Silence de<em&gt; BRCA2</em&gt; D&#39;identifier les fonctions biologiques de BRCA2 réglementés nouveaux dans les cellules humaines en culture

Loredana Moro; Nicoletta Guaragnella; Sergio Giannattasio

doi:10.3791/52849

Article de méthode

Silence de

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DOI :

10.3791/52849

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12 août 2015

Loredana Moro¹ , Nicoletta Guaragnella¹ , Sergio Giannattasio¹

¹Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

Dans cet article

Résumé

Le silençage génique par siRNA représente une stratégie expérimentale commode pour analyser les fonctions biologiques dépendantes de BRCA2 avec des implications immédiates pour mieux comprendre la biologie du cancer. Une méthode permettant de réduire efficacement au silence BRCA2, ainsi que la procédure expérimentale visant à détecter et à quantifier les changements dans l’expression de la protéine BRCA2 par immunotransfert dans des lignées cellulaires humaines, sont présentées.

Résumé

Silence de la protéine suppresseur de tumeur BRCA2 et sa détection par des analyses biochimiques classiques représentent un grand défi technique en raison de la grande taille de la protéine BRCA2 humain (environ 390 kDa). Nous rapportons modifications des protocoles standard de transfection et de réduire au silence immunoblotting siARN BRCA2 humain endogène et détecter la protéine BRCA2, respectivement, dans des lignées cellulaires epitheliales humaines. Les étapes clés comprennent une forte siRNA transfection ratio de réactif et de deux rondes subséquentes de transfection de siRNA dans la même expérience. L'utilisation de ces et d'autres modifications au protocole standard, nous réalisons systématiquement plus de 70% le silençage du gène BRCA2 humain tel que jugé par une analyse immunoblot avec des anticorps anti-BRCA2. En outre, la dénaturation des lysats de cellules à 55 ° C au lieu de la classique de 70 à 100 ° C et d'autres techniques d'optimisation de la procédure d'immuno-empreinte permet la détection de la protéine BRCA2 intact même when très faibles quantités de matière de départ sont disponibles ou lorsque les niveaux d'expression de protéine BRCA2 sont très faibles. Silençage efficace de BRCA2 dans les cellules humaines propose une stratégie utile pour perturber la fonction de BRCA2 dans les cellules avec BRCA2 intacte, y compris les cellules tumorales, à examiner de nouvelles voies moléculaires et les fonctions cellulaires qui peuvent être affectés par des mutations de BRCA2 pathogènes dans les tumeurs. Adaptation de ce protocole pour le silençage et l'analyse d'autres protéines «grands» comme BRCA2 efficace devrait être facilement réalisable.

Introduction

Le gène BRCA2 (BReast susceptibilité au cancer gène-2) code pour une protéine suppresseur de tumeur qui joue un rôle crucial dans la réparation des cassures double-brin par régulation de la fonction de l'enzyme recombinase Rad51 ^1. BRCA2 a également été impliquée dans la modulation de la transcription dans la cellule et le contrôle du cycle ^2. Les mutations germinales dans le gène BRCA2 induisent un mode autosomique dominant la susceptibilité au cancer du sein et le cancer de l'ovaire chez les femmes et le cancer de la prostate chez les hommes, ainsi que la prédisposition à d'autres types de cancer ^3,4. C....