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Article de méthode

Silence de

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⸱

DOI :

10.3791/52849

⸱

12 août 2015

 ,  , 
1Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

Dans cet article

Résumé

Le silençage génique par siRNA représente une stratégie expérimentale commode pour analyser les fonctions biologiques dépendantes de BRCA2 avec des implications immédiates pour mieux comprendre la biologie du cancer. Une méthode permettant de réduire efficacement au silence BRCA2, ainsi que la procédure expérimentale visant à détecter et à quantifier les changements dans l’expression de la protéine BRCA2 par immunotransfert dans des lignées cellulaires humaines, sont présentées.

Résumé

Silence de la protéine suppresseur de tumeur BRCA2 et sa détection par des analyses biochimiques classiques représentent un grand défi technique en raison de la grande taille de la protéine BRCA2 humain (environ 390 kDa). Nous rapportons modifications des protocoles standard de transfection et de réduire au silence immunoblotting siARN BRCA2 humain endogène et détecter la protéine BRCA2, respectivement, dans des lignées cellulaires epitheliales humaines. Les étapes clés comprennent une forte siRNA transfection ratio de réactif et de deux rondes subséquentes de transfection de siRNA dans la même expérience. L'utilisation de ces et d'autres modifications au protocole standard, nous réalisons systématiquement plus de 70% le silençage du gène BRCA2 humain tel que jugé par une analyse immunoblot avec des anticorps anti-BRCA2. En outre, la dénaturation des lysats de cellules à 55 ° C au lieu de la classique de 70 à 100 ° C et d'autres techniques d'optimisation de la procédure d'immuno-empreinte permet la détection de la protéine BRCA2 intact même when très faibles quantités de matière de départ sont disponibles ou lorsque les niveaux d'expression de protéine BRCA2 sont très faibles. Silençage efficace de BRCA2 dans les cellules humaines propose une stratégie utile pour perturber la fonction de BRCA2 dans les cellules avec BRCA2 intacte, y compris les cellules tumorales, à examiner de nouvelles voies moléculaires et les fonctions cellulaires qui peuvent être affectés par des mutations de BRCA2 pathogènes dans les tumeurs. Adaptation de ce protocole pour le silençage et l'analyse d'autres protéines «grands» comme BRCA2 efficace devrait être facilement réalisable.

Introduction

Le gène BRCA2 (BReast susceptibilité au cancer gène-2) code pour une protéine suppresseur de tumeur qui joue un rôle crucial dans la réparation des cassures double-brin par régulation de la fonction de l'enzyme recombinase Rad51 1. BRCA2 a également été impliquée dans la modulation de la transcription dans la cellule et le contrôle du cycle 2. Les mutations germinales dans le gène BRCA2 induisent un mode autosomique dominant la susceptibilité au cancer du sein et le cancer de l'ovaire chez les femmes et le cancer de la prostate chez les hommes, ainsi que la prédisposition à d'autres types de cancer 3,4. Cependant, en dépit de l'augmentation du risque dans le développement de cancers, des mutations de BRCA2 qui suppriment ou réduisent fonction de BRCA2 peut rendre les cellules cancéreuses plus vulnérables aux agents chimiothérapeutiques qui causent des dommages de l'ADN 5-7. Cancers sporadiques présentent un taux de mutations BRCA2 (<3%) bien que des niveaux réduits de protéine BRCA2 ont été détectés dans certains types de cancers faible, ce qui suggère que la protéine BRCA2peut être perdue lors de la tumorigenèse dans les cancers sporadiques à travers des mécanismes non-mutation-dépendantes 7,8. Ainsi, il est important de bien comprendre les fonctions de BRCA2 dans le cadre de la biologie du cancer ainsi que dans d'autres milieux biologiques.

Un outil puissant utilisé pour identifier de nouvelles fonctions d'un gène dans des cellules de mammifères est de réduire au silence l'expression. A titre d'exemple, réduire au silence l'expression de BRCA2 dans une variété de cellules epitheliales normales a récemment conduit à l'identification d'une nouvelle fonction de BRCA2 en tant que régulateur de la résistance de anoikis, une étape importante lors de l'acquisition de cellule cancéreuse capacité invasive et métastatique 9. Gene silencing peut être réalisé en introduisant dans les cellules soit faible interférence (si) ARN court en épingle à cheveux ou (sh) des molécules d'ARN ciblant le gène spécifique. La puissance élevée de siRNA et sa facilité d'utilisation en font un outil privilégié pour faire taire des expériences visant à acquérir de nouvelles connaissances sur les processus biologiques critiques, une pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant, knockdown efficace de l'expression génique peut ne pas être facilement réalisable pour tous les gènes et peut être très variable en fonction du type de cellule. Parce qu'une diminution des niveaux de protéines intracellulaires est le phénotype le plus pertinent à l'étude, il est crucial de quantifier l'inactivation génique analyse par immunotransfert du produit de gène. Avec cet égard, la protéine BRCA2 présente une autre difficulté: être d'une grande protéine (environ 390 kDa), des difficultés techniques existent pour l'analyse biochimique classique, y compris immunotransfert.

Nous rapportons ici un protocole optimisé pour une inactivation efficace de BRCA2 dans des lignées cellulaires epitheliales humaines et pour la détection rapide et efficace de la protéine BRCA2 knockdown analyse par immunotransfert.

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Protocole

1. Préparer des solutions siARN

  1. Remettre en suspension 5 nmol de brouillés (Ctrl) et 5 nmol de pastilles séchées BRCA2 siRNA dans 100 ul d'eau exempte de RNase (concentration finale de siRNA: 50 um). Ceci est le stock siRNA et doit être stocké à -20 ° C en 10 aliquotes.
  2. Prendre une aliquote de 10 pi de stock siRNA et ajouter 40 ul d'eau sans RNase pour obtenir la solution de travail 10 uM siRNA. Cette dilution doit être conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation.
    NOTE: La solution de travail siRNA ne doivent pas subir de congélation / décongélation plus de 3 fois.

2. Ensemencement des lignées cellulaires épithéliales humaines

  1. Retirer le moyen de lignées cellulaires epitheliales humaines en croissance sous forme de monocouches de cellules dans des plaques de culture tissulaire dans un incubateur humidifié de croissance à 37 ° C, 5% CO 2.
  2. Laver les cellules dans la plaque une fois avec du PBS (RT 10 ml de PBS pour une plaque de 100 mm).
  3. Pour détacher les cellules de la plaque,ajouter 2 ml de trypsine à 0,25% / solution 0,53 mM d'EDTA et incuber 3-5 min en fonction du type de cellule.
  4. Avant de collecter les cellules détachées, neutraliser la trypsine par addition de 2 ml de milieu de croissance complet contenant 10% de sérum bovin foetal.
  5. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml.
  6. Centrifuger les cellules à 320 à 330 g pendant 3 min à 4 ° C dans un rotor à godets oscillants.
  7. Remettre en suspension les culots cellulaires dans 5 ml de milieu sans antibiotiques.
  8. Compter les cellules au microscope dans une chambre Burker ou en utilisant un système de comptage automatique selon les instructions du fabricant.
  9. Ensemencer les cellules dans des plaques de 6 puits à environ 80% de confluence après 24 h (0,5-1 x10 6 cellules dans 2 ml de milieu de chaque puits). Le nombre de cellules optimal à être ensemencée peut varier en fonction des lignées cellulaires spécifiques et le taux de croissance.
    NOTE: Ne pas ajouter des antibiotiques dans le milieu à ce point parce que les antibiotiques vont interférer négativement avec l'efficacité de transfection. Il est très important que les cellules sont à passages en culture faible (<10) pour atteindre la haute efficacité de transfection de siRNA BRCA2.

3. transfecter des cellules avec un siRNA

  1. Vingt-quatre heures après l'étalement des cellules, procéder à la première ronde de la transfection.
    1. Diluer 6 pi de 10 réactif de transfection de siRNA spécifique à base de lipides dans 130 ul de milieu de sérum réduit.
    2. Diluer 3 pi de 10 pM de siRNA (30 pmoles) dans 130 ul de milieu de sérum réduit.
    3. Moissonneuse le siRNA dilué avec le réactif de transfection dilué et incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
    4. Pendant l'incubation, éliminer le milieu à partir des cellules et ajouter 2 ml de milieu frais préchauffé à 37 ° C (sans antibiotiques).
    5. Ajouter 250 ul de complexes réactif de transfection-ARNsi aux cellules (cette quantité est d'un seul puits d'une plaque à 6 puits).
    6. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C76; C avec 5% de CO 2.
  2. Après 24 h, passer à la deuxième ronde de la transfection en répétant les étapes 3.1.1-3.1.5 avec la modification suivante pour l'étape 3.1.2: diluer 5 pi de 10 uM siRNA (50 pmol) dans 130 pi de milieu sérique réduite.
    1. Incuber les cellules pendant 1-2 jours à 37 ° C avant analyse.
      REMARQUE: Deux séries de transfections et utilisation d'un rapport de réactif haute siRNA / de transfection au second tour sont essentiels pour obtenir un rendement élevé de BRCA2 silencieux.

4. Lyse des cellules pour l'analyse d'immunotransfert

  1. Préparer du tampon de lyse douce avec du PBS (pH 7,4) contenant 1% de la non-ioniques, non dénaturant détergent octylphénoxypolyéthoxyéthanol, le pyrophosphate de sodium 5 mM, orthovanadate de sodium 1 mM, fluorure de sodium 10 mM, fluorure de phénylméthylsulfonyle 2 mM, 10 ug / ml de leupeptine, 10 ug / ml d'aprotinine. Gardez-le sur la glace.
  2. Enlever le milieu à partir des cellules et wles cendres une fois avec du PBS froid (2 ml / puits) dans la plaque. Pour éviter tout report PBS, retirer complètement de la plaque.
  3. Ajouter 200 ul de tampon de lyse dans chaque puits.
    REMARQUE: si les cellules doivent être utilisés aussi pour d'autres dosages, trypsiniser les cellules comme décrit dans l'étape 2/1 à 2/6 et remettre en suspension les cellules dans du tampon / milieu approprié selon l'application à utiliser.
  4. Faire tourner doucement la plaque pour distribuer uniformément le tampon de lyse et incuber pendant 15 min à 4 ° C sur un agitateur.
  5. Recueillir le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse sur de la glace en utilisant un grattoir à cellules.
  6. Centrifuger à 17 900 g pendant 25 min à 4 ° C et recueillir le surnageant dans un nouveau tube.
  7. Mesurer la concentration de protéine en utilisant un dosage de protéine disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.

Analyse d'immunotransfert 5. BRCA2

  1. Préparer le tampon de migration en diluant 50 ml de 20x Tris-Acétate SDS b couriruffer (mM Tricine 50, 50 mM Tris base, 0,1% de SDS, pH 8,24) avec 950 ml d'eau distillée.
  2. Préparer l'échantillon comme suit: ajouter 15 pg de lysat de cellules totales, 5 ul de tampon d'échantillon 4x contenant dodécylsulfate de lithium à un pH de 8,4, 2 pl de 10x échantillon agent réducteur (0,5 M DTT), et un tampon de lyse jusqu'à un volume final de 20 ul.
    NOTE: Ce protocole permet la détection de BRCA2 dans des lignées cellulaires normales aussi lors de l'utilisation d'une plus faible quantité de protéines totales (en bas à 5 ug).
  3. Dénaturer les échantillons à 55 ° C pendant 10 min.
    NOTE: Il est crucial d'utiliser 55 ° C. Depuis protéine BRCA2 est thermosensible 11, la hausse des températures de dénaturation se traduisent par la perte constante de pleine longueur intacte (390 kDa) des protéines BRCA2.
  4. Mettre en place la chambre électrophorétique selon les instructions du fabricant.
  5. Charger les échantillons et 10 pi de haut poids moléculaire pré-coloré protéine standard sur un gel precasted (Tris-Acétate 3-8%) et de fonctionner à 120 V pour abà 2 h 12. Arrêter la course électrophorétique avant la kDa marqueur bleu 55 laisse le gel precasted.
  6. Préparer le tampon de transfert avec 50 ml de tampon de transfert 20 fois, 100 ml de methanol à 100% et 850 ml d'eau.
  7. Activer membrane de PVDF (0,45 um de taille de pore) par trempage dans 100% de methanol pendant 5 minutes, rincer à l'eau distillée et équilibrer dans du tampon de transfert au moins pendant 5 minutes. Faire tremper les éponges de l'appareil de transfert dans un tampon de transfert à 4 ° C jusqu'à utilisation.
  8. Lorsque la course électrophorétique est terminée, assembler le sandwich dans la pile de transfert dans l'ordre suivant (bottom-up): trois éponges saturées dans un tampon de transfert, un 3MM feuille de papier de qualité saturée dans un tampon de transfert, le gel, la membrane de PVDF activé, un 3MM Note feuille de papier saturée dans un tampon de transfert, trois éponges saturée dans un tampon de transfert 13,14. Placez la pile dans les protéines de l'appareil et de transfert à 350 mA pendant 4 heures à 4 ° C ou à 180 mA pendant une nuit à 4 ° C.
    NOTE: Etre BRCA2 une très grosse protéine, il est crucial d'étendre le temps de transfert de 1 h (comme suggéré par le fabricant et la plupart des protocoles de transfert) à 4 h ou toute la nuit pour assurer le transfert complet des protéines de haut poids moléculaire. En outre, en raison de la longue période de transfert, il est essentiel d'effectuer le buvard dans une chambre froide à 4 ° C pour minimiser la surchauffe et de faciliter le démontage en sandwich. Systèmes de transfert semi-sèches ne sont pas bonnes pour transférer de grandes protéines.
  9. Après le transfert, laver la membrane avec le SCT, bloquer pendant 1 heure à température ambiante dans du TBS-Tween 0,25% (TBS-T) contenant du lait en poudre de 5% sans matières grasses et de la sonde pendant la nuit à 4 ° C avec un anticorps polyclonal de lapin 30 pi anti-BRCA2 ( 200 ug / ml), dilué dans 9 ml de TBS-T + 5% de lait écrémé sec [1: 300 (v / v)] dilution.
  10. Laver la membrane trois fois (10 minutes à chaque fois) avec du TBS-T, puis incuber le filtre pendant 1 heure avec 1 pi d'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort anti-lapin dilué dans 10 ml de TBS-T + 5% de lait écrémé sec. Par la suite, laver la membrane trois fois (10 minutes chacun) avec TBS-T.
  11. Effectuer immunodétection par ECL pour révéler la protéine BRCA2 utilisant la chimioluminescence amplifiée (ECL) Western Blot réactif de détection, en suivant les instructions du fabricant. Visualiser les bandes immunochemiluminescent sur haute résolution ECL films.
  12. Effectuer immunodétection avec un anticorps pour un gène de ménage, comme β-tubuline (55 kDa), sur le même filtre que le contrôle de chargement en utilisant un anticorps monoclonal à β-tubuline dilué à 1: 1000 (10 ul d'anticorps anti-tubuline en 10 ml TBS-T + 5% de lait sec non gras) pendant 1 heure à température ambiante. Laver et incuber l'anticorps secondaire tel que décrit pour BRCA2 (5.10 à 5.11), à l'exception de l'utilisation de la peroxydase de raifort anti-souris conjuguée à la place de l'anticorps secondaire anti-lapin.
  13. Acquérir une image numérique de films impressionnés par bandes de immunochemiluminescent et analyser l'intensité de la bande par un logiciel d'analyse d'image spécialisé (par exemple,., ImageJ).

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Résultats

Avant de procéder à un dosage biologique / biochimique pour examiner l'effet de BRCA2 silence sur les fonctions des cellules, la première étape consiste à vérifier la spécificité de l'inactivation à l'aide d'un ARNsi crypté (non-ciblage siRNA) côte à côte avec BRCA2 siRNA (figure 1A ). Il est important d'effectuer un deuxième tour de transfection de siRNA avec un ratio élevé siRNA / transfection pour obtenir un rendement élevé de BRCA2 silencieux. En effet, effectue...

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Discussion

Parce que les mutations de la lignée germinale de la sonde du gène BRCA2 à un risque accru de plusieurs types de cancer, notamment le cancer femelle et mâle du sein, du cancer de l'ovaire, le cancer de la prostate, le cancer du pancréas et le mélanome 3,4, un certain nombre d'études ont été entreprises pour comprendre la fonction biologique de la protéine BRCA2. La plupart de ces études sont d'origine génétique basée principalement en raison de difficultés techniques dans l'analyse d&...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 et RBNE08HWLZ_012, et le ministère italien de l’Économie et des Finances au CNR pour le projet « FaReBio di Qualità ».

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BRCA2 siRNADharmaconL-003462-00SMARTpool : ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNADharmacon  ; D-001810-10-05de lipofectamine non ciblée ON-TARGETplus
  ;Life Technologies13778075Réactif de transfection
OPTI-MEM I Sérum réduit Medium LifeTechnologies31985-070Milieu pour procédure de transfection
NuPAGE Tris-Acétate 3-8 % 1,5 mm Gel préfabriquéLife TechnologiesEA0378Gel pour électrophorèse des protéines
NuPAGE LDS Tampon d’échantillons  ;Life TechnologiesNP0007Réactif pour électrophorèse protéique
NuPAGE Agent réducteur d’échantillon (10x)Life TechnologiesNP0004Réactif pour électrophorèse protéique
NuPAGE AntioxidantLife TechnologiesNP0005Réactif pour électrophorèse protéique
HiMark Étalon protéique pré-coloréLife TechnologiesLC5699Marqueur précoloré pour gel électrophorèse
XCell SureLoc Mini-Cell  ; SystemLife TechnologiesEI0002Équipement pour l’électrophorèse/transfert de protéines
NuPAGE Tris-Acétate SDS Running BufferLife TechnologiesLA0041Réactif pour Western blot
membrane PVDFMilliporeIPVH00010Réactif pour Western blot
NuPAGE Transfer BufferLife TechnologiesNP0006-1Réactif pour Western blot
BRCA2 H-300 Anticorps polyclonal de lapinSanta Cruz Biotechnologysc-8326dilution 1:300
Anticorps monoclonal bêta-tubulineSigma AldrichT4026-100ULdilution 1:1 000
Lait écrémé en poudreSigma Aldrich70166Réactif pour transfert Western
Tween-20Sigma AldrichP1379Réactif pour transfert Western
Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico/FemtoPierce Thermo Scientific34080/34096Système de chimiluminescence
Cellules PNT1ASIGMA Aldrich (pour ECACC)95012614PNT1A humain, épithélium normal de la prostate immortalisé avec des cellules Nthy SV40
SIGMA Aldrich (pour ECACC)90011609Nthy-ori 3-1 Cell Line Cellules épithéliales folliculaires thyroïdiennes humaines
Prolifération cellulaire Kit I (MTT)Roche11465007001Kit pour les tests de prolifération cellulaire
Réactif d’ARNiMAX

Références

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