la chaleur.
    4. Porter des gants en latex ou en nitrile, blouse de laboratoire et une protection oculaire. Avec une pipette Pasteur en plastique, placer une goutte de solution de silanisation I à la base de chaque électrode (garder le bécher en place; utiliser le bec verseur pour l'accès de la pipette). La solution de silanisation est vaporisé par la plaque chauffante et silanizes l'intérieur des électrodes. Utilisez une hotte d'extraction chimique pour cette étape. Placer la grille / bécher / électrodes de retour dans le four chaud pendant quelques heures pour permettre à toute solution de silanisation restant à évaporer.
      Remarque: Pour des raisons de sécurité, ne mettez pas le four en marche. Placer une étiquette sur le four qui indique qu'il ne doit pas être mis sous tension car elle peut contenir de la vapeur nocifs et inflammables.
    5. Après refroidissement, stocker les microélectrodes dans un bocal insi de stockage de microélectrodesdé un dessiccateur en verre avec 400 g d'agent déshydratant. Microélectrodes peuvent être stockées ainsi pendant plusieurs semaines.
      Note: Une méthode de silanisation alternatif est décrit dans Smith et al 26.
    6. Retour-remplir la microélectrode de 50 à 100 pi (une longueur d'environ 1 cm) d'une solution contenant 100 mM de l'ion à mesurer (voir tableau 1 et figure 1B). Utilisez un plastique jetable pipette Pasteur chaleur tiré dans un brûleur Bunsen d'une amende filament. Rincer la pipette dans dH 2 O tard pour empêcher le blocage.
      Remarque: En variante, ajuster la concentration en ions de la solution de remblayage pour correspondre à la concentration de l'ion dans la solution externe 27.
    7. Observer la microélectrode sous un microscope à dissection pour assurer l'absence de bulles d'air.
      1. Si des bulles sont présentes robinet la microélectrode légèrement avec un ongle tout en maintenant l'électrode verticalement (pointe vers le bas) et / ou pousser la bulles à la pointe en appliquant une contre-pression à l'aide d'une seringue modifié avec un tube de silicone de remplacer l'aiguille.
    8. Tip-remplir la microélectrode de 15 à 20 nl (une longueur de 30-50 um) de spécifique-ion ionophore cocktail (voir le tableau 1). Placer une petite goutte de ionophore cocktail sur le bord court d'une lame de microscope. Observez la pointe de microélectrodes sous un microscope de dissection et le déplacer vers la lame de microscope jusqu'à ce que la pointe de microélectrodes touche le cocktail ionophore pour seulement environ un demi-sec. Dessinez le cocktail ionophore dans le microélectrodes par la pression capillaire.
      Note: Eviter une longue colonne de ionophore cocktail car cela augmente la résistance électrique de la sonde qui peut le rendre sensible aux interférences électroniques (bruit) et ralentit également le temps de réponse.
    9. Montez le microélectrodes dans un support de microélectrodes droite avec un 1 mm connecteur mâle de l'or et AgCl (Ag +) fil (figure 1B).
    10. Fixer le support de micro-électrodes à l'étage de tête monté sur un micropositionneur électronique tridimensionnel commandé par ordinateur (figure 1A).
    11. Placez la pointe de microélectrodes dans la mesure de solution appropriée pour l'échantillon à mesurer (sérum physiologique, milieu de culture, etc.) pour permettre la microélectrode se stabiliser pendant une heure ou deux, ou même la nuit.
  2. Préparation de l'électrode de référence
    1. Les électrodes de référence (Figure 1C) sont les mêmes que ci-dessus capillaires. Couper le capillaire avec un crayon de diamant en 5 cm de longueur et le feu-brillant à chaque extrémité pour 1-2 sec dans un bec Bunsen.
    2. Remplir avec ces électrodes ~ 200 ul d'une solution 3 M de NaCl, CH 3 CO 2 K (acétate de potassium) ou de KCl avec 2% d'agarose. Choisissez la solution en fonction de l'ion à mesurer (l'électrode de référence ne doit pas contenir l'ion mesuré; voir le tableau 1). Mélangerl'agarose et la solution et on chauffe à l'ébullition presque dans un micro-ondes. Remuez pour dissoudre la gélose (la solution va clair).
    3. Fixez l'électrode de référence à une pipette Pasteur en plastique et tirer la solution chaude dans le capillaire.
    4. Déposer l'électrode dans le froid 3 M de NaCl, CH 3 CO 2 K ou d'une solution de KCl et le ranger dans cette solution 3 M dans des tubes scellés avant de les utiliser. Jeter les électrodes de référence avec des bulles d'air.
    5. Monter l'électrode de référence dans un support de microélectrodes droite culot (pré-remplie avec une solution 3 M) avec un AgCl (Ag +) à l'intérieur et une médaille d'or de 2 mm connecteur mâle (figure 1C) et fixer l'électrode et porte sur un micro-positionneur manuel monté sur un support magnétique.

2. Ion sélectif auto-référencement microélectrodes Calibration

  1. Préparation des solutions d'étalonnage contenant l'ion d'intérêt que dans la solution de référence; voir le tableau 1 . SUPPORT la concentration qui est dans la solution de l'échantillon sera (par exemple de milieux de culture, le sérum physiologique). Autrement dit, une solution d'étalonnage doit contenir une concentration plus faible de l'ion que dans la solution de mesure, et l'un plus élevé.
    1. Par exemple, utiliser une solution saline qui contient 1 mM de K +. Au support de cette concentration, on dissout la poudre dans de l'eau désionisée de KCl à une concentration de 10, 1 et 0,1 mM dans des dilutions en série. Utilisez ces solutions d'étalonnage. Sinon, utilisez au moins deux de ces solutions.
  2. Plonger la microélectrodes sélectives d'ions et l'électrode de référence dans chaque solution d'étalonnage et laissez la valeur de tension se stabiliser pendant 1 à 3 min avant d'enregistrer la tension correspondante en utilisant le logiciel dédié (voir le tableau 1).
  3. Comme le logiciel enregistre les données (de sortie de l'amplificateur) comme un fichier txt, copier les données dans un fichier tableur. Tracer la sortie de micro-électrodes (mV) en fonction du logarithme dela concentration molaire d'ions (Figure 2A).
  4. Appliquer une régression linéaire et calculer la pente de Nernst, intercepter et R valeur 2. Accepter la microélectrode si la pente de Nernst est de 58 ± 11 mV / décade pour les ions monovalents et 29 ± 11 mV / décade pour les ions bivalents (pour les cations, la pente de Nernst est positif, pour les anions elle est négative). De plus, les bons micro-électrodes doivent avoir une forte corrélation linéaire (R 2> 0,9; Figure 2B).
    Remarque: La sortie mV de l'amplificateur utilisé ici donne lecture mV avec un gain de dix. Les valeurs doivent être divisée par un facteur de dix.
  5. Utilisation de la formule de régression linéaire pour convertir la sortie mV brut de la microélectrode en concentration d'ions réelle (figure 2B).

3. Validation de la technique de microélectrodes Ion sélectif

  1. Préparation d'une source artificielle
    1. Capillaires sources artificielles sont les mêmes que les capillairesci-dessus. Chaleur tirer le capillaire à l'aide d'un extracteur de microélectrodes comme à l'étape 1.1.1.
    2. Remblai ces capillaires avec 200 ul d'une solution de NaCl, KCl 1 M, CaCl2 2 H 2 O ou un pH de 4 tampons. Choisir la solution de source artificielle en fonction de l'ion à mesurer (voir le tableau 1).
      Remarque: vous pouvez tirer électrodes avec un plus grand diamètre pointe (~ 20 um) et pointe remplir avec les mêmes solutions, mais contenant 0,5-1% agarose (agarose permettra d'éviter tout écoulement masse de la solution).
    3. Montez le capillaire de source artificielle sur un micromanipulateur et la plonger dans la solution utilisée pour mesurer le flux de l'ion dans les échantillons. Laisser la source artificielle dans la solution pendant 30 min à 1 h pour permettre la stabilisation de la pente.
  2. Validation de la micro-électrode sélective d'ions
    1. Immerger la microélectrode sélective d'ions d'environ un centimètre de distance à partir de la source artificielle capillaire dans la solution utilisée pour mesure le flux d'ions sur les échantillons et fermer le circuit avec l'électrode de référence comme avant. Soit la valeur de la tension à stabiliser pendant 1 à 3 minutes avant l'enregistrement de la tension correspondant à l'aide du logiciel dédié pendant 1 à 2 min. Cette valeur correspond à la valeur de la mémoire tampon (dans la littérature a également évoqué comme référence, de fond ou de la valeur à blanc).
    2. Déplacer la microélectrode sélective d'ions à environ 5 um à partir de la source artificielle et soit la valeur de tension pour stabiliser 1 à 3 minutes avant l'enregistrement de la tension correspondant à l'aide du logiciel pendant 1 à 2 min.
    3. Répéter la procédure ci-dessus en plaçant l'ion sélectif microélectrode à 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 et 1 280 um à une distance capillaire de la source artificielle.
    4. Extraire les données dans un fichier txt et copier les valeurs dans une feuille de calcul.
  3. Calculer la concentration en ions correspondant aux valeurs mV de la même façon que pour les valeurs de calibrage. Tracer la valeur.
    Nonte: Si un flux d'ions est présente, la microélectrode détecte une différence de concentration d'ions entre les deux positions (figure 3B). Si la source artificielle contient plus d'ions de l'espèce mesurée de la solution, la concentration doit être supérieure à proximité de la source de loin, la validation de la capacité du micro-électrode sélective d'ions à détecter correctement la direction d'un flux d'ions (dans ce cas, efflux; pour un évier artificielle, avec la concentration d'ions spécifique inférieur milieu de mesure, il devrait être afflux).
    1. Calculer le flux d'ions en utilisant la loi de diffusion de Fick: J = c μ (dc / dx) où c est la concentration d'ions dans la solution (mol cm -3), μ est la mobilité d'ions (mole cm N -1 s -1) et dc est la différence de concentration au-dessus de distance dx (cm) (figure 2C). Les données de flux d'ions sont habituellement présentés en pmol cm -2 s-1 Cm -2 ou nmol sec -1.
      Remarque:.. Une autre méthode de calcul de flux d'ions décrite par Smith et al 26 peut être utilisé. Les différences comprennent l'utilisation du coefficient de diffusion au lieu de la mobilité des ions et la soustraction de l'arrière-plan du flux d'ions (aussi dériver tension ou le facteur de correction) calculé à partir de la mesure du flux d'ions dans une solution saline sans échantillon.
    2. Tracer la moyenne des flux d'ions de chaque étape sur la distance de la source (figure 2D). Se déplacer loin de la source, d'observer une décroissance exponentielle de la valeur du flux validation de la capacité du micro-électrode à sélectivité ionique pour détecter grandeur différente de flux d'ions.
    3. Faites la validation de la source artificielle une fois pour chaque ion spécifique destinée à être enregistrée afin de valider ses sens et l'ampleur des mesures correctes avec un grand n signal-ratio d'oise.
      Note: Ion mesure de flux de la mémoire tampon sans échantillons indique le niveau ou bruit de fond. Typiquement, la mesure de la mémoire tampon montre pas de fluctuation claire de la concentration d'ions conduisant à très faible flux qui affiche des directions variables.

4. Préparation de la Chambre de mesure

Remarque: Avant d'expériences, envisager l'échantillon à mesurer et comment l'échantillon doit être monté et immobilisé pour des mesures de microélectrodes.

  1. Pour Xenopus laevis mesures d'ovocytes couper un carré de 1 cm d'une maille de 800 um de nylon (Nitex mesh) et le coller dans une boîte de Petri en plastique (figure 1E).

5. Flux mesure Ion

  1. Mesurer la concentration d'ions présents dans le tampon utilisé pour effectuer les mesures sur l'échantillon de la même manière que pour la solution d'étalonnage. X. laevis ovocytes exigent Ringer modification de Mark (ROR). RÉissolve NaCl, KCl, CaCl, et HEPES MgCl dans de l'eau désionisée pour atteindre une concentration finale de (mM): NaCl 100, KCl 2, CaCl 2, MgCl 1 et 5 HEPES. Ajuster le pH du tampon à 7,5 en utilisant du NaOH.
  2. Placer l'échantillon dans la chambre de mesure et pour apporter le micro-électrode sélective d'ions à proximité de l'échantillon (environ 10 pm environ) en utilisant le micropositionneur pour définir la position proche de la microélectrode (figure 3A).
  3. Lancer l'excursion basse fréquence (0,3 Hz) (100 um) de la micro-électrode entre la position rapprochée et une position éloignée de l'échantillon (à distance) à l'aide du logiciel dédié. Assurez-vous que le mouvement de la microélectrode est perpendiculaire à la surface de l'échantillon.
    Remarque: L'excursion de la microélectrode peut être réglé sur le logiciel. Grand excursion augmente le gradient de lecture permettant une détection plus facile des petites flux pendant le temps de mesure allonge l'intervalle d'échantillonnage et diminue la résolution temporelle. Voir Figure 3A pour un exemple.
  4. Lancer l'enregistrement à l'aide du logiciel. La microélectrode fait une pause au niveau de chaque position et le potentiel électrique en mV est enregistré sur l'ordinateur. Obtenir des mesures pendant au moins 2 min, ce qui permet la stabilisation de signal. Pour les courtes expériences time-lapse, fiche variations potentielles à la position de l'intérêt pour l'ensemble du cours du temps.
  5. Extraire les données dans un fichier txt et copier les valeurs dans une feuille de calcul.
  6. Calculer la concentration en ions correspondant aux valeurs mV de la même façon que pour les valeurs de calibrage. Tracer la valeur.
    Remarque: si un flux d'ions est présente, la microélectrode détecte une différence de concentration d'ions entre les deux positions (figure 3B).
  7. Calculer le flux d'ions en utilisant la loi de diffusion de Fick que précédemment (étape 3.3.1).
  8. Répéter la mesure de la mémoire tampon avant de mesurer un nouvel échantillon et répéter la procédure de mesure de flux et de calcul pour chaque nouveauéchantillon.

6. Analyse statistique et présentation des données

  1. Testez les effets indépendants de la position et / ou du temps sur les flux d'ions sous la condition de commande en utilisant un modèle d'analyse de covariance avec des effets mixtes 28.
    Remarque: L'analyse de covariance (ANCOVA) est un modèle linéaire général qui mêle régulière ANOVA et de régression en permettant des mesures à la fois qualitatives et continues à être utilisés comme variables indépendantes. En outre, en présence d'erreurs corrélées induits par des mesures répétées par des effets imbriqués individuels et éventuels, les modèles à effets mixtes sont utilisés pour modéliser des estimations précises des deux effets fixes et aléatoires.
  2. Calculer les comparaisons par paires à l'aide de t -test des étudiants entre les niveaux de groupe avec correction de Bonferroni pour les tests multiples 28.
  3. Générer des boîtes à moustaches pour résumer mesures de flux ionique selon la position et l'heure. Inclure les valeurs de p de la paire de Student décritci-dessus (Figure 3D) et indiquer les niveaux de p valeurs de signification comme suit: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0,001 29

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Résultats

Nous avons précédemment montré que l'afflux de calcium apparaît après une seule cellule 24 blessés. Nous avons donc demandé si d'autres flux d'ions se produisent lors d'une lésion d'une cellule unique. Nous avons utilisé le X. laevis ovocytes, un modèle bien établi pour la cellule cicatrisation seule 30-34 et l'enregistrement électrophysiologique 24,35-39. Fait intéressant, les ions potassium sont plus concentrées à l'intérieur de X. laevis o...

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Discussion

Les étapes les plus critiques pour la mesure réussie de flux ioniques extracellulaires in vivo sont les suivants: la réduction du bruit, la fabrication correcte du microélectrodes référence et électrode à sélectivité ionique, et le positionnement de l'échantillon et les deux électrodes.

Afin de minimiser le bruit, le système d'enregistrement doit être mis à la terre dans un (terre) de préférence cage de Faraday avec un (isolation des vibrations) surmonté tableau-métallique q...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention MCB-0951199 de la National Science Foundation, et en partie par la subvention NIH EY01910, les subventions RB1-01417 de l’Institut californien de médecine régénérative et par la subvention SFRH/BD/87256/2012 de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
IonAmp  ;  ; BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAaucunamplificateur créé par le BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, États-Unis ; Un système similaire peut être acheté auprès de " La fonction XBL est importante. (http://www.xuyue.org/) ou de « YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou de l’électronique applicable(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32  ;  ; BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, États-Unisaucunlogiciel créé par le BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, États-Unis ; Un système similaire peut être acheté auprès de " La fonction XBL est importante. (http://www.xuyue.org/) ou de « YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou auprès d’Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Préamplificateur Headstage  ; Centre de recherche BioCurrents, Woods Hole, MA, États-UnisINA116Suiveur de tension BSR INA116, conçu par le Centre de recherche BioCurrents, Woods Hole, MA, États-Unis ; Un système similaire peut être acheté auprès de " La fonction XBL est importante. (http://www.xuyue.org/) ou de « YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou à partir de l’électronique applicable(http://www.applicableelectronics.com/)
Pilote MicroStep  ; BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, États-Unis, aucuntrois drivers MicroStep ne sont requis pour le positionnement X, Y et Z ; créé par le BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, États-Unis ; Un système similaire peut être acheté auprès de " La fonction XBL est importante. (http://www.xuyue.org/) ou de « YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou de l’électronique applicable(http://www.applicableelectronics.com/)
Micropositionneur manuel  ;   ;World Precision Instruments  ;Le modèle KITE-RUn système similaire peut être acheté auprès d’Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic Stand  ;   ;   ;World Precision InstrumentsModèle M10Un système similaire peut être acheté auprès d’Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table  ;   ;Newport Inc.  ;   ;   ;   ;   ;Modèle VW-3036-OPT-023040Un système similaire peut être acheté chez Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Fait partie de trois micropositionneurs dimentionnels : support d’angle, 90° ;, faces fenduesNewport Inc.  ;   ;   ;   ;   ;Modèle 360-90L’assemblage des trois micropositionneurs numériques nécessite également trois moteurs rotatifs électriques pour le contrôle X, Y, Z, un bras de montage MPH-1 avec poteau à angle réglable MCA-2 et divers connecteurs et vis Newport à boulonner sur la table vibrante
Partie de trois micropositionneur didimensionnels : Peg-Joining Dovetail Stage 0,5 pouce X TravelNewport Inc.  ;   ;   ;   ;   ;460PD-Xnone
Fait partie d’un micropositionneur de trois dimensions : platine linéaire à montage rapide, 0,5 pouce XY TravelNewport Inc.460A-XYaucun
Kwik-Fil capillaires en verre borosilicate à paroi mince sans filament  ;World Precision Instruments  ;TW150-4aucun
Extracteur d’électrodes  ;Narishige  ; PC-10aucun
Grille métalliqueFabriqué en interneAucunPorte-électrode en métal fabriqué en interne en perçant des trous de 2 mm de large d’un demi-centimètre espacés dans une base rectangulaire en acier de 10 cm sur 15 cm
Four QLModèle 10 Four de laboratoireaucun
Solution de silanisation I  ;Sigma-Aldrich85126Dangereux, manipuler comme recommandé par le fournisseur
Boîte de Pétri en verre ; PyrexFisher Scientific316060none
Pot de stockage d’électrodes/micropipettesWorld Precision Instruments  ;E215aucun
Dessiccateur en verreFisher Scientific08-595EContient un dessiccant à base de dessiccant à base de dessicante (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, États-Unis). Placez de la vaseline sur le joint pour le rendre hermétique.
Pipette Pasteur en plastique  ;Fisher Scientific11597722aucun
Bec BunsenFisher ScientificS97329aucun
Lame de microscopeSigma-AldrichS8902aucun
Porte-microélectrode droitWarner InstrumentsQSW-A15Pavec connecteur mâle doré de 1 mm et fil Ag/AgCl
Porte-microélectrode droit  ;World Precision InstrumentsMEH3Savec une pastille AgCl(Ag+) à l’intérieur et un connecteur mâle or de 2 mm  ;
Boîte de Pétri 6 cmVWR60872-306aucune
maille NitexDynamic Aqua-Supply Ltd.NTX750aucun
Colle ; Loctite epoxyVWR500043-451Mélangez la colle et le durcisseur à parts égales dans un bateau de pesée en plastique et mélangez soigneusement. Durcit rapidement mais laisse à RT pendant 24 h pour un durcissement complet
Eau déminéralisée  ;Sigma-Aldrich99053aucun
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS7653aucun
Chlorurede potassium Sigma-AldrichP9333aucun
Chlorure de calciumSigma-AldrichC1016aucun
Chlorure de magnésiumSigma-AldrichM8266aucun
HepesSigma-AldrichH3375aucun
Hydroxyde de sodiumSigma-AldrichS8045aucun
Acétatede potassium Sigma-AldrichP1190aucun
AgaroseSigma-AldrichA9539aucun

Références

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