L’imagerie spectroscopique électronique permet d’imager et de distinguer l’acide nucléique de la protéine à une résolution nanométrique. Il peut être combiné avec le système miniSOG, qui est capable de marquer spécifiquement les protéines marquées dans des échantillons de microscopie électronique à transmission. Nous illustrons l’utilisation de ces technologies en utilisant des foyers de réparation de cassures double brin à titre d’exemple.
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Article de méthode
Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d'ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les limites de résolution optique et le défi de l'identification des populations de protéines spécifiques dans microscopie électronique en transmission ont été des obstacles en biologie cellulaire. Plusieurs phénomènes peuvent pas être expliqués par une analyse in vitro dans des systèmes simplifiés et ont besoin d'une information structurelle supplémentaire in situ, en particulier dans la plage comprise entre 1 nm et 0,1 pm, de manière à être entièrement compris. Ici, l'imagerie spectroscopique électronique, une technique de microscopie électronique en transmission qui permet la cartographie simultanée de la distribution des protéines et des acides nucléiques, et une étiquette d'expression, miniSOG, sont combinés pour étudier la structure et l'organisation de l'ADN double brin réparation des cassures foyers.
Introduction
Malgré les avancées significatives dans la microscopie optique au cours des dernières années 1, biologistes cellulaires souffrent encore d'une lacune dans la résolution. Cela limite la compréhension des relations structure-fonction dans les processus cellulaires fondamentaux qui impliquent l'interaction coordonnée entre les complexes macromoléculaires (par exemple, dans le remodelage de la chromatine, la réparation d'ADN, la transcription d'ARN et la replication d'ADN). Bien que des microscopes électroniques à transmission (MET) s fournir la résolution requise, il a été difficile de définir ces processus structurellement en rai....
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Protocole
1. Génération de miniSOG lignées cellulaires
- Cultiver U2OS (de l'ostéosarcome humain) des cellules dans une boîte de 35 mm contenant 2 ml de bas glucose milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), qui est complété avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 atmosphère.
- Transfecter les cellules quand elles sont confluentes à 80% par lipofection avec la qualité de transfection purifié (A269 / rapport 280 de 1,8 à 2,0) des constructions plasmidiques contenant des séquences pour miniSOG et mCherry étiquetés protéines de réparation selon le protocole du fabricant du réactif de transfecti....
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Résultats
ESI
En comparant les images du noyau ESI (figure 1) avec les images de TEM classiques (par exemple, la figure 1.7) révèle une augmentation spectaculaire des structures anatomiques qui peuvent être facilement distingués. Les crêtes de la chromatine apparaissent en jaune et il est assez facile d'identifier les chromocentres dans les cellules de souris. Nucléoles peut être facilement distinguée de la chrom.......
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Discussion
ESI peut servir comme un excellent outil pour examiner les différents états de la chromatine et ribonucléoprotéines dans le noyau, car il est capable de cartographier précisément les zones qui sont riches en phosphore. Il augmente profondément la quantité de détails qui peut être obtenue par un microscope électronique et ne dépend pas de méthodes non spécifiques contrastées. Un inconvénient de ESI est qu'il nécessite des sections plus minces que TEM conventionnelle à la même tension d'accélération. Ceci peut êtr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions le Dr Roger Tsien de nous avoir fourni les constructions miniSOG. Le Dr Xuejun Sun pour son aide avec le TEM. Lisa Lem et Peter Shipple du Cross Cancer Institute pour avoir fourni de l’oxygène. Hilmar Strickfaden est titulaire d’une bourse postdoctorale de l’Alberta Cancer Foundation et a reçu le soutien de la Bayrische Forschungsallianz. Ces travaux ont été financés par des subventions des Instituts de recherche en santé du Canada et de l’Alberta Cancer Foundation.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plats à fond en verre de 35 mm | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Plats à fond en verre quadrillés de 35 mm | MatTek | P35G-2-14-CGRD ; | Non conçu pour les objectifs d’immersion |
| LR Blanc : résine acrylique | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3&prime ;-Diaminobenzidine tétrachlorhydrate 10 mg comprimés | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Tétroxyde d’osmium | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbone | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | pourrait même fonctionner avec les anciennes versions | |
| Micrographie numérique V.2.30 | Gatan | pourrait même fonctionner avec les anciennes versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| tsienlab@yahoo.com | |||
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| source de rayonnement césium 137 « MARC 1" | ;( J.L. Shepherd et ImageJ | ||
| /FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Tubes Eppendorf | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° ; | de diatomées | ||
| ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydraté | emsdiasum | 12300 | Attention Toxique ! |
| Glutaraldéhyde EM Grade 8 % | emsdiasum | 16020 | Attention Toxique ! |
| Phosphate de sodium dibasique | emsdiasum | 21180 | |
| Phosphate de sodium monobasique | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldéhyde | emsdiasum | 19202 | |
| Tétroxyde d’osmium 4 % solution | emsdiasum | 19150 | |
| Micoscope à fluorescence inversée Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Acide | chlorhydriqueFisherbrand | A142-212 | |
| Solution d’hydroxyde de sodium 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygène | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Cyanure de potassium | Sigma | 207810 | Attention Toxique ! |
| Éthanol | emsdiasum | 15058 | Attention Toxique ! |
| Lame de rasoir Single Edge Acier au carbone | emsdiasum | 71960 | Attention Sharp ! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Microscope électronique à transmission 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Filtre à énergie | Gatan |
Références
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein....
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Réimpressions et autorisations
