Article de méthode

Athymiques Rat Modèle d'évaluation des Engineered ligament croisé antérieur greffes

DOI :

10.3791/52797

⸱

26 mars 2015

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1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2Department of Bioengineering, University of California Los Angeles

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les modèles animaux sont des outils importants pour l’évaluation des greffons issus de l’ingénierie tissulaire. Cet article présente le protocole de préparation d’une greffe de polymère biodégradable électrofilé pour une utilisation dans l’ingénierie tissulaire du ligament croisé antérieur, ainsi qu’un protocole chirurgical pour l’implantation dans un modèle de rat.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La rupture du ligament croisé antérieur (LCA) est une lésion ligamentaire courante qui nécessite souvent une intervention chirurgicale car le LCA ne guérit pas bien sans intervention. Les stratégies de traitement actuelles comprennent la reconstruction ligamentaire par autogreffe ou allogreffe, qui ont chacune leurs limites associées. Ainsi, il y a un intérêt à concevoir un greffon issu de l’ingénierie tissulaire pour une utilisation dans la reconstruction du LCA. Nous décrivons la fabrication d’une greffe de polymère électrofilé pour une utilisation dans l’ingénierie tissulaire du LCA. Cette greffe de polycaprolactone est biocompatible, biodégradable, poreuse et composée de fibres alignées. Parce qu’un modèle animal est nécessaire pour évaluer une telle greffe, cet article décrit un modèle de rat athymique intra-articulaire de reconstruction du LCA qui peut être utilisé pour évaluer les greffons modifiés, y compris ceux ensemencés avec des cellules xénogéniques. Des résultats représentatifs d’histologie et de tests biomécaniques à 16 semaines postopératoires sont présentés, les greffons étant testés immédiatement après l’implantation et les LCA natifs controlatéraux servant de témoins. La présente étude fournit un modèle animal reproductible avec lequel évaluer les greffes de LCA issues de l’ingénierie tissulaire, et démontre le potentiel d’une approche de médecine régénérative pour le traitement de la rupture du LCA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rupture du ligament croisé antérieur (LCA) est une de la plupart des lésions ligamentaires du genou communes 1. Parce que la rupture de l'ACL est incapable de guérir sans intervention chirurgicale, les limitations dans les activités de la vie quotidienne ainsi que la participation à des activités sportives en voiture plus de 175 000 patients de subir une chirurgie chaque année 2, avec un coût estimé à un milliard de dollars par an 3. Actuellement, soit autogreffe ou allogreffe tendon est utilisé pour la reconstruction du ligament. Bien que les taux de réussite élevés peuvent être atteints à la fois avec autogreffe et allogreffe de remplacement, des complications graves sont associés à ces options de reconstruction 4. autogreffe de tissu est associé à morbidité du site donneur et est limité dans l'approvisionnement, en particulier en cas de re-rupture ou blessures multi-ligamentaire. D'autre part, le tissu d'allogreffe est liée à l'intégration de la greffe retardée, la réponse inflammatoire indésirable, risque infectieux théorique, et limité suppLy 5. Greffons non dégradables synthétiques ont été développés dans les années 1970 et 1980, mais ont été entravées par une rupture prématurée de greffe, les réactions de corps étranger, une ostéolyse et la synovite 6. À la suite de ces graves préoccupations, il n'y a actuellement aucun greffes synthétiques disponibles pour une utilisation clinique aux États-Unis.

En raison de ces limitations avec des options de greffons existants et aux développements récents de la biologie, l'ingénierie et la médecine régénérative, il ya eu beaucoup d'intérêt dans une solution de l'ingénierie tissulaire pour ACL greffage. Stratégies d'ingénierie tissulaire actuelles emploient des matériaux biologiques et synthétiques dégradables pour permettre la croissance du tissu hôte tout en évitant les contraintes liées à l'implantation permanente matière synthétique 7.

La polycaprolactone (PCL) est un polymère biodégradable qui est approuvé par la FDA pour un certain nombre d'applications médicales, y compris l'adhérence barrière et Pansement 8, qui a été used dans une grande variété d'applications, notamment vasculaire, os, du cartilage, des nerfs, la peau, et de l'ingénierie de tissu oesophagien 5,9-16. Biocompatibilité favorable, relativement longue in vivo de demi-vie, une résistance mécanique suffisante et une élasticité élevée contribue à la popularité de ce polymère dans l'ingénierie tissulaire. Dans un modèle de rongeur de la cicatrisation des plaies, implanté PCL électrofilé se est révélée être non immunogène et à intégrer dans le tissu local sans effets indésirables 13. Une image SEM de électrofilé PCL est illustrée à la figure 1.

Avec actuelle FDA normes de réglementation, l'efficacité et la sécurité dans les deux modèles petits et grands animaux qui serait nécessaire pour une PCL ou tout autre greffe ACL conçu pour se déplacer dans les essais cliniques aux États-Unis. En outre, des conditions in vivo peuvent souvent augmenter les propriétés d'un tissu greffé LCA in vitro d'ingénierie. Un modèle de rat de reconstruction du LCA autologue avec fléchisseur digitorum tendon du long a été décrit précédemment, dans lequel la LCA natif a été sectionné, du fémur et du tibia tunnels ont été forés, et la greffe a été adopté et maintenu en place avec une suture 17-22. Dans cet article, nous allons décrire une modification de ce modèle pour l'évaluation des remplacements ACL ingénierie plutôt que pour la reconstruction basée autogreffe (Figure 2).

Bien que de nombreux modèles animaux existent pour l'ingénierie tissulaire de ligament, le rat est avantageuse par rapport à de plus grands modèles pour un certain nombre de raisons. Ces avantages comprennent plus facile élevage et la manipulation, moins de considérations éthiques, et de 17,23 coût réduit. En outre, le modèle de rat a été largement utilisé comme modèle pour la régénération des tissus orthopédiques, y compris du cartilage, des tendons, os et l'ingénierie tissulaire 24. En particulier, les rats nude athymiques ont été choisis en raison de leur manque de réponse immunitaire à médiation cellulaire 25, permettant l'implantation éventuelle ocellules du donneur xénogéniques f dans ce modèle pour améliorer encore la greffe d'ingénierie à l'avenir. Dans le présent document des méthodes, nous décrivons la fabrication et l'implantation chirurgicale d'un acellulaire, greffé de polymère biodégradable dans un modèle de rat athymique de reconstruction du LCA.

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Protocole

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NOTE: Toutes les chirurgies animales ont été approuvés par le personnel vétérinaire et animale comité de l'utilisation locale avant de commencer les expériences.

1. Préparation de électrofilées polycaprolactone échafaudages

  1. Peser et dissoudre l'ester de qualité médicale à terminaison poly (ε-caprolactone) sous forme de granulés dans le 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol pour créer un 10% p / p de la solution polymère PCL. Laissez le bruit de solution en utilisant une plaque d'agitation pendant au moins 3 heures pour assurer une solution homogène.
  2. Electrospin la solution PCL pour créer un brassard de fibres PCL très alignés pour échafaudage fabrication.
    1. Préparer la configuration d'électrofilage dans une hotte chimique avec le ventilateur en tout temps. Il se agit d'une grande boîte acrylique qui servira de support à vide isolé pour le procédé d'électrofilage et présente des points d'entrée pour la solution source de PCL entraîné par une source de tension, le mandrin collecte de motorisation, et un orifice de vide. Nettoyez le Acryliboîte de c soigneusement avec de l'éthanol et de couvrir toutes les surfaces avec des feuilles de Parafilm pour éliminer toutes les impuretés qui peuvent compromettre la qualité du produit électrofilé.
    2. Charge environ 3 ml de la solution ci-dessus dans une seringue de 10 ml avec une extrémité franche 18 G, une aiguille de ½ pouce. Retirer les bulles d'air en poussant la seringue jusqu'à. Solution de verrouillage dans une pompe à seringue programmable. Insérer l'aiguille à travers un petit trou dans la surface acrylique tout en laissant environ ½ pouce de l'aiguille à l'extérieur de la boîte acrylique pour la fixation du fil de source de tension.
    3. Utilisez un 30 mm tournant tour mandrin le collecteur pour les fibres PCL très alignés; couvrir le mandrin hermétiquement avec une mince bande de papier d'aluminium. Verrouiller le mandrin dans le moteur sur le côté opposé de la boîte d'environ 15 cm de l'aiguille de la seringue.
    4. Insérer le tuyau en plastique dans l'orifice de vide et se connecter à la source de vide de la hotte. Allumez la source de vide et couvrir la boîte en acrylique avec un couvercle.
    5. Set le débit de la pompe de seringue programmable à 2,5 ml / h perfusion. Allumez le moteur pour faire fonctionner le mandrin à 3450 rpm et fixez le fil positif de la source de tension à la pointe de l'aiguille à l'extérieur de la boîte en utilisant une pince crocodile.
    6. Une fois la perfusion de la solution PCL a commencé, tourner sur la source de tension et réglé à une tension de fonctionnement de 20 kV.
    7. Infuser la solution pendant 12 min à créer une manchette homogène à partir de 0,5 ml de la solution PCL.
      NOTE: En moyenne, chaque revers a assez de matériel électrofilé pour créer deux feuilles de six bandes, qui peuvent être utilisés pour créer un total de trois à quatre couches échafaudages.
  3. Laser couper le brassard PCL pour former de multiples petites feuilles sur un VersaLaser Cutter 2.3 tourne à faible vide, 10,0 keV tension d'atterrissage, 6,4 mm distance de travail, et le diamètre de la sonde de 3,0.
    NOTE: Dans cet exemple, une conception assistée par ordinateur a été utilisé pour charger le coupe pour obtenir plusieurs feuilles de 1,5 mm x 35 mm x 150 um échafaudages avecrépartie uniformément 150 um de diamètre aux trous 15% de la surface des pores.
  4. Gravure plasma échafaudages PCL utilisant un nettoyeur à plasma pour induire une hydrophilie de la surface PCL avec une accélération d'ions. Réglez le vide à 450 mTorr et le traitement des échafaudages pendant 30 secondes à puissance élevée (29,6 W).
  5. Baigner les échafaudages à 70% d'éthanol dans un environnement stérile.
  6. Enduire les échafaudages individuels avec du collagène pour faciliter l'adhérence et la prolifération cellulaire in vivo.
    1. Créer une solution de revêtement de collagène par dilution d'une 8: solution stérile de 2,5 Purecol collagène de 3 mg / ml de solution standard, 10x PBS et 0,1 N de NaOH 1: 9 à 1 1 x PBS à 4 ° C. Mélanger soigneusement pour assurer l'homogénéité solution.
    2. Manteau individuelle 1,5 mm x 35 mm x 150 um échafaudages avec un film en couche mince de la solution de collagène ci-dessus. Laisser sécher pendant 24 heures dans un environnement stérile.
  7. Utilisation 5-0 sutures Vicryl, empiler et apposer quatre individuelle 1,5 mm x 35 mm x 150 um échafaudagesutilisant un Krackow le point de créer un 0,6 mm d'épaisseur finales multicouche, échafaudage, revêtue de collagène qui est prêt pour l'implantation.

2. Protocole de Chirurgie Rat

  1. Induire une anesthésie en plaçant rat dans la chambre d'inhalation et offrant 2% d'isoflurane avec 2 L / min d'oxygène. Confirmez le rat est anesthésié correctement en appliquant une pression à Hind pied et d'évaluation pour toute réponse.
  2. Sur la table de retour non stérile, injecter sous-cutanée de 25 mg / kg ampicilline et 0,03 mg / kg de buprénorphine.
  3. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux. Clip de la fourrure de la patte postérieure opératoire et prép le site chirurgical avec trois gommages alternées de chlorhexidine et 70% d'éthanol.
  4. Transférer le rat à la table d'opération, sur un bloc chauffé pour éviter l'hypothermie. Nez sécurisé cône, et de maintenir l'anesthésie par la procédure avec 2% d'isoflurane dans 2 L / min d'oxygène, livré cône de nez. Drapé de manière stérile, en laissant la branche opératoire exposé.
  5. Avant de commencer l'opération, d'abord confirmer anesthésie adéquate par le manque d'une réponse à la pression du pied de derrière.
  6. Faire une incision verticale médiane 2 cm de long pour le genou, centrée au niveau de la rotule. Rentrer la peau latéralement jusqu'à l'incision est centrée sur le genou.
  7. Utiliser un scalpel pour faire une arthrotomie parapatellaire interne en coupant simplement en dedans de la rotule et se étendant de manière proximale au niveau de la jonction musculo du quadriceps et de manière distale au niveau de l'insertion du tendon rotulien sur le tubercule tibial. Prenez soin de ne pas couper les tendons rotuliens ou quadriceps.
  8. rotule de sortie latéralement en faisant une incision verticale de 1 cm à travers la capsule du genou juste en dehors du tendon rotulien.
  9. Se assurer que le genou est en extension. Prenez une paire de ciseaux fins et passer sous la rotule de dehors en dedans. Étaler les ciseaux à quelques reprises afin que le mécanisme extenseur peut être traduit de chaque côté.
  10. Bien que la flexion til genou, la rotule traduire latéralement pour exposer l'intérieur de l'articulation du genou. Assurer une visualisation claire de l'échancrure intercondylienne et condyle fémoral. Avec un scalpel, sectionner l'ACL et PCL dans l'encoche.
  11. Charge perceuse avec un k-fil 1,6 mm. Placez la pointe k-fil sur l'origine ACL dans l'échancrure intercondylienne. Percer superolaterally et de visualiser le point de sortie sur l'aspect externe du fémur, en supprimant toute tissus mous que nécessaire avec un scalpel. Passez le k-fil et à quelques reprises pour assurer le passage clair pour la greffe.
  12. Placez le k-fil sur l'empreinte ACL sur le plateau tibial. Percer antéro-externe et visualiser point de sortie sur le tibia proximal antérolatérale. Utilisez scalpel pour effacer tissus mous que nécessaire pour que le point où le k-fil sort du tibia est totalement visible.
  13. Passez une aiguille Keith raccourcie (idéalement pas plus de deux pouces de long) à travers le tunnel de fémur. Faire passer les deux extrémités de suture de l'une des extrémités de la greffe dans le chas de la Kaiguille de eith. Utilisation de l'aiguille pour tirer une extrémité du greffon dans le tunnel fémoral.
  14. Répéter l'étape précédente pour passer l'autre extrémité du greffon dans le tunnel tibial.
  15. Utilisez 4-0 Vicryl suture pour fixer la fin fémorale de la greffe de périoste entourant ou autre tissu mou avec un point figure-de-huit. Manuellement la tension de la greffe avec le genou en extension. Apposer la fin tibial de la greffe de périoste entourant ou autre tissu mou avec un point figure-de-huit.
  16. Utilisez une paire de ciseaux pour couper l'excès de greffe sur les deux extrémités, laissant 1-2 mm à chaque extrémité passé le point figure-de-huit.
  17. Étendre le genou et réduire la rotule. Utilisation 4-0 vicryl, placer un seul point figure-de-huit pour fermer la capsule articulaire médial, empêchant subluxation latérale de la rotule.
  18. Fermez la peau avec un subcuticulaire 5-0 Monocryl ou Vicryl surjet, avec soin de ne pas suturer le muscle sous-jacent ou avoir une suture visible une fois la peau est fermée.
  19. Injerats ct voie sous-cutanée avec la buprénorphine tous les 12 h pour un total de trois jours après l'opération. Vérifiez site chirurgical pour tout drainage ou déhiscence de la plaie au moment de l'injection. Boiteux et peu d'enflure sont normaux dans les premiers jours après la chirurgie, mais rapidement répondre aux préoccupations postopératoires en collaboration avec le personnel vétérinaire. L'animal peut être revenir à un logement social à deux semaines après l'opération, lorsque les incisions chirurgicales sont complètement guéries.

3. Protocol Data Collection

  1. Au moment du sacrifice, asphyxier rats individuellement dans une enceinte fermée de CO 2 suivie d'une thoracotomie.
  2. Récolter deux membres chirurgicalement reconstruits et controlatérale en séparant à l'articulation de la hanche.
    1. Pour les membres reconstruits, enlever tous les tissus mous, y compris le ligament croisé postérieur et les restes de la LCA natif chirurgicalement perturbé, par dissection fine pour isoler seulement le fémur, le tibia et la greffe.
    2. Pour les membres controlatéraux, enlever tous les tissus mous à l'exception du LCA natif ainsi que le fémur et le tibia par dissection fine.
    3. Utilisation d'un outil rotatif tel que Dremel, pour supprimer tout sauf ¾ de 1 cm de l'os à partir de chaque extrémité de l'ensemble fémur-tibia par greffage.
    4. Au cours de ce processus et tout au long tests biomécaniques, régulièrement et fréquemment pulvériser les régions ligamentaires avec du sérum physiologique pour éviter la dessiccation du genou récoltée qui peuvent modifier les résultats faussement.
  3. Pour l'analyse histologique, fixer chaque genou individuellement dans une solution de paraformaldehyde à 4% à 25 ° C pendant 48 heures. Ensuite, plonger le genou dans une solution de réactif pour Immunocal décalcification complète; ce processus dépend du contenu calcifiés de l'échantillon et peut prendre jusqu'à cinq jours. Vérifiez échantillons individuels par jour pour évaluer les progrès que décalcification incomplète peut réduire la qualité de l'échantillon. Une fois terminé, effectuez la coupe, montage à glissière, et la coloration comme souhaité.
  4. Perform tests biomécaniques pour évaluer la capacité fonctionnelle du ligament de l'ingénierie tissulaire.
    1. Fixez le fémur et le tibia en enveloppant 28 G fil d'acier galvanisé autour de l'épiphyse de chaque os séparément. Ce est pour éviter que les données de tests biomécaniques inexactes de rupture en traction prématurée de l'échantillon à l'os plutôt qu'à le ligament d'intérêt.
    2. Pot fémur dans un mélange de ciment polyméthylméthacrylate (PMMA) de l'os. Pour ce faire, mélanger les deux composants du ciment et d'utiliser immédiatement le mélange visqueux pour sécuriser le fémur dans le métal, recouvrant complètement la diaphyse de l'os dans le pot cimentée avec l'épiphyse et le ligament fixé librement saillante. Laisser polymérisation radicalaire spontanée de transformer progressivement les composants mixtes visqueux à un matériau pâteux et finalement dans une matrice durcie solide.
      NOTE: Ce processus prend plusieurs minutes et peut être contrôlée en étudiant manuellement la température d'un bolus fabriqué à partir dele ciment restant; la température doit augmenter de manière transitoire au cours de la réaction de polymérisation exothermique et se abaisser à la température ambiante après la solidification de matériaux.
    3. Répétez le même processus ci-dessus pour cimenter le tibia, sauf tout en conservant le ligament du genou à 20 ° de flexion pour les essais mécaniques idéale.
    4. Monter le complexe fémur, tibia cémenté par greffage sur un appareil d'essai de traction, et pour préparer la charge d'enregistrement et de déplacement en fonction du temps à partir du début de la tension à l'échec. Dans cet exemple, nous avons utilisé un modèle Instron 5564 avec une cellule de charge de 1 kN.
    5. Pré-tension de la greffe à 2 N à un débit de 0,5 N / min rampe et ensuite tester la greffe à l'échec à une vitesse de 0,5 mm / s souche. Pendant le processus, assurez-vous que le ligament ne parvient pas à la mi-substance et que le fémur et le tibia sont osseuse sécurisé et pas prématurément à défaut, qui peut évaluer à tort propriétés biomécaniques du ligament testé.
    6. Utilisez la charge déplacement générécourbes pour calculer la charge de rupture et la raideur du ligament testé.

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Résultats

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Dans notre expérience de 92 chirurgies de rat par un seul chirurgien, le temps moyen de fonctionnement de l'incision à l'achèvement de la plaie était de 16,9 min, avec un écart type de 4,7 min. Au moment du sacrifice, les rats pesaient 356 ± 23 g. Tous les rats ont toléré la chirurgie bien, et ont connu aucune complication. Immédiatement après la chirurgie, les rats ont été notés à porter le poids sur l'extrémité opérationnelle, mais présentaient une légère claudication. D'une semaine post-opératoire, to...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ACL blessures sont une condition commune en chirurgie orthopédique de sport, avec des options limitées pour la reconstruction à l'heure actuelle. Afin de développer un substitut d'ingénierie tissulaire appropriée pour l'ACL qui permettra la régénération in vivo, un modèle animal approprié est nécessaire. Dans cette étude, la fabrication d'un greffon conçu biodégradable est décrite, de même que son implantation in vivo en utilisant un modèle de reconstruction du LCA reproductible dans un...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier Gabriel Arom et Michael Yeranosian pour leurs contributions techniques aux itérations précédentes de ce projet. Ce projet a été financé par le clinicien-chercheur Grant formation OREF (NL), HH Lee Surgical Research Grant (NL), Veterans Administration BLR & D examen du mérite une I01 BX00012601 (DM) et l'appareil locomoteur transplantation Fondation Prix du jeune chercheur (FP).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Poly(ε-caprolactone) médical, terminé par un groupe ester, sous forme de granulés (masse moléculaire = 110 000)figure-materials-1 Lactel Absorbable PolymersPolymère synthétisé sur mesure à la masse moléculaire souhaitée
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanolSigma-Aldrich105228Solvant pour le polymère PCL
Aiguille biseautée 18 G x 1½"BD Medical305196
Pompe à seringue programmable pour infusion/ponction à distanceHarvard Apparatus702101
Graveur laser VersaLaser VLS2.30Microgeo USAVLS2.30
Nettoyeur à plasma élargi 115 VHarrick PlasmaPDC-001Gravure au plasma juste avant le revêtement de collagène pour modification de surface
Solution standard de collagène PureCol, 3 mg/mlAdvanced Biomatrix5015-APréparer une solution 8:1:2,5 de PureCol, PBS 10x, NaOH 0,1 N 1:9 dans du PBS 1x
Fil de suture, Vicryl 5-0Henry Schein1086471
Fil de suture, Vicryl 4-0Henry Schein6540072
Ciseaux de dissection à pointe fine (droits ; 4,5 pouces)Fisher Scientific8940
Chlorhydrate de buprénorphineSigma-AldrichB9275Utiliser 0,03 mg/kg à la fois pendant et après l'intervention pour le contrôle de la douleur
Ampicilline, injectableHenry Schein1185678Utiliser 25 mg/kg par voie sous-cutanée pendant l'intervention
Broche de Kirschner, 1,6 mmSpectrum SurgicalSI040062
Aiguille de Keith, droite 1½"Delasco Dermatology Lab & SupplyKE-112
Solution décalcifiante ImmunocalFisher ScientificNC9491030
Ciment osseux en résine acrylique Opticryl (PMMA) (monomère et polymère)US Dental DepotOPTICRYL 100410 
Machine d'essai de traction Instron modèle 5564Instron5564Tout appareil d'essai de traction comparable convient

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Greffon d ing nierie tissulairechafaudage polym re lectrofilGreffon en polycaprolactoneReconstruction du LCAEssais biom caniquesAnalyse histologiqueEnsemencement de cellules x nog niquesTechnique chirurgicale

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