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Iridium (III) luminescent sonde pour la détection de la protéine riche en histidine Malarial biomarqueurs protéines-II

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DOI :

10.3791/52856

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7 juillet 2015

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1Department of Chemistry, Vanderbilt University

Dans cet article

Résumé

Des réactifs de détection robustes sont de plus en plus nécessaires pour développer de nouveaux outils de diagnostic du paludisme. Une sonde à l’iridium(III) a été conçue pour émettre un signal luminescent de longue durée en présence d’un biomarqueur de protéine du paludisme riche en histidine. La détection de la protéine en solution ou immobilisée sur une particule magnétique offre une flexibilité d’application.

Résumé

Ce travail décrit la synthèse d'un non-émissive, cyclometalated Ir (III), Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), qui déclenche un signal phosphorescent rapide, longue durée de vie quand elle est coordonnée à une histidine contenant une protéine immobilisée sur la surface d'une particule magnétique. Synthèse de Ir1, avec des rendements élevés, est complet O / N et implique le fractionnement du parent cyclometalated Ir (III) dimère de chloro-ponté dans deux équivalents de complexe solvaté. Pour confirmer la spécificité, plusieurs acides aminés ont été sondés pour l'activité de coordination lorsqu'il est ajouté à la sonde synthétisée, et seulement histidine ont provoqué une réponse de signal. Utilisation BNT-II, un peptide mimétique ramifié du biomarqueur paludisme Histidine Rich Protein II (Pf HRP-II), la sonde de l'iridium a été validé comme un outil pour la détection HRP-II. Effets de trempe ont été notées dans le titrage BNT-II / Ir1 par rapport à la L-histidine / Ir1, mais ceux-ci ont été attribués à encombrement stérique et triPlet état trempe. Biocouche interférométrie a été utilisé pour déterminer la cinétique en temps réel de l'interaction avec des Ir1 BNT-II. Une fois que le système a été optimisé, la limite de détection de rcHRP-II au moyen de la sonde a été trouvé que 12,8 nM en solution. Lorsque cette protéine est immobilisée sur la surface d'une particule magnétique agarose 50 pm, la limite de détection était de 14,5 nM. La réponse robuste du signal de cette sonde inorganique, ainsi que sa souplesse d'utilisation en solution ou immobilisé sur une surface, peuvent se prêter à l'égard d'une variété d'applications, depuis l'utilisation de l'imagerie diagnostique.

Introduction

Étiquetage colorimétriques et fluorescente est une méthode importante pour la détection et le suivi des molécules biochimiques et traite 1,2. Les marqueurs fluorescents plus courantes sont de faible poids moléculaire colorants organiques 3,4, mais ces molécules ne disposent pas toujours des propriétés optiques idéales. Les colorants fluorescents sont sujettes à photoblanchiment, ont souvent des petits déplacements de Stokes, et peut avoir excitation se chevauchant et des spectres d'émission. Marquage colorimétrique est souvent obtenue par l'utilisation de marqueurs enzymatiques, qui ont un signal amplifié utile dans la quantification immunologique 5,6. Ces enzymes ont aussi leurs inconvénients, y compris la photosensibilité, des conditions de réaction, et la durée de conservation courte du substrat. Ces propriétés ont tendance à exiger des dosages immunologiques et des méthodes d'étiquetage des protéines à faire dans des conditions bien contrôlées en utilisant des réactifs coûteux.

Complexes de métaux de transition émissives ont été explorés comme une approche d'étiquetage alternatif for détection biochimique. En particulier, cyclometalated Ir (III) a été étudiée dans le contexte de diodes électroluminescentes organiques (OLED) 7-9 oxygène de détection 10, la catalyse 11, et de protéines / cellule coloration 12-14. Photostabilité élevée et l'efficacité quantique font de cette classe de sondes un bon candidat pour la détection de biomolécules 15,16. Il a déjà été constaté que cyclometalated Ir (III) complexes, de la forme [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, se lie irréversiblement histidine et provoquer une réponse de signal bleu-vert 12,17. Ces complexes sont non-émissif dans l'état de solvento, mais lorsque l'histidine déplace les molécules de solvant et se lie au centre métallique, ils libèrent un signal intense phosphorescent après irradiation UV à ondes longues. Ce signal se produit uniquement après substitution de ligand, et est le résultat d'un électron à l'état triplet de détente à l'état du sol à travers l'activation du transfert de charge métal-ligand (3 MLCT) et le ligand transfert centrée (3 LC) 8,15 voies. Ces complexes peuvent potentiellement être utilisés en tant que sondes de détection pour les protéines riches en histidine.

protéines riches en histidine et leurs niveaux de régulation sont importants dans de nombreuses maladies, y compris la cirrhose du foie, le cancer et les troubles thrombique. 18 Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (Pf HRP-II) en particulier, est un biomarqueur bien validé de l'infection du parasite du paludisme. Cette protéine est de 67 kDa et contient 34% d'histidine, la plupart du temps au sein de caractéristiques AHHAHHAAD répétant des motifs 19. Ces répétitions histidine peuvent lier les ions métalliques libres 19 et 20 des complexes hème dans le sang de l'hôte. Pf HRP-II est couramment détectée dans les milieux à faibles ressources en utilisant des tests de diagnostic rapide (TDR) immunochromatographiques, mais ces tests sont souvent inexactes en raison de conditions échantillons, la concentration de biomarqueurs bas, des normes de fabrication pauvres, et la dégradation des anticorps 21.

sondes phosphorescents à base de métaux tels que le cyclometalated Ir (III) décrits ci-dessus sont des options intéressantes pour la détection de Pf HRP-II en raison de leur liaison sélective de l'histidine et leurs propriétés stable et efficace émission. Dans ce document, l'utilisation de [Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) pour détecter BNT-II, un peptide mimétique ramifié de Pf HRP-II est exploré 22. Cinétique de cette interaction ont été surveillées en temps réel en utilisant des techniques d'interférométrie biocouche. Le test a également été adapté à un format de type ELISA sur-perle, où les limites de nanomolaires de détection ont été atteints. Ce dosage possède des avantages par rapport ELISA classiques, car il peut être réalisé en moins de deux heures avec des réactifs d'anticorps libre, à la place de la 4-5 h et avec des réactifs biologiques nécessaires ELISA typiques.

Protocole

1. Synthèse de l'iridium (III) Complexe

  1. Peser 53,6 mg (50 pmol) de [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 et dissoudre dans 5 ml de chlorure de méthylène. Ajouter cette solution dans une fiole Erlenmeyer de 50 ml équipé d'une barre d'agitation.
  2. Peser 26,2 mg (100 pmol) et de AgOTf dissoudre dans 5 ml de methanol.
  3. Ajouter la AgOTf dissous à la [Ir (ppa) 2 Cl] 2 Solution et remuez pendant 1 heure.
    Remarque: Une couleur crème bouillie devrait en résulter.
  4. Après 1 heure, on filtre la suspension à travers du gel de silice dans un flacon dram 25 x 95 mm et évaporer le solvant restant en utilisant un évaporateur rotatif (5-10 min).
  5. Une fois la plupart du solvant est éliminée, vérifiez que un résidu huileux jaune reste dans le flacon. A ce résidu, ajouter 1 ml de methanol pour re-dissoudre le produit et lyophiliser 1-2 jours pour donner le produit solide jaune.
  6. Caractériser l'Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2 + produit (Ir1) par H 1 RMN (dans CDCl 3), ESI et UV-Vis comme décrit précédemment. 23

2. Interactions de Ir1 avec divers acides aminés

  1. Préparer une solution à 2 mM de Ir1 dans du methanol (MW 537,10 g / mol). Vortex pour assurer la dissolution complète du solide.
  2. Préparer 100 uM des solutions des acides aminés et des biomolécules suivantes dans une solution saline tamponnée de HEPES (HBS mM de HEPES, 100, 137 mM de NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val.
  3. Introduire à la pipette 100 pi de chaque acide aminé dans une plaque de 96 puits noir. Ajouter 100 ul de HBS à la plaque pour servir de vide.
  4. Ajouter 2,5 ul de la solution 2 mM Ir1 à chaque échantillon et agiter la plaque sur un agitateur de plaque pendant 10 min.
  5. Après 10 min, d'acquérir les spectres d'émission des échantillons en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits (365 ex / em 400-700).
    1. Placer la plaque dans l'instrument et ouvrez le logiciel de lecteur de plaque de mettre en place une nouvelle expérience.
    2. Définissez le nouveau experiment à lire une analyse de fluorescence à une longueur d'onde d'excitation de 365 nm et une largeur de fente de 9 nm avec le système optique à la position supérieure.
    3. Lire l'émission de 300 à 700 nm avec une taille de pas de 5 nm.
    4. Exporter les données pour l'analyse des données.
  6. Transférer les échantillons à une plaque de 96 puits claire et l'image de l'émission en utilisant un transilluminateur UV.

3. Le titrage de Ir1 avec BNT-II

  1. Préparer une solution mère 1 mM de BNT-II (PM 8233,6 g / mol) dans du HBS, ainsi qu'une solution à 2 mM de Ir1 dans du methanol.
  2. De la solution mère, préparer 1 ml de 100 um BNT-II dans HBS. Vortex le tube à centrifuger pour assurer l'échantillon est mélangé.
  3. Diluer la série 100 uM BNT-II de moitié dans du HBS à une concentration finale de 1,56 uM BNT-II.
  4. Ajouter 100 ul de chaque dilution, en triple exemplaire, avec HBS servant de blanc, pour les puits d'une plaque à 96 puits. Pour chaque échantillon, ajouter 2,5 pi de 2 mM Ir1.
  5. Shake la plaque pendant 10 min sur un agitateur de plaque.
  6. Après agitation, lire l'intensité d'émission à 510 nm (excitation à 365 nm) en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits.
    1. Placer la plaque dans l'instrument et ouvrez le logiciel de lecteur de plaque de mettre en place une nouvelle expérience.
    2. Réglez la nouvelle expérience de lire un critère de fluorescence avec une longueur d'onde d'excitation de 365 nm de longueur d'onde et l'émission de 510 nm. Réglez la largeur de la fente pour les deux longueurs d'onde à 9 nm, avec l'optique à la position supérieure.
    3. Lire la plaque et d'exporter les données pour l'analyse.
  7. Transférer les échantillons à une plaque de 96 puits claire et l'image de la titration en utilisant un transilluminateur UV.

4. temps réel Kinetic Analyse du système Ir1 / BNT-II utilisant l'interférométrie couche biologique

  1. Ajouter 200 pi de tampon cinétique (KB; phosphate 1x solution saline tamponnée avec 0,02% de Tween-20) à 8 puits dans la première colonne d'une plaque de 96 puits noir et insérer la plaque dans le capteur en plastiquetitulaire. Transférer soigneusement 8 Ni (II) biocapteurs NTA à la première colonne dans le support de matière plastique de telle sorte que les pointes sont mises en suspension dans les puits de tampon. Placer le support de matière plastique sur le côté gauche de l'instrument d'interférométrie.
  2. Préparer un 2 ml d'une solution 0,5 M de BNT-II en Ko.
  3. Préparer 500 ul d'une solution 10 uM de Ir1 kb, et on dilue en série par la moitié vers le bas à 0,156 pM en Ko.
  4. Pour une nouvelle plaque et noir 96, pipette 200 pi de Ko à tous les 8 puits dans la colonne A et C.
  5. De la même plaque, une pipette 200 ul de la solution 0,5 uM BNT-II dans les puits dans la colonne B.
  6. Introduire à la pipette 200 ul de chaque dilution de Ir1 dans la colonne D, en commençant par KB comme dans l'ébauche ainsi D1. Ajouter les dilutions de sorte que les puits augmentation de la concentration Ir1 long de la colonne.
  7. Placez cette plaque dans l'instrument à la droite de la plaque contenant les capteurs de pré-mouillage.
  8. Dans le logiciel biocouche d'interférométrie, mettre en place une base Kinetic expérience en définissant les conseils plaque, le dosage, et de capteurs.
    1. Pour définir la plaque, sélectionnez une colonne sur l'écran, faites un clic droit et choisissez la définition appropriée pour les puits. Sélectionnez "tampon" pour les colonnes A et C, "Load" pour la colonne B, et «échantillon» pour la colonne D.
    2. Définir le dosage dans l'onglet suivant en ajoutant les étapes suivantes (Cliquez sur "Ajouter"): équilibration (Custom), 60 sec; Chargement en cours, 120 s; Ligne de base, 60 sec; Association, 120 s; et de dissociation, 300 sec. Sélectionnez l'étape d'équilibrage et double-cliquez sur la colonne A. Répétez l'opération pour Chargement (colonne B), Baseline (colonne C), Association (colonne D) et de dissociation (colonne C). Sélectionnez les capteurs Ni (II) NTA.
    3. Déplacer vers l'onglet suivant et confirment que les capteurs sont dans la colonne A sur le support de capteur de plastique.
    4. Confirmer l'expérience est décrite correctement, insérez un nom de fichier, veiller à ce que «l'expérience de retard" est cochée, et appuyez sur «Go».
      Note: En raison de la nature de l'instrument automatisé, une fois l'expérience cinétique est décrit, les étapes se produira comme programmé.
  9. Une fois la course cinétique est complète, traiter les données dans le logiciel de traitement prévu.
    1. Double-cliquez sur le dossier avec le nom de l'intérêt dans la partie inférieure du panneau sur la gauche. Ensuite, double-cliquez sur le dossier correspondant à la rubrique «Kinetics" dans la partie supérieure du panneau. Allez sur l'onglet de traitement.
    2. Cochez la case de soustraction sur la gauche pour ouvrir l'écran de sélection du capteur. Faites un clic droit sur le bien A4 et modifier le type de bien de bien référencer.
    3. Cochez la case à côté de Aligner l'axe Y, et de veiller à l'étape sélectionnée est Baseline. Spécifiez la plage de temps pour être les cinq dernières secondes de la ligne de base (environ 55-60 secondes).
    4. Cochez la case pour l'Inter-étape Correction et sélectionnez Aligner à la dissociation. Vérifiez que la case Savitzky-Golay filtrage est cochée et appuyez sur "Process Data! ̶1;
    5. Allez sur l'onglet Analyse. Assurez-vous que "Association et dissociation» est la sélection pour les étapes pour analyser et que le modèle est de 1: 1. Sélectionnez un ajustement complet local et appuyez sur "Courbes Fit!"
    6. Mettez en surbrillance toutes les courbes dans le tableau et cliquez sur la droite pour régler toutes les courbes à une couleur. Ensuite, sélectionnez un mondial (complet) apte, regroupés par couleur et Rmax Unlinked par capteur. Appuyez sur "Courbes Fit!" Pour obtenir des données cinétiques mondiaux.

5. Sur-perle Détection de BNT-II et rcHRP-II avec Ir1

  1. Préparer 1 ml de chaque solution de 1 pM de BNT-II-II et rcHRP dans du HBS avec Tween (HBST; HBS avec 0,025% de Tween 20).
  2. Diluer en série chaque protéine par moitié dans HBST à une concentration finale de 15,6 nM.
  3. Pipette 100 pi de chaque dilution, en triple exemplaire, dans une plaque blanche à 96 puits, avec les dilutions dans l'ordre de la plus faible à la plus forte concentration sur une colonne.
  4. Pipette 10 ul de 50 um Ni (IINTA) des particules magnétiques agarose dans chaque dilution ainsi.
    1. Vortex le tube à centrifuger contenant les particules magnétiques après chaque pipetage pour assurer les particules restent en suspension.
  5. Placer la plaque sur un agitateur de plaque pendant 15 min à incuber les échantillons avec les particules.
  6. Après cette période d'incubation, placer la plaque sur un aimant de plaque de 96 puits et attendre 30 secondes pour les particules de tirer hors de la solution.
  7. En utilisant une pipette multicanaux, retirer l'échantillon original et jeter comme des déchets. Retirer la plaque de l'aimant.
  8. Ajouter 200 pi de HBST à chaque puits en utilisant la pipette multicanaux. Pomper le tampon de haut en bas plusieurs fois pour laver les particules magnétiques.
  9. Placer la plaque arrière sur l'aimant et attendre 30 secondes pour les particules de tirer hors de la solution.
  10. Utilisation de la pipette multicanaux, retirer les 200 pi de tampon et le jeter comme un déchet. Retirer la plaque de l'aimant.
  11. Répétez les étapes 5,8 throug5.10 h deux fois pour terminer trois lavages des particules.
  12. Ajouter 100 pi de HBST à chaque puits contenant des particules magnétiques suivie par 2,5 pi de 2 mM Ir1.
  13. Incuber les particules avec IR1 sur un agitateur de plaque pendant 1 heure.
  14. Après 1 heure, lire l'intensité d'émission à 510 nm (excitation à 365 nm) en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits.
    1. Placer la plaque dans l'instrument et ouvrez le logiciel de lecteur de plaque de mettre en place une nouvelle expérience.
    2. Réglez la nouvelle expérience de lire un critère de fluorescence avec une longueur d'onde d'excitation de 365 nm de longueur d'onde et l'émission de 510 nm. Réglez la largeur de la fente pour les deux longueurs d'onde à 9 nm, avec l'optique à la position supérieure.
    3. Lire la plaque et d'exporter les données pour l'analyse.
  15. Transférer les échantillons à une plaque de 96 puits claire et l'image de la titration en utilisant un transilluminateur UV.

Résultats

Comme le montre la Figure 1, la synthèse de complexes de fractionnement impliquer la Ir1 du pont de chlorure dans le dimère de parent par précipitation du chlorure sous la forme de AgCl insoluble et d'association de molécules d'eau par rapport au centre métallique. La formation de Ir1 a été confirmée par RMN H 1 et ESI. En outre, des bandes caractéristiques de transfert de charge métal-ligand UV-visible et π-π * transitions ont été assignés au spectre, la validation en outre la formation de Ir1. Ce solvaté complexe présente aucun caractère émissive lorsqu'il est excité à 365 nm.


figure-results-1
Figure 1:.: Synthèse et caractérisation de pont Ir1 réaction de chlorure de fendage de Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) phényl) diiridium (III) pour créer le complexe aquo Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1). Lors de l'addition de L-His à la aquo complexe dans un tampon aqueux, le signal luminescent est activé.

Une fois que le complexe a été synthétisé et caractérisé, la sélectivité pour l'acide aminé a été analysée comme décrit précédemment en utilisant une iridium analogique 17 similaire. La figure 2A montre que seule l'histidine a déclenché une réponse de signal à 510 nm, lorsqu'il est excité à 365 nm.


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Figure 2: Acide aminé sélectivité et titrage avec de Ir1 Peptides riche en histidine (A) Interaction de 200 uM de différents acides aminés (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) avec 50 uM. Ir1 dans HBS. Scans spectrales ont été prises 400-700 nm à une longueur d'onde d'excitation de 365 nm dans une plaque de 96 puits noir. Signal en unités relatives de fluorescence (RFU) à partir de tous les acides aminés butre histidine (trace noire en pointillés) était négligeable. Concentrations (B) nanomolaires de BNT-II (▪) et rcHRP-II (♦) ont été titrés avec Ir1 dans HBS. Les peptides riches en histidine ont été incubées avec la sonde pendant 15 min dans une solution avant la lecture de l'émission à 510 nm après excitation à 365 nm de la lumière. La limite de détection a été calculé comme la valeur de x lorsque y = 3σ vide.

Cet "interrupteur marche-" de la phosphorescence de la sonde d'iridium se produit parce que l'état excité singulet (1 MLCT / 1 LC) de l'Ir (III) bioconjugué subit croisement intersystème à l'état excité triplet (3 MLCT), lorsque l'histidine est coordonné au centre métallique. Cette sonde a été appliqué à BNT-II un peptide mimétique du biomarqueur du paludisme Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (pf HRP-II). Dans un titrage de BNT-II avec IR1, une réponse de signal dépendant de la concentration a été observée ( Figure 2B). Recombinant HRP-II (rcHRP-II) a également présenté une réponse similaire en solution. Les limites de détection des BNT-II et rcHRP-II de la solution étaient de 54,8 nM et 12,8 nM, respectivement. En utilisant des techniques d'interférométrie biocouche, le K D de Ir1 lier à BNT-II immobilisé sur une surface Ni (II) NTA a été jugée 2,05 uM (figure 3).

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Figure 3: cinétique en temps réel d'analyse de Ir1 avec BNT-II interférométrie couche biologique pour l'analyse cinétique de diverses concentrations de liaison à Ir1 BNT-II sur la surface d'un capteur de verre (II) Ni NTA.. Après équilibrage des capteurs kb (région A), les capteurs sont chargés avec 0,5 uM BNT-II (région B). Une fois que le peptide est chargé sur les capteurs, une ligne de base est établie (région C) avant de mesurer l'association de Ir1 au BNT-II (région D). Aprèsune période d'association, les capteurs sont placés de nouveau dans KB pour mesurer dissociation (Région E). L'ensemble du processus d'analyse cinétique prend moins de 30 minutes.

Lors d'une transition à partir d'un essai à base de solution à une plate-forme de particules magnétiques, la complexité accrue de la particule dans le système doit être prise en compte. Il était connu de travaux antérieurs, que ces particules se lient efficacement le paludisme biomarqueur pf HRP-II. 24 plaques fluorescentes noires ont bien travaillé pour le dosage de la solution décrit ci-dessus, mais les plaques blanches étaient mieux adaptés à la plate-forme de détection sur-particules, comme vu dans la figure 4A. Dans une assiette blanche, la lumière est réfléchie dans l'échantillon, ce qui permet une meilleure absorption par le Ir1 lié à la surface de la particule. Dans l'essai sur-particules, la limite de détection de rcHRP-II a été déterminée à 14,5 nM (figure 4B). La limite de détection pour rcHRP-II en solution et sur-talon sont statisquement la même basée sur une test t non apparié (p = 0,731).

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Figure 4:. Sur-perle Détection de BNT-II et HRP-II (A) différence entre le signal détecté à partir Ir1 lié à BNT-II sur la surface de 50 um Ni particules agarose (II) NTA magnétiques dans un noir 96- ainsi plaque (trait plein) par rapport à une plaque de 96 puits blanc (ligne pointillée). Les particules ont été excités avec lumière à 365 nm, et l'émission a été mesurée à 510 nm. (B) Le titrage de rcHRP-II immobilisé sur des particules magnétiques et détecté en utilisant Ir1. La limite de détection a été calculé comme le VALue de x lorsque y = 3σ vide.

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Figure 5: Représentation schématique de la détection sur-cordon de rcHRP-II avec Ir1 régime général de HRP-II se lier à la surface de Ni (II) NTA Les particules et marqué avec Ir1.. Les particules sont incubées avec un peptide riche en histidine pendant 15 min. Après cette période d'incubation, les particules sont lavées à l'aide d'un aimant HBST, afin de tirer les particules hors de la solution. Enfin, les particules de peptide lié sont incubées avec Ir1 pendant 1 heure avant la lecture de l'émission à 510 nm après excitation à 365 nm de la lumière.

Discussion

Comme outils de diagnostic basés microparticules viennent à la pointe de la technologie moderne de diagnostic, la détection de biomolécules cibles directement sur la surface de la particule est un atout majeur. Les méthodes de détection moléculaires classiques, tels que ELISA et PCR, sont avantageux en ce qu'ils peuvent atteindre de très faibles limites de détection 25. Cependant, ces tests nécessitent de vastes et longs protocoles réactifs. Cet essai a été conçu pour imiter les interactions en sandwich de type ELISA sans le temps et des exigences de réactif (Figure 5). En outre, le coût de la sonde Ir1 par échantillon a été estimé à environ un centime, alors que le coût d'anticorps pour un ELISA typique est 0,20-0,30 $ par échantillon.

Depuis les méthodes décrites ci-dessus reposent sur ​​une sonde iridium cyclometalated pour la détection du biomarqueur du paludisme, cette sonde ne serait pas sensible aux modes de défaillance communs à d'autres méthodes de détection (ie. Fluorophore de quenching et la dégradation anticorps / enzyme). Histidine est unique dans ses propriétés de fixation métalliques. Le travail présenté profite de ce phénomène en remplaçant les anticorps dans un sandwich typique ELISA avec des complexes contenant des métaux. Ni (II) de NTA capture rcHRP-II sur la surface de la particule et Ir1 signale la présence de la protéine. L'étape la plus critique dans l'essai est de permettre aux particules magnétiques de se mélanger avec l'échantillon et la sonde. Dans une plaque à 96 puits ELISA, les biomolécules et les réactifs atteindre l'équilibre avec la surface à deux dimensions du fond du puits. Les particules magnétiques ont tendance à s'installer hors de la solution en raison de leur base d'oxyde de fer dense, ce qui réduirait les sites de liaison disponibles. Ainsi, les particules doivent être mélangées pendant le temps d'essai pour assurer la liaison maximale.

Lors de la conception d'un réactif pour le diagnostic de la maladie, il faut garder à l'esprit la forme d'échantillon du patient ainsi que la concentration physiologique du biomarqueur. Pourle paludisme, la concentration de pf HRP-II dans le sang d'un patient peut varier de faible à élevé picomolaire nanomolaire. Bien que ce test est cliniquement pertinente pour les niveaux plus élevés d'infection, la limite de détection doit être améliorée afin de détecter les patients asymptomatiques avec une faible circulation picomolaire pf HRP-II. Dans les procédés décrits ci-dessus, la "mise en marche" signal généré par Ir1 se produit en présence d'histidine. Alors que le biomarqueur paludisme est riche en histidine, d'autres protéines sériques, comme l'albumine sérique humaine et riche en histidine glycoprotéine, seraient provoquent une réponse de signal avec la sonde. Ce serait à son tour conduire à des diagnostics faux positifs. Cela rend la capture de la protéine sur la surface de la particule une étape bénéfique, en ce que la protéine d'intérêt peut être extrait rapidement à partir d'un échantillon de patient. En outre, la conception d'une sonde bifonctionnelle, qui couple un peptide riche en histidine à un élément de reconnaissance moléculaire solide (ie. Aptamère), Pourrait ajouter une autre couche de la spécificité de l'essai. Le peptide serait chargé avec l'iridium avant accouplement afin de l'aptamère. Dans une telle conception, la sonde Ir1 stable peut encore être utilisé, tout en réalisant une spécificité de cible avec l'aptamère. Cela permettrait d'application de la sonde pour détecter la HRP-II natif dans une matrice complexe (p. De plasma ou sang total) et de réduire les effets de liaison non spécifiques. Afin d'améliorer encore le signal de tests de diagnostic rapide, le test pourrait être incorporé dans un système électrochimiluminescent (ECL), où pf HRP-II peut être détecté sur le TDR comme lecture électrochimique 26. Cette sonde d'iridium de la prochaine génération améliorerait grandement notre bourrelet sur-dosage ELISA pour la détection de marqueurs biologiques de la maladie.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le soutien de ce travail a été fourni par la Fondation Bill et Melinda Gates Grands défis en santé mondiale : développer des technologies qui permettent l’évaluation de plusieurs affections et agents pathogènes au point de service. K.M.D. a été soutenu par une bourse de recherche supérieure de la NSF (2012095464).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dicholortétrakis(2-(2-pyridinyl)phényl)diiridium(III)  ;Sigma-Aldrich658383
argent trifluorométhanesulfonateSigma-Aldrich176435
Gel de siliceSigma-Aldrich6858
L-Acides aminésFisher Scientificvarie
HEPESSigma-AldrichH3375
BNT-II peptideSynthétisé en interneN/A
Laboratoire de consultants en immunologie HRPII recombinantinc.AGPF-55
Costar polypropylène noir 96 puitsplaque Fisher Scientific07-200-567
Costar polypropylène blanc 96 puitsFisherScientific 07-200-589
Grenier polypropylène noir 96 puitsplaque VWR89089-582
Ni(II)NTA particules d’agarose magnétiqueQiagen36111
Ni(II)NTA capteurs d’interférométrie de biocoucheForteBio18-5101
Octet Red96 Biolayer Interférométrie InstrumetForteBio
Biotek Synergy H4 Lecteur de microplaquesBiotek
Fisher Biotech TransilluminatorFisher ScientificFBDLT-88

Références

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