Souris Direct Trauma / Graver Modèle d'ossification hétérotopique

Résumé

Un modèle de ténotomie d’Achille et de brûlure de l’ossification hétérotopique permet l’étude fiable de la formation osseuse ectopique induite par un traumatisme sans l’application de facteurs exogènes.

Résumé

L’ossification hétérotopique (OH) est la formation d’os à l’extérieur du squelette qui se forme à la suite d’un traumatisme majeur, de brûlures et d’interventions chirurgicales orthopédiques. La majorité des modèles animaux utilisés pour étudier l’OH reposent sur l’application de substances exogènes, telles que les protéines morphogénétiques osseuses (BMP), les constructions cellulaires exogènes ou les mutations génétiques dans la signalisation BMP. Bien que ces modèles soient utiles, ils ne reproduisent pas avec précision les états inflammatoires à l’origine de la majorité des cas d’OH. Nous décrivons ici un modèle de brûlure/ténotomie chez la souris qui produit de manière fiable une OH focalisée. Ce protocole consiste à créer une brûlure de contact de 30 % de la surface corporelle totale, une brûlure de contact d’épaisseur partielle sur la peau dorsale ainsi qu’une division du tendon d’Achille à son point médian. Le fait de s’appuyer uniquement sur une lésion traumatique pour induire une OH à un endroit prévisible permet d’étudier dans le temps la formation osseuse hétérotopique endochondrale à partir des processus physiologiques intrinsèques et de l’environnement uniquement. Cette méthode pourrait s’avérer déterminante dans la compréhension des voies inflammatoires et ostéogéniques impliquées dans l’OH induite par un traumatisme. De plus, comme l’OH se développe dans un lieu et une évolution temporelle prévisibles dans ce modèle, il permet la recherche pour améliorer les stratégies d’imagerie précoce et les modalités de traitement afin de prévenir la formation d’OH.

Introduction

L’ossification hétérotopique (OH) est la formation d’os ectopique dans lequel les cellules ostéo-puissantes sont induites de manière aberrante à former de l’os endochondral à l’extérieur du squelette. Bien que les détails de la voie de formation des OH soient encore largement inconnus, un paradigme accepté comprend trois facteurs clés : un incident inflammatoire incitatif, une niche permissive et des cellules souches mésenchymateuses capables de former de l’os. ^{1-3 L’OH} est une comorbidité courante qui complique plus de 60 % des brûlures graves, 65 % des blessures liées au combat et 10 % des cas de chirurgie orthopédique invasive. ^4,5 Cependant, il est souvent difficile de prédire où l’OH se formera, car elle peut se produire à des endroits où des lésions sont subies localement ou à des endroits éloignés qui pourraient ne pas être blessés autrement. Cette variabilité de localisation rend difficile l’intervention prophylactique pour prévenir la formation osseuse réactive de manière ciblée localement. Il existe également des formes congénitales d’OH telles que la fibrodysplasie ossifiante progressive (FOP) dans lesquelles les patients sont sujets au développement d’une OH robuste en réponse à un traumatisme mineur ou à une agression inflammatoire. De puissants modèles animaux utilisant des souris transgéniques ont reproduit ce phénotype et ont fourni des informations sur les voies moléculaires qui peuvent également être importantes dans l’OH induite par un ^{traumatisme.6-9} La recherche translationnelle sur la pathogenèse de l’OH non congénitale a utilisé une grande variété de constructions allant de la blessure seule à l’implantation de matériaux et/ou de cellules ostéo-inductifs exogènes. ^{10 à 13}

Dans nos travaux précédents, nous avons validé un modèle simple et fiable de formation de HO chez la souris qui ne nécessite pas l’administration de matériel exogène. ^14-17 Ce modèle a créé deux conditions clés pour initier l’OH : un traumatisme local et une inflammation globale. Cela a été réalisé grâce à l’utilisation d’une ténotomie d’Achille (traumatisme local) combinée à une brûlure à distance (inflammation globale). Les souris ont reçu les deux traitements en même temps et ont développé une quantité robuste de HO qui pouvait être analysée par des moyens histologiques, radiologiques et moléculaires. Il est intéressant de noter que les brûlures concomitantes ont considérablement augmenté la quantité d’OH qui s’est formée et ont accéléré son développement. ^{L’OH 14-16} s’est développée à des endroits prévisibles autour du calcanéum, de l’articulation de la cheville et du tibia/péroné du membre qui a subi la ténotomie. La fiabilité du développement de l’OH à un endroit connu a permis un examen ciblé des caractéristiques moléculaires et histologiques aux premiers stades de l’ossification ectopique. ^14,17 À ce jour, 100 % des souris (plus de 50 animaux) ayant subi une ténotomie et des brûlures concomitantes ont développé une OH. De plus, des images longitudinales 2D et 3D et des analyses spectroscopiques ont été effectuées pour examiner le profil de croissance et la composition biochimique de ^l’OH15,16

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Protocole

Déclaration éthique: Toutes les procédures d'animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les bonnes pratiques de l'animal tel que défini dans les directives fournies dans le Guide pour l'utilisation et l'entretien des animaux de laboratoire: huitième édition de l'Institute for Laboratory Animal Research (ILAR, 2011) et ont été approuvé par le soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de l'Université du Michigan (PRO0001553).

1. Souris Interventions chirurgicales

REMARQUE: Utilisez 8-10 semaine vieille souris C57BL / 6. Autres âges, des origines et souches de souris peuvent également être utilisés pour tester des conditions différentes ou génétique. Pour la partie de ténotomie de la procédure, de maintenir des conditions stériles en utilisant un masque, bonnet de cheveux, et blouse stérile, des gants et des instruments. Sites chirurgicaux doivent être préparés avec stérilement povidone-iode et drapage stérile. Éviter l'hypothermie en utilisant un coussin chauffant vétérinaire et le réchauffement des solutions de réanimation à 37 ° C avant d'administration.

1. Anesthésier la souris en utilisant 2,5% d'isoflurane inhalé. Utilisez un cône de nez de quitter le dos et membres postérieurs facilement accessible. Réglez la vitesse d'administration de l'isoflurane pour maintenir le taux respiratoire appropriée et la coloration des muqueuses et de veiller à l'anesthésie en vérifiant le tonus musculaire, pincement de l'orteil, et réflexe cornéen. Appliquer une pommade ophtalmique fade aux yeux de la souris pour éviter les blessures de l'oeil sec lors de la procédure. Maintenir la température corporelle adéquate en utilisant un coussin chauffant vétérinaire ou circulateur d'eau chaude sous le champ chirurgical.
2. Administrer la buprénorphine, 0,1 mg / kg, voie sous-cutanée immédiatement avant l'intervention chirurgicale pour l'analgésie.
3. Raser de près le site chirurgical sur la patte arrière gauche l'aide de tondeuses du talon au genou.
4. Étroitement raser le dos de la souris, en commençant sur la colonne vertébrale et l'extension de la zone rasée à la gauche de la ligne médiane dorsale, nettoyer une zone d'au moins 2 cm x 3 cm pour accueillir la brûlure.
5. Préparer le site chirurgical, y compris la patte postérieure du genou en utilisant 3 alternance gommages povidone-iode.
6. Effectuer une incision longitudinale le long de la face médiale du tendon d'Achille gauche. Elargir l'incision de sorte que le tendon d'Achille peut être visualisé facilement; environ 0,5 cm.
7. Effectuer une ténotomie d'Achille avec dissection du tendon au milieu avec des ciseaux pointus de tissus. Insérer une lame de ciseaux de tissu dans le plan du tissu au-dessous du tendon et disséquer le long du plan jusqu'à ce que la lame est au point médian du tendon. Fermez les lames de ciseaux pour sectionner le tendon fortement.
   REMARQUE: Veiller à l'inclusion de tous les tendons postérieurs y compris Gastrocnemius, soléaire et tendons plantaire.
8. Hémostase en appliquant une pression avec de la gaze stérile (il devrait y avoir un saignement minime) et fermer l'incision de la peau avec un point 5-0 de vicryl.
9. Effectuez la dorsale partielle brûlure d'épaisseur avec un bloc d'aluminium pesant 35 g avec approximatives DE MESUREts 2 cm x 2 cm x 3 cm chauffé à 60 ° C dans un bain d'eau appliquée sur la face dorsale rasée de la souris pendant 17 sec.
   Remarque: obtenir la profondeur de gravure approprié en plaçant le bloc au-dessus de la souris anesthésiée, veiller à ce que toute la zone de surface du bloc est au contact de la souris, cependant éviter d'appliquer une pression supplémentaire sur le bloc, à savoir, permettre à la gravité pour être la seule force de maintien le bloc en place. Une poignée en matière plastique mince fixée à un côté du bloc est commode pour la manipulation, la stabilisation et la récupération à partir du bain d'eau chaude. Cela va créer un organisme surface totale d'environ 30% à brûler dans une ancienne 8-10 semaine souris C57BL / 6. Cette brûlure de contact a été choisi sur les autres méthodes (flamme ou brûlure brûlures) en raison de l'uniformité de la profondeur de la brûlure sur la plaie et la reproductibilité entre les animaux.
10. Sécher le site de la brûlure avec de la gaze et appliquer un pansement Tegaderm.
11. Administrer des fluides de réanimation réchauffés: solution 1 ml de Ringer lactateinjection intraperitoneale et injection sous-cutanée de 0,5 ml. Cette administration unique de la réanimation est adéquate pour la récupération de la blessure de brûlure et ténotomie.
    REMARQUE: Ne pas revenir souris anesthésiées dans des cages de logement avec d'autres souris, maison individuellement dans des cages propres sous surveillance jusqu'à ce que les souris sont complètement rétablis. Récupération type se produit dans 1-6 hr. les sites de gravure guérissent généralement dans les 2-4 semaines et sont rarement compliqués par infection de la plaie si elles sont conservées dans des environnements de logement propres.
12. Administrer buprénorphine 0,1 mg / kg injection sous-cutanée toutes les 12 heures pendant 3 jours suivants la procédure. Surveillez la croissance HO avec des scans de μCT série à des intervalles appropriés. La croissance osseuse ectopique est la première évident environ 3 semaines post-op par μCT.
    NOTE: La majorité du développement HO est terminée par neuf semaines post-op. Nous avons pas observé de différence de volume HO ou l'emplacement avec répétée μCT scans bi-hebdomadaire pendant 15 semaines comparativement à un seul point final μCT numériser à 15 semaines.A la fin des expériences, toutes les souris euthanasie avec CO ₂ inhalation selon les directives institutionnelles et vérifier mort à la dislocation cervicale après 10 min.

2. μCT acquisition et d'analyse

1. Fixez la souris anesthésiés sur la vitre du scanner dans la position couchée. Collez les membres postérieurs en toute sécurité vers le lit pour éviter de respirer un artefact de mouvement. Inclure l'air, l'eau, et d'hydroxyapatite contenant fantôme sous la souris pour l'étalonnage de l'image.
2. Ouvrez le logiciel d'analyse d'os et de définir une région d'intérêt (ROI) qui englobe les deux membres postérieurs de l'articulation de la hanche proximale à l'extrémité de la patte arrière distale. Obtenir une image en utilisant les paramètres suivants:. 80 kV, 500 pA et 1300 msec exposition, 48 um taille de voxel ^14,15
3. Calibrer l'image pour unités Hounsfield (HU) en dessinant un retour sur investissement dans chacune des trois chambres de fantômes et de la saisie de la densité moyenne dans les champs appropriés dansle logiciel.
4. Utilisation de la "grabber" outil dans le logiciel, réorienter l'image de sorte que le tibia de la patte arrière gauche est parallèle le long de l'axe Z pour permettre à la vue anatomique la plus claire pour la délimitation des structures osseuses corticales orthotopiques et HO.
5. Commençant au niveau du genou, faites défiler distale à travers les tranches d'image jusqu'à HO est rencontré. Utilisation de l'outil manuel de spline, faire un retour sur investissement autour de l'os ectopique sur chaque 5 ^ème tranche continue distale à travers la patte ou jusqu'à ce que HO a été dépassé. Utilisez l'outil de extrapoler à étendre et à assembler les ROI ensemble dans un ROI qui contient toutes les HO.
6. Faire un ROI 3D et choisissez le menu d'analyse. Calculer le volume osseux par le réglage des valeurs seuils inférieure et supérieure qui montrent le mieux la fenêtre osseuse. Utilisez les mêmes valeurs seuils fixés pour toutes les analyses.

Résultats

Dans la présente étude, le protocole est décrit par le modèle de souris précédemment publié des traumatismes / brûler induite HO. ^14-17 Cela implique la création d'une blessure musculo-squelettique localisée concurrente avec une ténotomie Achille et agression inflammatoire mondial avec une épaisseur partielle brûlures. Il en résulte la formation fiable de l'os au niveau du site réactif de ténotomie qui peut être suivie à l'imagerie en série. À ce jour, toutes les souris (plus de 50) qui ont souten...

Discussion

L’ossification hétérotopique représente une déficience fonctionnelle majeure à laquelle sont confrontés les patients qui subissent des traumatismes, des brûlures et des procédures musculo-squelettiques invasives. La population la plus à risque est celle des soldats dans les conflits modernes qui ont subi d’importantes blessures dues à des explosions dues à des mécanismes tels que les engins explosifs improvisés (EEI). ¹⁸ L’amélioration du gilet pare-balles et des unités médicales positionnées à l’avant perme...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C57BL/6 souris	Jackson Laboratory	664	8-10 semaines
Isoflurane &ndash ; Fluriso	VET one, Boise, ID	V1 501017
Buprénorphine &ndash ; Buprenex	Reckitt Benckiser Healthcare	NDC 12496-0757-1	0,3 mg/ml solution
Betadine	Owens and Minor, Mechanicsville, VA	2047PVP202
5-0 Vicryl sutures	Ethicon, Summerville, NJ	J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Couper en deux pour couvrir correctement le site de brûlure
et micro ; CT - GE eXplore Locus SP	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application	Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada

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