Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

Summary

Ce protocole décrit l'utilisation de bromodésoxyuridine (BrdU) absorption pour permettre le suivi temporel des cellules qui étaient en phase S à un moment précis dans le temps. Addition de colorants d'ADN et de l'étiquetage d'anticorps facilite l'analyse détaillée du sort des cellules en phase S au temps plus tard.

Abstract

Ce protocole décrit une méthode permettant le suivi des cellules tout au long du cycle cellulaire sans qu’il soit nécessaire de synchroniser les cellules. La synchronisation des cellules peut s’avérer difficile pour de nombreux systèmes de cellules. La pratique standard consiste à bloquer la progression du cycle cellulaire à un stade spécifique, puis à libérer les cellules accumulées, produisant une vague de cellules progressant à l’unisson dans le cycle. Cependant, certains types de cellules trouvent ce bloc toxique, ce qui entraîne un cycle cellulaire anormal, voire une mort massive. L’absorption de la bromodéoxyuridine (BrdU) peut être utilisée pour suivre l’étape du cycle cellulaire des cellules individuelles. Les cellules incorporent cet analogue synthétique de la thymidine, tout en synthétisant de l’ADN nouveau pendant la phase S. En fournissant BrdU pendant une brève période, il est possible de marquer un groupe de cellules qui étaient en phase S pendant que le BrdU était présent. Ces cellules peuvent ensuite être suivies tout au long du reste du cycle cellulaire et jusqu’au prochain cycle de réplication, ce qui permet de déterminer la durée des phases du cycle cellulaire sans qu’il soit nécessaire d’induire un blocage du cycle cellulaire potentiellement toxique. Il est également possible de déterminer et de corréler l’expression des protéines internes et externes au cours des étapes ultérieures du cycle cellulaire. Ceux-ci peuvent être utilisés pour affiner l’attribution de l’étape du cycle cellulaire ou évaluer les effets sur d’autres fonctions cellulaires telles que l’activation du point de contrôle ou la mort cellulaire.

Introduction

L'évaluation des caractéristiques du cycle cellulaire et les changements qui se produisent dans les cellules au cours de la progression du cycle cellulaire est fondamentale pour comprendre de nombreux aspects de la biologie, en particulier la biologie du cancer. De nombreux agents de développement pour le traitement de tumeurs malignes ont des effets profonds sur la progression du cycle cellulaire ou induire la mort cellulaire par l'intermédiaire de mécanismes dépendants-du cycle cellulaire. Afin d'étudier la dynamique du cycle cellulaire ou des cellules dans une phase particulière du cycle cellulaire, il est usuel de synchroniser les cellules. Cependant,....

Protocol

Le protocole décrit ici utilise la lignée cellulaire lymphoblastique leucémie aiguë NALM6 mais peut être appliquée à d'autres types de cellules.

1. Les solutions et réactifs

1. RPMI complet
   1. Ajouter 56 ml de sérum de veau foetal (FCS) et 5,5 ml de 200 mM de L-glutamine à une bouteille de milieu RPMI-1640 500 ml.
2. BrdU Stock Solution
   1. Préparer 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS).
3. BrdU complet RPMI
   1. Ajouter 6,2 ul de BrdU solution stock à 10 ml de RPMI complet.
4. Solution de DNase
   1. Prépare....

Results

Cette méthodologie peut être utilisée pour obtenir une série d'informations. Quelques applications sont décrites ici.

L'évaluation de la durée du cycle cellulaire

Pour déterminer le temps nécessaire pour les cellules de transit à travers le cycle cellulaire, les cellules sont récoltées à divers points de temps suivants l'impulsion de BrdU. Les intervalles entre les évaluations peuvent être adaptés à des cellules particulières en cours d'analyse. Des lignées de ce.......

Discussion

La capacité d'analyse du cycle cellulaire est importante pour la compréhension de la biologie du cancer et le mécanisme d'action de ces deux médicaments et les gènes qui influencent la prolifération cellulaire et la croissance. Bien qu'il existe une multitude de dosages qui mesurent la prolifération cellulaire aurait, dont la majorité ne fournissent une mesure qui indique les cellules numériques présents. Ceux-ci comprennent des dosages qui mesurent le nombre de cellules par visualisation directe et le dépou.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de débit APC BrdU	BD Biosciences	552598	contient de l’anticorps BrdU, du 7-AAD et un tampon BD Cytofix/Cytoperm (appelé tampon de fixation)
Tampon de perméabilisation BD Cytoperm Plus	BD Biosciences	561651	désigné sous le nom de tampon de perméabilisation
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	appelé tampon de lavage
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75  ; mm Tubes FACS	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA Cytomètre en flux	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1 640 w/o L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Sérum fœtal bovin	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamine	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2&prime ;-deoxyuridine	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150  ; cm2 flacons ventilés	BD Biosciences	355001
Pipettes 25  ; ml	Greiner	760180
Pipettes Aersol 200  ; et micro ; l	Interpath	24700
Pipettes Aersol 1  ; ml	Interpath	24800
Centrifugeuse	Spintron	GT-175R
CO2	Binder	C 150
AF488 anti-histone H3 Phospho (Ser10)	Signalisation cellulaire	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Signalisation cellulaire mAb		2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) ( 133D3) Signalisation cellulaire d’anticorps monoclonaux de lapin		2348S
NALM6  ;	DSMZ	ACC-128