Simultané<em&gt; Ex vivo</em&gt; Tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; In vivo</em&gt; Système Électrorétinogramme

Résumé

Ex vivo ERG peut être utilisé pour enregistrer l’activité électrique des cellules rétiniennes directement à partir de rétines intactes isolées d’animaux ou d’humains. Nous démontrons ici comment les systèmes ERG in vivo courants peuvent être adaptés aux enregistrements ERG ex vivo afin de disséquer l’activité électrique des cellules rétiniennes.

Résumé

Un signal d’électrorétinogramme in vivo (ERG) est composé de plusieurs composants superposés provenant de différents types de cellules rétiniennes, ainsi que de bruit provenant de sources extra-rétiniennes. Ex vivo L’ERG fournit une méthode efficace pour disséquer la fonction des cellules rétiniennes directement à partir d’une rétine isolée intacte d’animaux ou d’yeux de donneurs. De plus, l’ERG ex vivo peut être utilisé pour tester l’efficacité et l’innocuité d’agents thérapeutiques potentiels sur le tissu rétinien d’animaux ou d’humains. Nous montrons ici comment les systèmes ERG in vivo disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour effectuer des enregistrements ERG ex vivo à partir de rétines de souris isolées. Nous combinons les unités de stimulation lumineuse, électroniques et de chauffage d’un système in vivo standard avec un porte-échantillon conçu sur mesure, un système de perfusion contrôlé par gravité et un blindage contre le bruit électromagnétique pour enregistrer simultanément des signaux ERG ex vivo à faible bruit à partir de deux rétines avec le logiciel d’acquisition inclus dans le commerce in vivo Systèmes. De plus, nous démontrons comment utiliser cette méthode en combinaison avec des traitements pharmacologiques qui éliminent des composants ERG spécifiques afin de disséquer la fonction de certains types de cellules rétiniennes.

Introduction

Électrorétinogramme (ERG) est une technique bien établie qui peut être utilisé pour enregistrer l'activité électrique de la rétine provoquée par la lumière. Le signal est généré ERG principalement par les variations de tension provoquées par les courants radiaux (selon l'axe des photorécepteurs et les cellules bipolaires) circulant dans l'espace extracellulaire résistif de la rétine. Le premier signal ERG a été enregistrée en 1865 par Holmgren de la surface d'un œil de poisson ^1. Einthoven et Jolly 1908 ² divisés la réponse ERG à l'apparition de la lumière en trois vagues différentes, appelé A, B, et C-ondes, qui sont mainten....

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux étaient en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité institutionnel Animal Studies à l'Université de Washington.

1. Configuration de perfusion et porte-échantillon

1. Préparer la solution pour perfusion rétine frais sur le jour de l'expérience. Utilisez de l'eau distillée et déminéralisée. Utilisez l'une des trois solutions suivantes.
   1. Préparez-contenant Bicarbonate de la solution (1 L): 1 bouteille de Ames Ames des médias et de 1,9 g de NaHCO _3,
   2. Préparer la solution de Locke....

Résultats

Nous avons enregistré les réponses flash de type sauvage adaptés à l'obscurité (WT) C57BL / 6 rétines de souris en suivant les protocoles expérimentaux décrits ci-dessus et illustrés dans la Figure 1 en utilisant différentes solutions de perfusion classiques (Figure 2). Les formes d'ondes et de la cinétique de réponse ainsi que la sensibilité des photorécepteurs à bâtonnets semblent similaires à Ames »et les médias de Locke (Figure 2A et B). D&#.......

Discussion

Nous démontrons ici les étapes critiques pour l'obtention de haute qualité ex vivo enregistrements ERG simultanément à partir de deux rétines de souris isolées en utilisant des composants in vivo du système ERG avec un ex vivo ERG adaptateur. Dans cette étude, nous avons perfusé les deux rétines de l'animal avec la même solution (soit Ames ', Ringer Locke ou) mais il est également possible de perfuser chaque rétine avec une solution différente, par exemple, à des fin.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
In vivo Système ERG	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
>In vivo Système ERG	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex Adaptateur vivo	OcuScience	Ex VIVO ERG adapter	www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope	North Central Instruments	Leica M80	Peut utiliser n’importe quelle marqueun
émetteur IR	Opto Diode Corp.	OD-50L	www.optodiode.com
Lunette de vision nocturne Prowler	B.E. Meyers Electro Optics	D4300-I	Produit de qualité militaire.
Filtre rouge	Rosco Laboratories	Roscolux #27 Medium Red	Peut être utilisé à la place du système IR
Lampe frontale rouge	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
Pince à épiler Dumont #5	WPI, Inc.	14101
Lames de rasoir	Microscopie électronique Sciences	72000	www.emsdiasum.com
Echelle	Metler Toledo	AB54-S/FACT	a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Peut utiliser n’importe quelle marque
>pH-mètre et électrode	Beckman Coulter	pHI 350	Peut utiliser n’importe quelle marque
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Peut utiliser n’importe quelle marque
KCl	Sigma-Aldrich	60129	Peut utiliser n’importe quelle marque
MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 M solution
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	Peut utiliser n’importe quelle marque
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Peut utiliser n’importe quelle marque
Bicarbonate	de sodium Sigma-Aldrich	S6297	Peut utiliser n’importe quelle marque
Ames medium	Sigma-Aldrich	A1420	Peut utiliser n’importe quelle marque
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	Peut utiliser n’importe quelle marque
DL-AP4	Tocris Bioscience	101	Peut utiliser n’importe quelle marque
d’acide succinique sel disodique	Sigma-Aldrich	224731	Peut utiliser n’importe quelle marque
d’acide L-glutamique	Sigma-Aldrich	G2834	Peut utiliser n’importe quelle marque
de D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Peut utiliser n’importe quelle marque
de milieu de culture Leibovitz L-15	Sigma-Aldrich	L4386	Peut utiliser n’importe quelle marque
MEM vitamines	Sigma-Aldrich	M6895
MEM acides aminés	Sigma-Aldrich	M5550
Carbogen	Airgas	UN3156	5 % CO2

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