Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

Résumé

Pour aider à évaluer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération biliaire du foie due au poisson-zèbre, nous avons établi un modèle de lésion hépatique dans lequel les hépatocytes exprimant la nitroréductase sont génétiquement ablatés lors d’un traitement au métronidazole. Dans ce protocole, nous décrivons comment manipuler, surveiller et analyser habilement l’ablation des hépatocytes et la régénération hépatique induite par les voies biliaires.

Résumé

Le foie a une grande capacité à se régénérer. Les hépatocytes, les cellules du parenchyme du foie, peut régénérer en une de deux manières: ou conduit biliaire hepatocyte--régénération du foie. Dans entraîné hépatocytes la régénération du foie, régénération des hépatocytes sont dérivés d'hépatocytes préexistantes, alors que, dans la régénération conduit biliaire, de régénération des hépatocytes sont dérivées de cellules epitheliales biliaires (BEC). Pour entraîné hépatocytes la régénération du foie, il ya d'excellents modèles de rongeurs qui ont contribué de manière significative à la compréhension actuelle de la régénération du foie. Cependant, rien de tel modèle de rongeur existe pour entraînée bilio-régénération du foie. Nous avons récemment rapporté sur un modèle de blessure de foie de poisson zèbre dans lequel BEC donne lieu à beaucoup hépatocytes sur une perte sévère des hépatocytes. Dans ce modèle, les hépatocytes sont spécifiquement ablation par un moyen pharmacogénétiques. Ici, nous présentons en détail les méthodes pour l'ablation des hépatocytes et d'analyser le processus de régénération du foie BEC-driven.Ce modèle d'ablation spécifiques hépatocytes peut encore être utilisé pour découvrir les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents de conduit biliaire-régénération du foie. En outre, ces méthodes peuvent être appliquées à des écrans chimiques pour identifier de petites molécules qui inhibent ou augmentent la régénération du foie.

Introduction

Le foie est un organe très régénérative. Au cours de la régénération du foie, régénération des hépatocytes, les cellules du parenchyme du foie, sont dérivés des hépatocytes pré-existantes (entraînée hépatocytes régénération du foie (BEC) ou entraîné biliaire de régénération du foie) ^1,2. Des lésions hépatiques suscite habituellement la prolifération des hépatocytes pré-existante; cependant, lorsque la prolifération des hépatocytes est compromise, BEC peut contribuer à hépatocytes ^2-4. Ces deux modes de régénération du foie sont cliniquement significatives. Après l'ablation chirurgicale d'une partie du foie humain (par exemple, en raison de tumeurs du foie ou des donneurs vivants de foie), les hépatocytes dans le foie restant prolifèrent pour récupérer la masse du foie perdu. En revanche, chez des patients atteints de maladies hépatiques graves, la prolifération des hépatocytes est fortement compromise, de sorte que BEC ou de cellules souches du foie (LPC) semblent contribuer à la régénération des hépatocytes ^5,6. Le modèle de hépatectomie partielle rongeurs 2/3, dans lequelhépatocytes prolifèrent pour récupérer la masse du foie perdu, a largement contribué à la compréhension actuelle de entraîné hépatocytes de foie de régénération ^7,8. Cependant, il n'y a pas modèle de rongeur valide dans lequel les hépatocytes régénération proviennent principalement de BEC. Bien que plusieurs modèles de rongeurs de la toxine du foie ont conduit à l'identification de conduit biliaire du foie régénération ^2-4, des études récentes de la lignée de traçage chez les souris indiquent une contribution minimale de BEC pour la régénération des hépatocytes dans ces modèles ^9,10. Certains des modèles de lésions hépatiques de rongeurs, y compris une hépatectomie partielle et induite par l'acétaminophène ^11-13-14,15 dommages au foie, ont été appliquées pour le poisson zèbre et conduit à l'identification de nouveaux gènes ou des voies impliquées dans la régénération du foie. Cependant, les hépatocytes entraînée, mais pas BEC-entraînée, la régénération du foie se produit dans ces modèles de lésion du foie de poisson zèbre. Par conséquent, un modèle de lésion du foie roman dans lequel CAE contribuent largement à regenerating hépatocytes est nécessaire pour une meilleure compréhension du BEC-entraîné la régénération du foie.

Les objectifs globaux du modèle d'ablation des hépatocytes décrits ici sont (1) pour générer un modèle de lésion du foie dans laquelle CAE contribuent largement aux hépatocytes de régénération, et (2) élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents BEC-driven la régénération du foie. Nous émettons l'hypothèse que la gravité des blessures détermine le mode de régénération du foie; ainsi, nous avons prédit que conduit biliaire-régénération du foie lancerait lors d'une lésion des hépatocytes sévère. Pour tester cette hypothèse, nous avons développé un modèle de lésion du foie de poisson zèbre en générant une lignée transgénique, Tg (fabp10a: CFP-NTR) ^S931, qui exprime très nitroreductase bactérienne (NTR) fusionnée avec une protéine fluorescente cyan (CFP) dans le cadre du fabp10a spécifique hépatocytes promoteur. Depuis NTR convertit le promédicament non toxique, le métronidazole (Mtz), en un médicament cytotoxique, il ne l'ablation destiné NTR-cellules exprimant ^16-18, dans ce cas, les hépatocytes. En manipulant la durée du traitement Mtz, l'étendue des hépatocytes ablation peut être contrôlée. En utilisant ce modèle, nous avons récemment signalé que sur une perte sévère des hépatocytes, BEC donne lieu à beaucoup hépatocytes régénération ^19, qui a été confirmée par deux autres études indépendantes ^20,21. Par conséquent, par rapport à l'rongeur ci-dessus et les modèles de lésions du foie de poisson zèbre, notre modèle d'ablation des hépatocytes est plus avantageux pour l'étude BEC-driven la régénération du foie.

Ce protocole décrit la procédure pour effectuer des expériences de régénération du foie en utilisant le modèle hépatocytes d'ablation poisson zèbre. Ce modèle sera appropriée pour déterminer les mécanismes sous-jacents conduit biliaire-régénération du foie et pour les écrans chimiques pour identifier de petites molécules qui peuvent réprimer ou d'augmenter la régénération du foie.

Protocole

Poisson zèbre ont été soulevées et élevés selon la procédure standard; expériences ont été approuvés par l'Université de Pittsburgh institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

1. Préparation d'embryons / larves

1. Pour mener accouplements chronométrés, mis en place adulte mâle et femelle Tg (fabp10a: CFP-NTR) ^S931 poissons hémizygotes ou homozygotes O / N et placer une séparation entre eux. Retirer ce diviseur le lendemain matin lorsque l'accouplement est souhaitée. Recueillir des embryons en forçant l'eau en utilisant une maille fine passoire en plastique.
2. Tourner la crépine à l'envers et rincer la surface de maille avec un mince filet d'eau d'œuf distribué à partir d'un flacon souple. Transférer 100 embryons dans une boîte de Pétri de 100 mm avec 25 ml d'eau de l'œuf. Gardez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri et les élever à 28 ° C.
3. Pour inhiber la pigmentation, ajouter phénylthiourée (PTU) dans les boîtes de Pétri avant 10 h après la fécondation (HPF), et d'élever embryos / larves jusqu'au 80 HPF. La concentration finale de 0,2 mM est PTU. ATTENTION: PTU est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
4. Anesthésier les larves par addition de 3-amino benzoïque ester éthylique de l'acide (tricaïne), à ​​une concentration finale de 0,016%, dans les boîtes de Pétri. Puis, en utilisant un microscope à épifluorescence, larves sorte CFP-positif. Utilisez les larves avec une taille de foie et jeter semblable à celles d'un foie plus petit ou plus grand.
   REMARQUE: les larves de PCP-positif, indépendamment de l'intensité, peut être utilisé car il n'y a aucune différence dans la mesure des hépatocytes ablation entre les larves hémizygote et homozygotes. ATTENTION: tricaïne est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
5. Retirer l'eau d'œuf contenant Tricaine et ajouter de l'eau d'œuf supplémenté avec 0,2 mM PTU. Garder les embryons / larves à 28 ° C.

2. Traitement Mtz

1. Préparer une solution fraîche mM Mtz 10 en dissolvant 0,171 g de poudre Mtz en 100 ml d'eau d'œuf complété avec 0,2% de DMSO et 0,2 mM PTU. Pour dissoudre complètement le Mtz, mélanger la solution à la température ambiante sous agitation rapide pendant 20-30 minutes. Pour aider à solubiliser Mtz et d'améliorer Mtz perméation dans les larves, ajouter DMSO lors de la préparation Mtz. ATTENTION: L'exposition prolongée ou accrue concentration de Mtz est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
2. Séparer les larves dans des groupes de contrôle et expérimentales en transférant nombre désiré de larves dans deux différents plat 100 mm de Pétri ou plaque multi-puits. Pour le groupe expérimental, garder les larves dans une solution 10 mM Mtz; pour le groupe de contrôle, gardez-les dans de l'eau contenant de l'œuf 0,2% de DMSO.
3. Couvrir les plaques ou les boîtes de Pétri contenant la solution Mtz avec du papier d'aluminium pour éviter la photo-inactivation de Mtz, et incuber à 28 ° C. La durée du traitement dépend de la Mtz stade larvaire et la lignée transgénique.
4. Pour observer similaire sévère ablation des hépatocytes dans le Tg (fabp10a: CFP-NTR) en ligne, traiter les larves avec la solution Mtz soit de 3,5 jours après la fécondation (DPF) (pour une durée de 36 h) ou de 5 dpf (pour une durée de 24 heures).

3. Analyse des voies biliaires axée sur la régénération du foie

1. A la fin de la période d'ablation, on élimine la solution Mtz des plaques. Laver les larves Mtz traitée par addition de 25 ml d'eau de l'oeuf. Agiter la plaque 2-3 fois pour laver les larves avant de jeter l'eau d'œuf. Répétez trois fois et puis plonger les larves une fois de plus dans l'eau d'œuf. Pour éviter l'œdème cardiaque et la mort larvaire chez les larves traitées Mtz, ajouter une plus faible concentration de tricaïne, à une concentration finale de 0,008%, pour immobiliser les larves.
2. Pour l'analyse du foie, examiner la taille du foie des larves Mtz traité sous un microscope à épifluorescence avec le filtre de la PCP. Évaluer les niveaux d'ablation d'hépatocytes fonction de la taille relative du foie: un grand (non-ablation; 0-10% larves), moyen (partiellement ablation; 10-20%) et très faible (entièrement ablation; 80 à 90%).
3. Retirer les larves avec des foies non soumises à une ablation ou partiellement ablation. Seulement conserver des larves avec une minuscule foie, qui est indicative d'ablation sévère des hépatocytes. Pour l'analyse du foie à la régénération 0 point de temps de h (R0H), récolter les larves après Mtz lavage et de la PCP tri. Sinon, conservez les larves triés dans l'eau d'œuf supplémenté avec 0,2 mM PTU avant d'être prêt pour la récolte.
4. Transfert larves récoltées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml et remplacer l'eau d'oeuf avec la solution de fixation de 3% de formaldehyde dans du tampon PEM. Incuber le tube sur un rotateur O / N à 4 ° C.
5. Remplacer la solution de fixation avec 1 ml de PBSDT et faire tourner le tube contenant les larves sur le rotateur pendant 5 min.
6. Transférer les larves fixe dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant PBSDT et en utilisant une pince, retirer manuellement jaune et pectorales sous un microscope de dissection. Transférer jusqu'à 20 larves tp disséqué dans un tube de 1,5 ml.
7. Remplacer solution PBSDT avec 1 ml de solution de blocage et de rock du tube sur un rotateur à température ambiante pendant 2 h.
8. Remplacer la solution de blocage avec 100 ul de solution de blocage contenant des anticorps primaires. Lentement balancer le tube sur un rotateur O / N à 4 ° C.
9. Retirer la solution d'anticorps primaire et laver avec PBSDT 5 fois pendant 10 min à chaque fois. Puis ajouter 100 ul de la solution de blocage contenant des anticorps secondaires et le rock sur un agitateur à température ambiante pendant 2h.
10. Laver 5 fois avec PBSDT pour 10 min à chaque fois à la température ambiante en basculant sur un rotateur.
11. Orientez les larves latéralement sur une lame de microscope et ajouter une goutte de milieu de montage. Les couvrir soigneusement avec un couvercle en verre et sceller le couvercle en verre avec un polissoir à ongles. Maintenant, il est prêt pour la microscopie confocale.

Résultats

Mtz traitement pendant 36 heures (A36h, A représente ablation) de 3,5 à 5 dpf réduit considérablement la taille du foie (figure 1B). Après Mtz lavage, considéré comme le début de la régénération du foie (R), forte fabp10a: CFP-NTR et fabp10a: expression DsRed réapparu dans les 30 heures (figure 1B). Le réseau des voies biliaires intra-hépatique, tel qu'évalué par l'expression de Alcam qui est présente dans la membrane du BEC ^22, d'abord effondrée mais a été ...

Discussion

Sévère, mais pas doux, hépatocytes ablation suscite conduit biliaire-régénération du foie. Par conséquent, après un traitement Mtz et lavage, il est important d'examiner la taille du foie de la larve Mtz-traité, qui peut être évaluée par fluorescence intrinsèque de la PCP fabp10a: CFP-NTR transgène. Comme un faible pourcentage de larves traitées Mtz affiche non-ablatée (0-5%) ou partiellement ablation (10-20%) des foies, il est essentiel de régler et d'analyser seulement les larves avec une très petite ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poudre d’ester éthylique d’acide 3-aminbenzoïque (tricaïne)	Sigma-Aldrich	A5040	Produire 0,4 % (15 mM) de tricaïne : Porter 0,4 g de tricaïne à 100 mL avec de l’eau d’œuf. Ajuster au pH 7.
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Métronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Formaldéhyde	Sigma-Aldrich	252549
Sulfate de calcium dihydraté	Sigma-Aldrich	C3771
N-Phénylthiourée (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Support de montage (Vectashield)	Vector Laboratories	H-1000
100 x 15 mm boîte de Pétri  ;	Denville Scientific Inc.	M5300
	Fisher Scientific	50949071
pince fine	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5  ;
lame de verre	Fisher Scientific	12-544-1
lamelle en verre	Fisher Scientific	12-540-A et 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5 (souris anti-Alcam)	ZIRC	zn-5	1:10
dilution chèvre anti-Hnf4a	Santa Cruz	sc-6556 (C-19)	1:50
dilution rat anti-RFP	Allèle Biotechnology	ACT-CM-MRRFP10	1:300 dilution
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-chèvre IgG (H+L)	Jackson laboratories	705-605-147	dilution 1:500
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-souris IgG (H+L)	Invitrogen	A21240	dilution 1:500
Cy3 âne anti-rat IgG	Jackson laboratories	712-165-150	:500
microscope de dissection	Leica Microsystems	S6F
microscope à épifluorescence	Leica Microsystems	M205FA
microscope confocal	Carl Zeiss	LSM700
eau d’œuf			0,3 g/L de sels marins ' Océan instantané et 0,5 mM de CaSO4 dans de l’eau distillée.   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
[en-tête]
10X PBS			25,6 g Na2HPO4· ; 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.  ; Porter à 1 L avec de l’eau distillée. Ajuster le pH 7. Autoclave pendant 20 min à 121° ;C.
1X PBSDT,			0,2 % Triton X-100 et 0,2 % DMSO dans 1 X PBS.
Tampon			30,2 g POINTES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Porter à 1 L avec de l’eau distillée. Ajustez le pH 7.
		bloquante	Mélangez 1 ml de sérum de cheval inactivé par la chaleur avec 9 ml de 1X PBSDT.