Déclenchement réactive Gliose<em&gt; In Vivo</em&gt; Par un cerveau antérieur Stab blessures

Résumé

Cet article décrit un protocole détaillé pour produire une lésion par arme blanche au cerveau antérieur chez les souris adultes. La blessure par arme blanche induit une gliose réactive sévère et la formation de cicatrices gliales qui peuvent ensuite être examinées par des méthodes d’immunohistochimie standard.

Résumé

Suite à une lésion du SNC, les astrocytes subissent un large éventail de changements biochimiques, morphologiques et moléculaires collectivement appelés astrogliose réactive. Les astrocytes réactifs exercent à la fois des effets inflammatoires et protecteurs qui inhibent et favorisent, respectivement, la réparation neuronale. Les mécanismes sous-jacents aux diverses propriétés fonctionnelles de l’astrogliose réactive ne sont pas bien compris. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est essentielle pour développer des stratégies thérapeutiques visant à traiter le SNC blessé. Ici, nous démontrons une méthode pour déclencher l’astrogliose réactive dans le cerveau antérieur de souris adulte en utilisant une lésion de couteau du cerveau antérieur. Ce modèle de lésion est simple, fiable et ne nécessite qu’un appareil stéréotaxique et une lame de scalpel pour produire la blessure. L’utilisation des lésions de stab comme modèle de lésion dans le cerveau antérieur est bien établie et se prête à des études portant sur un large éventail de résultats neuropathologiques, tels que la dégénérescence neuronale, la neuroinflammation et les perturbations de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Ainsi, le modèle de blessure au couteau du cerveau antérieur constitue un outil puissant qui peut être appliqué à un large éventail d’études sur la réponse du SNC aux traumatismes.

Introduction

Un défi majeur pour développer des thérapies efficaces pour traiter le SNC blessé est une compréhension incomplète des événements multicellulaires complexes qui sont déclenchés par le traumatisme. Les astrocytes réactifs sont de plus en plus reconnus comme une cible prometteuse pour de nouvelles thérapies¹. Bien qu’historiquement considérés comme hostiles à la réparation neuronale, les astrocytes réactifs sont maintenant reconnus comme des composants essentiels d’une réponse neuroprotectrice multicellulaire complexe qui comprend l’atténuation des processus inflammatoires et la limitation des dommages secondaires et de la neurodégénérescence^2-6. Bien que les caractéristiques neuropathologiques de la gliose réactive soient bien définies depuis longtemps, les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la gliose réactive et la diversité des conséquences en aval restent mal compris. Comprendre les mécanismes qui régissent la gliose réactive, ainsi que les événements cellulaires et moléculaires qui en découlent, est une étape importante vers le développement de stratégies visant à promouvoir les propriétés neuroprotectrices de la gliose réactive, tout en atténuant les effets néfastes.

Ici, nous démontrons une méthode pour induire une astrogliose réactive sévère dans le cerveau antérieur de souris adultes en utilisant une blessure à l’arme blanche. Contrairement à d’autres modèles de lésions cérébrales traumatiques (TCC), tels que l’impact cortical contrôlé (CCI) ou la lésion par percussion fluide (FPI), qui nécessitent un équipement spécialisé pour produire une blessure, le coup de couteau au cerveau antérieur ne nécessite qu’un dispositif stéréotaxique pour stabiliser la tête et une lame de scalpel n ° 11. Ainsi, le modèle de lésion du cerveau antérieur est plus largement accessible à un large éventail de laboratoires qui n’ont pas accès aux dispositifs spécialisés nécessaires pour créer une lésion FPI ou CCI. La méthode décrite ici permet aux chercheurs de déclencher de manière fiable et reproductible une réponse de gliose robuste pour étudier les événements cellulaires et moléculaires ultérieurs. Une fois rétablis de l’opération, les animaux qui ont subi une blessure au couteau au cerveau antérieur peuvent survivre pendant de longues périodes sans avoir besoin de soins spécialisés et peuvent être renvoyés à la colonie pour des études aiguës, intermédiaires ou chroniques. Bien que moins traduisible cliniquement que les modèles FPI ou CCI de TCC, une lésion du cerveau antérieur produite par une blessure au couteau sert de modèle expérimental simple mais utile pour étudier les mécanismes biologiques de base sous-jacents à la gliose réactive et à d’autres événements neuropathologiques à la suite d’un traumatisme du SNC.

Protocole

Adulte (3-4 mois) sur des souris mâles un mixte C57BL / 6 fond ont été utilisés dans ce protocole. Les animaux ont été maintenus sur un cycle de 12 heures de lumière / obscurité, et ont permis l'accès libre à la nourriture et de l'eau. Toutes les procédures effectuées dans ce protocole ont été menées selon des protocoles approuvés par le Comité soin et l'utilisation Drexel University animaux dans les institutions.

1. Préparation zone chirurgicale

1. Désinfecter table chirurgicale avec 70% d'éthanol, puis couvrir l'ensemble du banc chirurgicale avec des tampons absorbants et d'organiser les instruments chirurgicaux adjacent à stéréotaxique.
2. Mettre en place l'équipement stéréotaxique sans bras manipulateur. Disposer le coussin chauffant sur la stéréotaxique et mettre à 37 ° C. Éviter la surchauffe de l'animal en plaçant un petit morceau de serviette en papier ou un tampon chirurgical entre l'animal et le coussin chauffant.
3. Avec des ciseaux autoclave, couper des petits morceaux de gelfoam autoclave dans une boîte de Pétri stérile contenant une solution saline à 0,9% stérile jusqu'à ready à l'emploi.
   Remarque: Maintenir un environnement de travail stérile en utilisant des instruments à l'autoclave et des fournitures chirurgicales stériles. Re-stériliser des instruments chirurgicaux au cours de la procédure ou entre les animaux par trempage dans un stérilisateur à billes pendant 10 à 15 secondes, selon les besoins. Maintenir des gants propres tout au long de la procédure en frottant les mains avec de l'éthanol 70%, au besoin, à désinfecter.

2. Prepping souris pour la chirurgie

1. Retirer la souris de la maison cage et peser (g).
2. Placez la souris dans la chambre de l'induction de l'isoflurane et définir l'oxygène à 2 L / min et du vaporisateur isoflurane à 5 pour induire un plan chirurgical d'anesthésie, environ 3-5 min. Surveiller les ralentissement de la respiration et de l'immobilisation. Vérifiez que la souris est entièrement sous sédation en utilisant le réflexe orteil de pincement.
3. Lorsque la souris est entièrement sous sédation, placer dans un cadre stéréotaxique, sécuriser le nez dans le cône de nez, qui est attaché avec des tubes à l'isoflurane. Insérez barres d'oreilles dans le canal auditif et serrer, assurant la tête est stable.
4. Raser la tête de l'oreille à l'oreille, et d'entre les yeux derrière les oreilles.
5. Stériliser la peau avec des lingettes alternées de l'alcool isopropylique et une solution d'iode bétadine, trois fois chacun.
6. Appliquer des larmes artificielles pour les deux yeux pour les empêcher de se dessécher pendant la procédure chirurgicale.

3. Procédure chirurgicale

1. Surveiller la profondeur de l'anesthésie en pinçant l'orteil ou la queue. La souris est dans le plan chirurgical approprié lorsqu'il n'y a pas de réponse, et la respiration est lente et uniforme.
2. Faire une incision de la peau parasagittale partir juste derrière les yeux à peu près entre les oreilles en un seul mouvement ferme à l'aide d'une lame de bistouri n ° 11. Déplacez la peau de côté et le clip côté droit avec hémostatique.
3. Effacer le crâne de la membrane recouvrant utilisant le côté mat de la n ° 11 scalpel et applicateurs coton-tige. Eventuellement, essuyez le crâne avec du coton-tige trempé dans une solution saline à 0,9%. Laisser sécher complètement.
4. Nousing une petite règle, marquer le bord antérieur de la craniotomie à 1 mm caudale à la suture coronale, et le bord gauche de la craniotomie à 1 mm latéral à la suture sagittale (Figure 1), avec un marqueur permanent. Ensuite, marquez les bords droit et caudales de la craniotomie à 4 mm des sutures sagittale et coronale, respectivement (figure 1).
5. Utiliser un foret de 0,5 mm, commencer à faire craniotomie en perçant lentement en suivant le contour de marqueur permanent. Soyez sûr de ne pas briser le crâne complètement. Appuyez doucement sur la pièce isolée de l'os pariétal avec n ° 5 forceps, les zones de faiblesse cédera à la pression. Lorsque l'os amincie est suffisamment faible tout au long du périmètre, le morceau d'os est prêt à être retiré.
   NOTE: Si l'expérience d'enquêteur des difficultés à retirer l'os dans une seule pièce, ce qui suggère que l'os n'a pas été suffisamment éclairci au cours du forage. Considérez le forage du crâne en outre chez les animaux ultérieures facilitaenlèvement facile te de la pièce d'os.
6. Utiliser une seringue de 10 ml munie d'une aiguille 23 G, appliquer une petite quantité de solution saline 0,9% à tremper l'os isolé et zone percée.
7. Fixez le bras manipulateur à l'équipement stéréotaxique. Fixez une nouvelle lame de bistouri n ° 11 à la porte de la sonde avec le côté tranchant de la lame face rostralement.
   Remarque: bien que les tissus rostrale et caudale expérience des arêtes vives et émoussée de la lame, respectivement, les dommages mécaniques induites par la blessure pénétrante est comparable tout au long de l'étendue de la lésion. Nous observons aucune différence appréciable dans les grandes caractéristiques de gliose réactive, y compris la régulation positive de l'expression de la GFAP ou la prolifération, entre les sections rostrale et caudale.
8. Garder le bras manipulateur de la route, soulevez délicatement l'os isolé en utilisant une pince à angle 5/45. Insérez le bout de la pince dans le côté de l'os et un ascenseur isolé, en utilisant l'effet de levier pour retirer le morceau d'os laissés dans un full mouvement.
   NOTE: Attention à ne pas poignarder le cerveau ou perturber la dure sous le crâne.
9. Prenez un petit morceau de la mousse de gel absorbable trempé et le placer sur le cerveau à découvert pour l'empêcher de sécher et absorber le sang qui pourrait être présente.
10. Une fois la mousse de gel est en place, balancer le bras manipulateur en place et régler la lame au centre de la craniotomie sur la mousse de gel. Retirez la mousse de gel et abaisser la lame jusqu'à ce que la pointe touche la dure sans perforation de la dure-mère. Mark dorsale / ventrale coordonnées en utilisant le vernier sur le bras vertical de la stéréotaxique.
11. Utilisation du bras manipulateur, abaissez lentement la lame précisément 3 mm dans le cerveau. Ceci est réalisé à l'aide des graduations coulisse sur le bras de manipulateur. Laisser la lame de rester en place pendant 5-10 sec. Déplacez le bras stéréotaxique avec l'attachement de lame rostrale à caudale trois fois la lame permettant d'atteindre les limites rostrale et caudale de la craniotomie avant de passer à l 'oppositionte fin.
    REMARQUE: La dure-mère est pas éliminé avant l'insertion de la lame. A la différence de la dure-mère chez le rat, qui est d'environ 80 um d'épaisseur ^7, la dure-mère de la souris est considérablement plus mince (quelques couches de cellules d'épaisseur) et ne produit pas une résistance appréciable à la lame de scalpel pendant l'insertion. Utiliser une nouvelle lame de scalpel pour chaque souris pour que chaque animal reçoit une blessure cohérente.
12. Soulevez lentement le bras stéréotaxique, retirer la lame du cerveau. Après le retrait de la lame, placer immédiatement un autre morceau de gelfoam sur la surface du cerveau d'absorber toute l'excès de sang ou de liquide.
13. Pendant ce temps, retirez le bras stéréotaxique et de disposer de la lame de bistouri n ° 11. Une fois que le saignement a cessé, retirez le gelfoam.
14. Fermer la plaie par suture la peau avec une suture non résorbable, comme Ethilon ou prolène. Sutures doivent être retirés 9-10 jours après la chirurgie.
15. Retour de la souris à sa cage, et laissez la souris pour récupérer lentement sur une heatinpad g et moniteur pour des signes de détresse. Récupération de l'anesthésie induite isofluorane-se produit généralement dans les 2-5 min après le retrait de la isofluorane. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait retrouvé décubitus sternale.
16. Administrer 0,5-1 ml de lactate sous-cutanée de la solution de Ringer pour assurer une hydratation.

4. Soins post-opératoire

1. Surveillez attentivement les animaux post-opératoire jusqu'à la récupération de l'anesthésie avant de retourner à la colonie.
   1. Pour réduire la douleur et l'inconfort post-opératoire, administrer 0,05-0,1 mg / kg buprénorphine par injection ip immédiatement après la procédure.
   2. Observez les animaux pendant 2-3 jours après l'opération pour des signes graves de détresse tels que les mouvements limités, absence de toilettage, ou la perte de poids. Euthanasier des animaux qui présentaient une de ces signes de détresse et de retirer de l'étude.
2. Pour examiner l'histopathologie des tissus blessés, euthanasier les animaux par stanperfusion intracardiaque dard.
   1. En bref, anesthésier les animaux avec une surdose de kétamine / xylazine, puis intracardiaque perfusé avec 15 à 20 ml de NaCl à 0,9%, ou jusqu'à ce que le foie est effacé de sang, suivie de 60 ml de paraformaldehyde à 4% à la fin de l'expérience.
3. Disséquer le cerveau et post-correctif pour 2-4 heures dans 4% de paraformaldehyde avant de transférer à la solution de saccharose à 30%. Section cerveaux sur un cryostat à 40-60 um, et le processus de procédures histologiques ou immunohistochimiques standard, ou comme décrit dans Garcia ^8,9.

Résultats

Parce que les animaux soumis à cette procédure ne nécessitent pas de périodes de survie soins post-opératoires spécialisés, à court ou à temps à long terme sont facilement incorporés dans l'étude, en fonction de la nécessité d'étudier la pathologie aiguë ou chronique suite à une blessure. Principales caractéristiques de gliose réactive, tels que la régulation positive de la GFAP et l'hypertrophie du soma, peuvent être observés dès 2-3 jours après la blessure. La phase pic de la prolifération des astrocytes r...

Discussion

Il est essentiel que le crâne ou de la dure sous-jacent ne sont pas endommagés pendant le forage. Utilisez une légère pression pendant le forage pour assurer le crâne est pas percé. En outre, il faut prendre soin tout en soulevant la pièce de crâne pour assurer la dure-mère n'a pas décollé avec l'os.

La blessure du cerveau antérieur de couteau décrit ici des modèles d'une blessure pénétrante au SNC. Bien que moins traduisible cliniquement que les modèles de TBI tels que FPI ou de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Stereotax	Harvard Apparatus	726049
Micro perceuse à grande vitesse	Harvard Apparatus	724950
lame de scalpel en acier inoxydable, pince coudée #11	MedVet	JOR581S
5/45	Fine Science Tools	11251-35
Éponge Gelfoam 12 cm x 7 mm	Fisher	NC9841478
Rb anti-GFAP	DAKO	; Z033429-2	Dilution - 1:20 000 (fond clair) ; 1:1 000 (fluorescence)
Shp anti-BrdU	Abcam	ab1893	Dilution - 1:20 000 (fond clair) ; 1:500 (fluorescence)
Chèvre biotinylée anti-lapin	Vector Laboratories	BA-1000  ;	Dilution - 1:400 (fond clair)
Lapin biotinylé anti-mouton	Vector Laboratories	BA-6000	Dilution - 1:400 (fond clair)
Alexafluor 488 chèvre anti-lapin	Life Technologies	A-11008	Dilution - 1:400 (fond clair)
Alexafluor 568 âne anti-mouton	Life Technologies	A-21099	Dilution - 1:1 000 (fluorescence)
DAPI Acide nucléique	Stain Life Technologies	D3571	Dilution - 1:1 000 (fluorescence)
Acétate de crésyle violet	Sigma Aldrich	C5042-10G	Dilution - 1 % (fond clair)