Article de méthode

Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

DOI :

10.3791/52840

⸱

16 août 2015

 , 
1Centre for Cancer Research, Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit l'utilisation de bromodésoxyuridine (BrdU) absorption pour permettre le suivi temporel des cellules qui étaient en phase S à un moment précis dans le temps. Addition de colorants d'ADN et de l'étiquetage d'anticorps facilite l'analyse détaillée du sort des cellules en phase S au temps plus tard.

Résumé

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Ce protocole décrit une méthode permettant le suivi des cellules tout au long du cycle cellulaire sans qu’il soit nécessaire de synchroniser les cellules. La synchronisation des cellules peut s’avérer difficile pour de nombreux systèmes de cellules. La pratique standard consiste à bloquer la progression du cycle cellulaire à un stade spécifique, puis à libérer les cellules accumulées, produisant une vague de cellules progressant à l’unisson dans le cycle. Cependant, certains types de cellules trouvent ce bloc toxique, ce qui entraîne un cycle cellulaire anormal, voire une mort massive. L’absorption de la bromodéoxyuridine (BrdU) peut être utilisée pour suivre l’étape du cycle cellulaire des cellules individuelles. Les cellules incorporent cet analogue synthétique de la thymidine, tout en synthétisant de l’ADN nouveau pendant la phase S. En fournissant BrdU pendant une brève période, il est possible de marquer un groupe de cellules qui étaient en phase S pendant que le BrdU était présent. Ces cellules peuvent ensuite être suivies tout au long du reste du cycle cellulaire et jusqu’au prochain cycle de réplication, ce qui permet de déterminer la durée des phases du cycle cellulaire sans qu’il soit nécessaire d’induire un blocage du cycle cellulaire potentiellement toxique. Il est également possible de déterminer et de corréler l’expression des protéines internes et externes au cours des étapes ultérieures du cycle cellulaire. Ceux-ci peuvent être utilisés pour affiner l’attribution de l’étape du cycle cellulaire ou évaluer les effets sur d’autres fonctions cellulaires telles que l’activation du point de contrôle ou la mort cellulaire.

Introduction

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L'évaluation des caractéristiques du cycle cellulaire et les changements qui se produisent dans les cellules au cours de la progression du cycle cellulaire est fondamentale pour comprendre de nombreux aspects de la biologie, en particulier la biologie du cancer. De nombreux agents de développement pour le traitement de tumeurs malignes ont des effets profonds sur la progression du cycle cellulaire ou induire la mort cellulaire par l'intermédiaire de mécanismes dépendants-du cycle cellulaire. Afin d'étudier la dynamique du cycle cellulaire ou des cellules dans une phase particulière du cycle cellulaire, il est usuel de synchroniser les cellules. Cependant,....

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Protocole

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Le protocole décrit ici utilise la lignée cellulaire lymphoblastique leucémie aiguë NALM6 mais peut être appliquée à d'autres types de cellules.

1. Les solutions et réactifs

  1. RPMI complet
    1. Ajouter 56 ml de sérum de veau foetal (FCS) et 5,5 ml de 200 mM de L-glutamine à une bouteille de milieu RPMI-1640 500 ml.
  2. BrdU Stock Solution
    1. Préparer 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS).
  3. BrdU complet RPMI
    1. Ajouter 6,2 ul de BrdU solution stock à 10 ml de RPMI complet.
  4. Solution de DNase
    1. Prépare....

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Résultats

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Cette méthodologie peut être utilisée pour obtenir une série d'informations. Quelques applications sont décrites ici.

L'évaluation de la durée du cycle cellulaire

Pour déterminer le temps nécessaire pour les cellules de transit à travers le cycle cellulaire, les cellules sont récoltées à divers points de temps suivants l'impulsion de BrdU. Les intervalles entre les évaluations peuvent être adaptés à des cellules particulières en cours d'analyse. Des lignées de ce.......

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Discussion

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La capacité d'analyse du cycle cellulaire est importante pour la compréhension de la biologie du cancer et le mécanisme d'action de ces deux médicaments et les gènes qui influencent la prolifération cellulaire et la croissance. Bien qu'il existe une multitude de dosages qui mesurent la prolifération cellulaire aurait, dont la majorité ne fournissent une mesure qui indique les cellules numériques présents. Ceux-ci comprennent des dosages qui mesurent le nombre de cellules par visualisation directe et le dépou.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les travaux ont été financés par la Société de leucémie et de lymphome des États-Unis (6105-08), une subvention du Cancer Council NSW (13-02), une bourse de recherche senior du NHMRC (LJB) (1042305) et une subvention de projet (1041614).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de débit APC BrdUBD Biosciences552598contient de l’anticorps BrdU, du 7-AAD et un tampon BD Cytofix/Cytoperm
(appelé tampon de fixation)
Tampon de perméabilisation BD Cytoperm PlusBD Biosciences561651désigné sous le nom de tampon de perméabilisation
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences554723appelé tampon de lavage
DNaseSigmaD-4513
BD Falcon 12 x 75  ; mm Tubes FACSBD Biosciences352008
BD Pharmingen Stain BufferBD Biosciences554656
BD LSR FORTESSA Cytomètre en fluxBD BiosciencesFORTESSA
PipetmanGilsonP2, P20, P100, P1000
RPMI 1 640 w/o L-Gln 500 mlLonza12-167F
DPBSLonza17-512F
Sérum fœtal bovinFisherBiotecFBS-7100113
L-GlutamineSigmaG7513-100ML
5-Bromo-2&prime ;-deoxyuridineSigmaB5002-1G
Falcon TC 150  ; cm2 flacons ventilésBD Biosciences355001
Pipettes 25  ; mlGreiner760180
Pipettes Aersol 200  ; et micro ; lInterpath24700
Pipettes Aersol 1  ; mlInterpath24800
CentrifugeuseSpintronGT-175R
CO2BinderC 150
AF488 anti-histone H3 Phospho (Ser10)Signalisation cellulaire9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Signalisation cellulaire mAb2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) ( 133D3) Signalisation cellulaire d’anticorps monoclonaux de lapin2348S
NALM6  ;DSMZACC-128
anticorps lapin

Références

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  1. Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
  2. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  3. Harper, J. W., Elledge, S. J.

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Mots-clés

Absorption de BrdUsuivi de la phase Sanalyse du cycle cellulairesynth se de l ADNsynchronisation cellulaireexpression prot iqueactivation des points de contr lemort cellulaire

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