L'isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d'un cancer Modèle Souris

Résumé

Il a été démontré que la classe

Les cellules tumorales circulantes (CTC) jouent un rôle important dans les métastases tumorales. Ici, une méthode d’isolement et de propagation de CTC à partir du sang total d’un modèle de tumeur de souris syngénique de métastases de carcinome hépatocellulaire (CHC) est décrite.

Résumé

Les métastases cancéreuses sont la principale cause de décès associés au cancer. Des études récentes ont montré que les cellules tumorales circulantes (CTC) sont importantes dans les métastases cancéreuses. En effet, le nombre de CTC est corrélé à la taille de la tumeur. Ici, une description détaillée est fournie d’une méthodologie d’isolement et de propagation des CTC à partir d’un modèle murin syngénique de carcinome hépatocellulaire (CHC) qui permet une analyse en aval des mécanismes moléculaires potentiellement importants des métastases tumorales d’organes solides. Cette méthode est efficace et reproductible. Il s’agit d’une technique non invasive qui, par conséquent, a le potentiel de remplacer la biopsie invasive de tissus humains qui peut être associée à des complications. Par conséquent, la méthode décrite ici permet d’isoler et de propager les CTC à partir d’échantillons de sang total afin qu’ils puissent être examinés et caractérisés. Cela a un potentiel d’adaptation future pour des applications cliniques telles que le diagnostic et la thérapie ciblée personnalisée.

Introduction

La communauté de recherche sur le cancer connaît l’existence des cellules tumorales circulantes (CTC) depuis qu’elle a été observée pour la première fois par Thomas Ashworth en 1869¹. Depuis lors, il a été démontré que les CTC sont importants dans les métastases tumorales et la progression de la maladie^2-5. Aujourd’hui, les tumeurs solides sont une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde. Les CTC sont des cellules rares qui proviennent de tumeurs primaires et voyagent dans la circulation sanguine vers différents organes, dont seule une petite fraction se développe finalement en métastases^{2 à 5}. Notamment, il existe une corrélation positive entre la taille de la tumeur et le CTC numéro^3,4.

Une compréhension de la biologie du CTC peut contribuer à la recherche d’un traitement ciblé. De plus, les CTC peuvent avoir des applications de diagnostic. Pour réaliser ces applications cliniques potentielles, il faut surmonter certains défis actuels liés à l’étude des CTC. L’un des défis est lié au fait que les CTC peuvent être présents sous forme de cellules uniques ou de grappes, et qu’ils peuvent même être capables de changer de phénotype en réponse au microenvironnement sanguin². De plus, la détection peut être très difficile, en partie en raison du faible nombre de CTC (de quelques à quelques centaines par millilitre) parmi un milliard de cellules hématologiques par millilitre dans le sang⁶. Néanmoins, ces dernières années, la recherche sur les applications cliniques potentielles des CTC dans les cancers des organes solides s’est intensifiée.

Malgré ces efforts, les défis liés à l’étude et à la compréhension du rôle des CTC persistent en raison de la rareté des CTC et de l’inadéquation des outils technologiques actuellement disponibles. Malgré ces défis, l’énorme potentiel d’applications cliniques continue d’inciter à poursuivre la recherche sur le rôle des CTC dans les métastases cancéreuses.

Nous avons récemment réussi à isoler et à propager en culture cellulaire des CTC à partir d’un modèle murin syngénique orthotopique de métastases de carcinome hépatocellulaire (CHC)⁵. L’objectif du présent document est de décrire en détail tous les aspects de la méthodologie réussie. L’importance de cette méthodologie réside dans le fait que cette approche peut être modifiée afin d’isoler et de propager avec succès en culture des CTC humains, augmentant ainsi la possibilité d’études in vitro de la biologie des CTC.

Il existe de multiples applications cliniques potentielles pour l’utilisation des CTC. Les CTC peuvent être utiles pour le pronostic, le suivi de la réponse, le dépistage, la surveillance dynamique des altérations moléculaires tumorales et la thérapie personnalisée⁴. Par conséquent, une meilleure compréhension de la biologie des CTC a un fort potentiel d’impact clinique.

Protocole

Déclaration éthique: Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) du Hunter College de la City University de New York.

1. Procédures pré-expérimentation

1. À l'arrivée à l'animalerie, Maison initialement 3 souris BALB / c à une cage avec une literie de haut et de copeaux de bois filtré. Veiller à ce que les souris ont un accès libre à la nourriture, nourriture pour rongeurs Purina, et de l'eau. Literie et la nourriture doivent être changés deux fois par semaine, alors que les cages doivent être nettoyés une fois par semaine.
2. Induire une anesthésie générale chez la souris en utilisant un vaporisateur isoflurane avec de l'oxygène à un débit constant de 1 litre par minute. Le système est autonome et comprend un vaporisateur de précision.
3. Position animal dans une boîte en plastique sur lequel le vaporisateur de précision et / système de gaz anesthésique est connecté. Initialement fixé le vaporisateur à 2,5 jusqu'à ce que l'animal est inconscient, à quel point réduire le vaporisateur à 2.
4. À ce moment, mettez leLigne de soupape, en le scellant à la surface, et l'ouvrir pour le cône de nez.
5. Déplacez l'animal à la zone de préparation, avec le cône de nez placé et raccordé correctement (pour entretien de l'anesthésie).
6. Préparer 5 × 10 ⁶ cellules HCC de la souris BNL 1ME A.7R.1 pour l'implantation par souris. BNL 1ME A.7R.1 devrait être de plus en plus dans le milieu (10% de FBS inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) l'incubation dans une boîte de culture de cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec de l'air et 5% CO _2.
7. Avec une seringue ayant une aiguille G 20, l'implant 100 pi de PBS contenant 5 x 10 ⁶ cellules de carcinome hépatocellulaire de souris BNL 1ME A.7R.1 dans un lobe de le foie des souris BALB / c pour produire les tumeurs primaires. Post-implantation, maison, les souris BALB / c dans une cage avec les mêmes exigences de maison comme pré-implantatoire.
8. Au point de fin d'expérimentation, des signes cliniques de carcinome hépatocellulaire est observable comme réduction significative de la condition corporellemarquer (généralement détectée après 4 semaines). À ce stade, il est probable que les tumeurs primaires ont développé dans le foie tandis que les dépôts métastatiques ont formé dans les poumons. Par la suite, commence le procédé de l'isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes.

2. Collecte de sang total pour la circulation des cellules tumorales Isolement

REMARQUE: correctement filtrées la zone de la chirurgie et assurez-vous qu'il est sans encombrement. Autoclave tous les instruments chirurgicaux ou faire tremper dans un désinfectant selon les recommandations du fabricant

1. Sacrifiez souris par euthanasie au expérimentale point final (signes cliniques de développement de la tumeur). Euthanasie des souris devrait impliquer CO ₂ asphyxie. Observez la souris correctement pour confirmer l'anesthésie est correctement distribué. Le dioxyde de carbone doit être libéré lentement dans la chambre sur une période de 5 à 10 min, ce qui provoque un arrêt respiratoire. Suivez par exsanguination intracardiaque et cervical dislocation. ⁵
2. Utiliser une aiguille 25 G fixée à une seringue de 1 ml pour la collecte de sang total. Heparanize la seringue avec 0,01 ml d'héparine. Ponction immédiatement la peau avec l'aiguille inférieur au xyphisternum à environ 45 ° d'angle. Avancez lentement aiguille pour percer le cœur, puis abaissez l'angle de l'aiguille. Maintenir fermement l'aiguille et la seringue en place, et d'en tirer 500 pi - 1000 ul de sang entier du cœur.
3. Retirez la seringue et l'aiguille et transférer le sang dans un tube apyrogène 1,5 ml pré-étiquetés. Centrifuger le sang total recueilli dans tube de 1,5 ml apyrogène à 1167 g pendant 5 min.
   REMARQUE: La centrifugation sépare l'échantillon de sang en trois couches: la couche inférieure ou de l'hématocrite constitué de globules rouges, une couche mince intermédiaire de couche leuco-plaquettaire, et une couche supérieure de plasma.
4. Retirer soigneusement le plasma par pipetage et la collecte dans un tube de 1,5 ml apyrogène séparé pour Furthexpériences telles que la détection des acides nucléiques sans cellules ⁷ RE.
5. Pour l'isolement de cellules tumorales circulantes (CTC), de recueillir la couche leucocytaire dans un tube de 1,5 ml apyrogène séparée en préparation de globules rouges (RBC) lyse. Cela est nécessaire pour éliminer les globules rouges résiduels dans la couche leuco-plaquettaire.

3. Recette pour Red Blood Cell (RBC) tampon de lyse

1. Ajouter une solution à 1 L de tampon de lyse RBC.
2. Faire un 500 ml de chlorure d'ammonium et 500 ml de Tris. Puis mélanger pour créer une solution à 1 L de tampon de lyse RBC avec une concentration finale de 155 mM de chlorure d'ammonium et 10 mM de Tris.
3. Tamponner la solution à un pH de 7,5. Conservez le tampon de lyse RBC à +2 et +8 ° C, et porter à RT immédiatement avant l'utilisation.

4. RBC Lysis de Buffy Coat

1. Ajouter 1 ml de tampon de lyse RBC au tube de 1,5 ml apyrogène stérile contenant la couche leucocyto-plaquettaire collectée.
2. Mélanger le contenu du tube parinverser plusieurs fois. Incuber le contenu mélangé du tube pendant 5 min à température ambiante sur le banc. Centrifuger les contenus mixtes pendant 5 min à 1167 x g.
3. Après centrifugation, un culot blanchâtre sera obtenu. Jeter le surnageant rougeâtre lentement et avec précaution dans l'eau de Javel à 10% sans aucune interruption au culot. Si la pastille est pas blanchâtre, refaire les étapes 03.01 à 03.05. L'augmentation de la durée d'incubation dans un tampon de lyse RBC à 10 - 15 min peut également être utile.
4. Éliminer en toute sécurité les déchets biologiques, une fois la décontamination des déchets biologiques dans 10% de javel est complète après 24 h.

5. Propagation dans la culture cellulaire

REMARQUE: Les cellules tumorales sont généralement des cellules en croissance rapide des globules blancs qui sont abondants dans le mélange initial de cellules ensemencées dans le plat. Suite à changement répété de support, et les passages subséquents de CTC, les globules blancs sont éliminés et une population relativement pur de CTC reste.

1. Aprèsélimination du surnageant dans 10% d'agents blanchissants, laver le culot dans une solution saline blanchâtre ml tamponnée au phosphate (PBS) au moins une fois, et remettre en suspension dans un milieu de culture complet pour une propagation dans la culture cellulaire.
2. Une fois lavage est terminée, ajouter 1 ml de milieu de culture complet A.7R.1 BNL 1ME (10% de FBS inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) à la pastille et remise en suspension du culot dans du milieu de culture.
3. Ensemencer le mélange remis en suspension de cellules dans une boîte de culture cellulaire. Incuber la boîte de culture cellulaire à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec de l'air et 5% de CO _2.
4. Changer le milieu de culture cellulaire toutes les deux à trois jours. Après cinq à sept jours, CTC aura adhéré à la boîte de culture cellulaire et a commencé à proliférer. Ces cellules vont rester viable au-delà de 25 passages et après plusieurs cycles gel et de dégel ^5.

6. La vérification du carcinome hépatocellulaire circulation Tumor Cell Line

1. Effectuer APolymerase réaction en chaîne (PCR) à base, pour amplifier un seul segment d'ADN spécifique du gène β-globine souris pour confirmer que le roman a créé des lignées de cellules de la CCT sont des cellules de souris, comme la ligne BNL 1ME A.7R.1 HCC implanté originale. Méthode a été décrite et validée par Steube et al. ^5,8
2. Effectuer immunocoloration pour le spécifique hépatocytes marqueur AMPc protéine de liaison 3-like 3 (CREB3L3) en utilisant un anticorps spécifique élément sensible. Cela confirmera ce roman CTC sont en effet établies hépatocytes comme la ligne originale implanté des cellules BNL 1ME A.7R.1. ⁵

Résultats

La méthodologie décrite ici a montré que les CTC peuvent être isolés. Les souris ont été euthanasiés au expérimentale point final. Le processus impliqué asphyxie du dioxyde de carbone, l'exsanguination intra-cardiaque et dislocation cervicale. Un schéma d'étapes de cette intervention sont illustrées sur la figure 2. Des échantillons de sang total prélevé par exsanguination intracardiaque ont été traitées selon le protocole décrit ci-dessus. Après quoi, la centrifugation a été ut...

Discussion

Dans cette étude, nous avons décrit comment isoler et propager des CTC à partir du sang total d’une souris syngénique atteinte de CHC. L’objectif de ce travail est d’enrichir les études en cours sur les mécanismes des métastases cancéreuses.

Un facteur qui contribue au mauvais pronostic de nombreux cancers est le manque de détection précoce et la dissémination généralisée de la tumeur maligne³. Les CTC proviennent de cancers primitifs et se propagent par la circulation sanguine ver...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Héparine Sel de sodium 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1,5 ml Transparent NS	VWR	89511-254	1,5 ml sans pyrogène Eppendorf Tubes
Aiguille Stérile Disp BD 25 G x 1 po	VWR	BD305125	25 G
Aiguille Slp Tip SRNG 1 ml 200 chacun par paquet	VWR	BD309659	1 ml Embout de seringue
Seringue 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	Seringue de 1 ml
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Pince
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Verre de couverture
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	Stylo PAP
Eau sans RNASe et DNAse 2 L	VWR	101454-204	d’eau sans nucléase
Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tampon Tris
Chlorure d’ammonium ACS Grade 2, 5 kg	VWR	97062-048	Tampon au chlorure d’ammonium
Falcon Boîte de culture tissulaire 60 x 15 mm Style polystyrène	VWR	353002	Boîte de culture tissulaire
Clorox Eau de Javel, régulière	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (solution saline tamponnée au phosphate) sans calcium ni magnésium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  ; avec 4,5 g/L de glucose & L-glutamine sans pyruvate de sodium	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x milieu pour cellules BNL 1ME A.7R.1
Sérum fœtal bovin	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Pénicilline Streptomycine Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Pénicilline Streptomycine
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	Centrifugeuse à 13 000 tr/min

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