Un «Patient-Like" Orthotopique Syngénique modèle de souris de carcinome hépatocellulaire Métastases

Résumé

La dissémination métastatique du cancer est la principale cause de décès liés au cancer. Nous fournissons une description en profondeur de notre méthodologie de chirurgie de survie pour établir un système orthotopique "patient comme" modèle de souris syngénique pour étudier les mécanismes de métastases dans les tumeurs d'organes solides.

Résumé

La majorité des décès liés au cancer sont causés par les métastases du cancer plutôt que par la tumeur primitive elle-même. Pourtant, les mécanismes sous-jacents des métastases cancéreuses ne sont pas encore clairs. Les modèles animaux sont essentiels pour élucider les mécanismes et pour évaluer de nouvelles stratégies de traitement des cancers métastatiques. Ici, une description approfondie d’un modèle de souris syngénique orthotopique « semblable à celui du patient » pour explorer les mécanismes de métastase des tumeurs d’organes solides est fournie. L’implantation chirurgicale de survie de cellules de carcinome hépatocellulaire de souris BNL 1ME A.7R.1 directement dans le foie (l’organe d’origine) de la souche de souris de laboratoire immunocompétente de type sauvage, BALB/c, est décrite. Le succès et la reproductibilité de cette méthodologie recommandent son utilisation généralisée dans l’élucidation des mécanismes biologiques des métastases cancéreuses des organes solides.

Introduction

carcinome hépatocellulaire (CHC) est l’un des cancers les plus mortels, avec un mauvais pronostic et une faible espérance de vie. Presque tous les décès liés au cancer sont dus à la propagation métastatique de la maladie de l’organe d’origine à d’autres organes distants^{2 à 6}. La progression du CHC est un processus complexe. Par conséquent, être capable de modéliser le microenvironnement tumoral qui se trouve naturellement dans le CHC métastatique dans des modèles animaux peut s’avérer être un moyen efficace et utile de révéler des mécanismes pertinents chez l’homme. ⁷Malheureusement, les mécanismes des métastases cancéreuses sont encore largement incertains. Par conséquent, il est nécessaire d’établir des modèles animaux qui nous permettront d’élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents des métastases de cancers tels que le CHC^3,5.

Les systèmes de modèles murins constituent une approche très utile pour délimiter les mécanismes et évaluer de nouvelles stratégies de traitement des cancers humains métastatiques^5,8. Les différents systèmes de modèles murins qui existent actuellement témoignent des efforts des chercheurs pour décrire correctement la complexité de la maladie^5,8,9.

Ogunwobi et ses collègues ont récemment utilisé une approche chirurgicale de survie pour démontrer l’établissement d’un nouveau modèle murin syngénique orthotopique pour l’étude des métastases dans le CHC³. Leurs travaux ont permis d’établir un modèle murin « semblable à celui d’un patient » qui récapitule les caractéristiques des CHC agressifs et métastatiques³. Ils ont en outre démontré que ce système modèle de souris peut être utilisé pour étudier la biologie des cellules tumorales circulantes, et que cela a le potentiel d’obtenir de nouvelles connaissances sur les mécanismes des métastases cancéreuses³.

L’objectif de cet article est de décrire en détail la méthodologie utilisée pour établir ce modèle murin syngénique orthotopique de métastases du CHC³. La méthodologie d’implantation des cellules CHC de souris BNL 1ME A.7R.1 directement dans le foie (l’organe d’origine) de la souche de souris de laboratoire immunocompétente de type sauvage consanguine, BALB/c³ à l’aide de la chirurgie de survie, sera décrite. Contrairement à d’autres modèles de tumeurs xénogreffes de souris où des cellules tumorales humaines sont implantées dans des souris immunodéficientes, ce système est syngénique et convient donc à l’étude du rôle du système immunitaire dans les métastases tumorales^3,5,8. Cette approche sera probablement largement utilisée pour étudier les mécanismes des métastases dans les cancers des organes solides.

Protocole

Déclaration éthique
Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) du Hunter College de la City University de New York.

Remarque: Huit souris BALB / c ont été utilisées dans ce mode opératoire expérimental. Cinq souris BALB / c ont été implantés avec 5 ^x 10 6 cellules de carcinome hépatocellulaire BNL 1ME A.7R.1 souris pour produire les tumeurs primaires. Trois souris BALB / c avec aucun implantations ont été utilisés comme témoins. BNL 1ME A.7R.1 est une lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire murin qui a été dérivée par transformation chimique de la non-tumorigène lignée cellulaire d'hépatocytes murins BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 a été obtenu à partir de la American Type Culture Collection (ATCC).

1. Pré-chirurgie

1. Veiller à ce que les souris pour toutes les chirurgies de survie sont en bonne santé. Pour assurer que les souris sont en bonne santé, d'inspecter des signes de déshydratation par tentes de la peau. Ne pas utiliser la souris avec aucune preuve de maladie ou distress dans ces expériences.
2. Peser souris pour vous assurer qu'ils ne sont pas d'insuffisance pondérale. Assurez-vous que le poids est d'au moins 16-20 grammes.
3. Préparer 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 cellules HCC de la souris pour l'implantation par souris:
   1. Aspirer le milieu de 10 ml 60% - plat de 70% de la culture de cellules confluentes de cellules HCC A.7R.1 de souris BNL 1ME. Laver deux fois avec 5 ml de PBS. Ajouter 2 ml de trypsine à l'antenne et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec de l'air et 5% de CO ₂ pendant 5 min.
   2. Par la suite, pipette 10 ul trypsinisées cellules dans un hémocytomètre manuel pour le comptage des cellules au microscope à un grossissement de 10X. Comptez le nombre total de cellules présentes dans les quatre grands carrés de coin et multiplier le facteur de dilution par le nombre total de cellules. Ensuite, on divise par le nombre de carrés comptés et multiplier par ⁶ 10 pour la concentration de cellules (cellules par ml).
   3. En utilisant le calcul, de recueillir 5 millions de cellules par souris dans stérile1,5 ml microtubes. Étiqueter 1,5 ml microtubes.
4. Remettre en suspension les 5 × 10 ^{6 cellules} BNL 1ME A.7R.1 HCC souris dans 100 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Gardez ces cellules sur de la glace jusqu'à l'implantation en chirurgie.
5. Effectuer des activités nécessaires à la préparation de la souris pour la chirurgie, tels que induction de l'anesthésie et les cheveux écrêtage loin de l'équipement et du matériel stérile pour éviter la contamination.
6. Induire une anesthésie générale chez les souris par inhalation d'isoflurane l'aide d'un vaporisateur isoflurane avec l'oxygène à un débit constant de concentration de 1 litre par minute (env. 2,1%). Remarque: Le système est autonome, et comprend un vaporisateur de précision, une alimentation en oxygène et un cartouche de charbon actif qui est relié à un circuit de respiration nécessaire pour le gaz / anesthésie balayage.
7. Assurez-vous que l'anesthésie est suffisante pour empêcher l'animal de subir la douleur pendant la chirurgie. Effectuer toe-pincement et d'observer l'animal en cas de non-responsiveness pour confirmer l'anesthésie.
8. A cette époque, passer la ligne de soupape, joint à la boîte et ouverte sur le cône de nez.
9. Dès que la souris est anesthésiée, appliquer une petite quantité d'une pommade ophtalmique à la cornée comme une mesure préventive contre le dessèchement et les dommages.
10. Par la suite, déplacer l'animal à la zone de préparation, avec le cône de nez correctement placé et connecté (pour entretien de l'anesthésie). Préparer le site de l'incision chirurgicale pour la chirurgie par épilation à cette zone de préparation.
11. Assurez-vous que le domaine de la chirurgie est à un emplacement libre de toute autre activité.
12. Assurez-vous que la surface de travail est robuste et convenablement désinfectés, non sali et avant la chirurgie sans encombrement. Placez un morceau de linge stérile ou plateau chirurgical sur elle.
13. Assurez-vous que le champ opératoire est seulement disponible pour les personnes qui effectuent la chirurgie. Assurez-vous que la pièce chirurgicale est nettoyé et balayé avec un nettoyant approprié et pulvérisé avec un disinfe appropriéectant.
14. Assurez-vous qu'il est également positionné loin des portes et fenêtres que les courants d'air peut se propager la poussière conduisant à la contamination du site.
15. Effectuer la chirurgie de survie avec des instruments stériles. Soit faire tremper les instruments dans un désinfectant selon la recommandation du fabricant ou un autoclave. Utilisez fournitures stériles de base qui sont prêts à l'emploi.
16. Instruments distincts selon leur fonction pour aider à prévenir la contamination des zones stériles.
17. Raser environ 1 pouce autour du site d'incision (incision médiane) pour accéder à la foie de l'animal. Enlever les poils de l'animal en dehors du site de l'intervention chirurgicale.
18. Après le rasage, frotter la zone avec un désinfectant savonneuse (bétadine chirurgicale de gommage) et laver l'excès de désinfectant loin avec une solution stérile PBS. Effectuez cette opération plusieurs fois, avec le processus de gommage toute durée d'environ 5 min. Retirer et jeté les gants usagés.
19. Ensuite, changer de vêtements de protection comme Surgicrobe al, haut de gommage et le masque de visage. Ensuite, désinfecter les mains avec une solution appropriée de gommage avant de mettre des gants chirurgicaux. Note: Ceci est une étape nécessaire pour empêcher une chute et de contaminer le site chirurgical avec des contaminants potentiels.

2. Chirurgie

1. Fournir une source de chaleur externe pour plus de chaleur pendant toute la durée de l'anesthésie. L'animal peut éprouver une certaine hypothermie, car l'anesthésie provoque des perturbations de thermorégulation; par conséquent, de maintenir la température du corps.
2. Posez la souris sur son dos tout au long de la chirurgie.
3. Fixer les membres antérieurs, membres postérieurs et la queue de la souris à la table d'opération avec des morceaux de rubans chirurgicaux.
4. Faire une incision droite immédiatement inférieure à la xyphisternum.
5. Utiliser un écarteur chirurgical autostatique stérile pour exposer le foie.
6. Avec une seringue ayant une aiguille de 20G, lentement et avec précaution, injecter 100 ml de PBS contenant 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1cellules dans le lobe droit du foie de souris HCC.
7. Après avoir retiré l'aiguille, appliquer un tampon de coton stérile pendant au moins 1 min d'arrêter toute hémorragie potentielle raison de la forte vascularisation du foie.
8. Fermez le tissu sous-cutané avec une suture absorbable suivie d'une fermeture de la peau en utilisant des agrafes chirurgicales. Par la suite, nettoyer la plaie avec de la bétadine nouveau gommage. Remarque: Cela permettra d'assurer la fermeture de la plaie chirurgicale.
9. Donner en sous-cutané 100 pi de solution saline normale.

3. post-chirurgie

1. Immédiatement après la chirurgie, transférer la souris dans une cage propre avec une carte d'identité post-chirurgie pour informer les gardiens de la condition de la souris. Fournir de la nourriture et de l'eau. Remarque: Dans notre expérience, une souris qui vient de subir une intervention chirurgicale sera meilleur tarif si logé seul avec la nourriture humide et de l'eau pour la période de 24 heures après la chirurgie initiale.
2. Gardez l'animal au chaud avec une lampe de chaleur qui génère de la chaleur dépassant pas 38 ºC. USE thermomètre pour mesurer la température jusqu'à ce que la souris est entièrement récupéré.
3. Maison de l'animal dans une cage de préférence avec de la literie de papier pour assurer le confort.
4. Après la récupération initiale, surveiller l'animal pour des signes d'inconfort, saignement, douleur et la détresse. Donnez buprénorphine (0,05 -0,1 mg / kg) pour soulager la douleur. Surveiller de près l'activité, le comportement et l'apparence, ainsi que l'eau et la consommation alimentaire pendant environ 2 heures. Si ambulatoires, déplacer l'animal revenir à la zone de logement régulière normale de souris et continuer à surveiller à intervalles de 6-12 h pour 24 h post-chirurgie. Effectuer un contrôle de poids, si désiré.
5. Toutefois, si l'animal a des problèmes récupérer, prendre des mesures de soins de soutien appropriés. Si les souris sont incapables de récupérer, euthanasier humainement souris par _asphyxie au CO2 et dislocation cervicale. Suivez les directives institutionnels approuvés pour l'euthanasie.
6. Post-chirurgie, vérifier les preuves cliniques de HCC qui est habituellement Observable réduction que significative du score d'état corporel. Remarque: À ce stade, une tumeur primaire a probablement développé dans le foie et les dépôts métastatiques ont probablement développé dans les poumons.
7. A ce point, sacrifier toutes les souris (expérimentales et de contrôle) impliqués dans l'expérience par euthanasie. Soumettre les souris à une asphyxie dioxyde de carbone: libérer lentement du dioxyde de carbone dans la chambre sur une période de 5 à 10 min. Cela entraînera un arrêt respiratoire.

Résultats

Les foies de souris Balb / c ont été implantés avec 5 × 10 ⁶ cellules HCC de la souris BNL 1ME A.7R.1. Des preuves cliniques du développement HCC était observable 63 jours post-chirurgie. Par conséquent, les souris ont été euthanasiés. L'autopsie a été effectuée sur des souris euthanasiées. Les poumons et le foie ont été réséquées et un examen macroscopique attention a été réalisée pour identifier les tumeurs macroscopiques. Dans une souris, une tumeur superficielle a été observée sur la surface du foie a...

Discussion

Dans cet article, une description approfondie de la méthode est donnée qui a été récemment rapporté par Ogunwobi et ses collègues de mise en place réussie d'un modèle de souris syngénique orthotopique du HCC métastases (figure 2) ^3. Le taux de participation des tumeurs de cette procédure est généralement élevé. Nous avons déjà observé un taux de participation de la tumeur de 100% ^3. Cependant, le taux d'utilisation peut être variable en fonction de la compétence de l'in...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Micro Pince à Disséquer  ;	Roboz	(RS-5040)	Pointe 0,20 x 0,12 mm
Pince à dissection Graefe Micro, pointe incurvée dentelée	Roboz	(RS-5111)	1 X 2 dents, largeur de pointe incurvée 0,6 mm
Micro écarteur de dissection-Agricola (3 par 3 broches)	Roboz	(RS-6501)	Blunt 3 X 3 griffes, profondeur 4 mm, écartement 25 mm
Micro écarteur de dissection-Goldstein (3 par 3 griffes)	Roboz	(RS-6503)	Émoussé, 3 X 3 griffes, profondeur 4 mm, écartement 19 mm
Jameson Caliper (mesure les tumeurs)	Roboz	(RS-6466)	Échelle 80 mm/3 pouces, chromé  ;
Micro ciseaux de dissection, grands ciseaux annulaires, droits et tranchants	Roboz	(RS-5852)	Lames de 23 mm, longueur 4 pouces, tiges plates et grands anneaux
Scalpel avec lames, pour les procédures de dissection délicates	Roboz	(RS-9861-36)
Manche de scalpel  ;	Roboz	(RS-9884)
Ciseaux à point de Littauer	Roboz	(RS-7074)	Longueur 4,5 pouces
brun, pour un attachage facile des sutures	Roboz	(RS-7960)	Mâchoire convexe, dentelures fines
Clips de plaie Reflex 7MM avec applicateur de clip reflex 7 Roboz		(RS-9262)	méthode alternative sûre et sécurisée de fermeture de la plaie
Plateau à instruments et couvercle	Roboz	RT-1350S
Mini-tondeuse avec lame amovible	Roboz	(RS-5903)
Germinator 500 (the Germ Terminator) Stérilisateur à sec	Roboz	Ds-400, Ds-401, DS-501	Pour une décontamination rapide des instruments de micro-dissection.  ;   ; Les instruments décontaminent en 15 secondes.
Aiguilles de micro-injection	VWR	BD305125	25G Needle

solide Porte-aiguille