Article de méthode

Génération des solutions évolutives de métal de très haute-Aspect Ratio nanocomposites dans un milieu liquide biologique

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DOI :

10.3791/52901

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8 juillet 2015

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1Biophysics Department, Centenary College of Louisiana, 2Department of Chemistry, Louisiana Tech University, 3Department of Integrative Physiology, University of North Texas Health Sciences Center, 4Biomedical Engineering, Louisiana Tech University, 5Institute for Micromanufacturing, Louisiana Tech University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole à synthétiser de nouveaux, de haute rapport d'aspect biocomposites dans des conditions biologiques et dans des milieux liquides. Les biocomposites échelle du nanomètre au micromètre de diamètre et de la longueur, respectivement. nanoparticules de cuivre (CNPS) et du sulfate de cuivre combinés avec la cystine sont les éléments clés pour la synthèse.

Résumé

L'objectif de ce protocole est de décrire la synthèse de deux nouveaux biocomposites avec des structures de ratio d'aspect élevé-. Les biocomposites sont en cuivre et la cystine, soit avec des nanoparticules de cuivre (CNPS) ou du sulfate de cuivre qui contribue le composant métallique. La synthèse est effectuée dans un liquide dans des conditions biologiques (37 ° C) et la forme des composites auto-assemblées après 24 h. Une fois formés, ces composites sont très stables dans les deux milieux liquides et sous une forme séchée. Les composites échelle du nano aux micro gamme de longueur, et de quelques microns à 25 nm de diamètre. La microscopie électronique à balayage à émission de champ avec une spectroscopie à dispersion d'énergie aux rayons X (EDX) a montré que le soufre était présent dans les structures linéaires NP-dérivés, tandis qu'il est absent de la matière CNP départ, ce qui confirme la cystine en tant que source de soufre dans les nanocomposites finaux . Lors de la synthèse de ces nano et micro-composites linéaires, un large éventail de longueurs de structures est formée dans le récipient de synthèse. La sonication du mélange liquide après la synthèse a été démontrée pour aider à contrôler la taille moyenne des structures en diminuant la longueur moyenne avec l'augmentation du temps de sonication. Étant donné que les structures formées sont très stables, ne pas agglomérer, et sont formées dans la phase liquide, la centrifugation peut également être utilisée pour aider à concentrer et séparer les composites formés.

Introduction

Le cuivre est un métal hautement réactif qui, dans le monde biologique, est essentiel dans certaines fonctions enzymatiques 1,2, mais à des concentrations plus élevées, il est puissamment toxique, y compris sous forme nanoparticulaire 3,4. Les préoccupations concernant la toxicité du cuivre sont devenues plus pertinentes à mesure que les CNP et d’autres nanomatériaux à base de cuivre sont utilisés, en raison de l’augmentation de la surface/masse des nanostructures. Ainsi, même une petite masse de cuivre, sous forme de nanoparticules, pourrait provoquer une toxicité locale en raison de sa capacité à pénétrer dans la cellule et à se décomposer en formes réactives. Certaines espèces biologiques peuvent se complexer avec des ions métalliques et les chélater, et même les incorporer dans des structures biologiques, comme cela a été décrit dans Moules marines 5. En étudiant les effets toxiques potentiels des nanomatériaux 4, il a été découvert qu’au fil du temps, et dans des conditions biologiques utilisées pour la culture cellulaire typique (37 °C et 5 % de CO2), des biocomposites de cuivre stables pouvaient se former avec une structure à rapport d’aspect élevé (linéaire).

Par un processus d’élimination, la découverte initiale de ces biocomposites linéaires, qui s’est produite dans des milieux de culture cellulaire complets, a été simplifiée en un protocole défini d’éléments essentiels nécessaires à l’auto-assemblage des biocomposites. L’auto-assemblage de deux types de biocomposites hautement linéaires s’est avéré possible avec deux composants métalliques de départ : 1) les CNP et 2) le sulfate de cuivre, le composant biologique commun étant la cystine. Bien que des structures plus complexes, dites « oursins » et « nanofleurs », contenant du cuivre avec des caractéristiques à l’échelle nanométrique et microscopique, aient déjà été signalées, celles-ci ont été produites dans des conditions non biologiques, telles que des températures de 100 °C ou supérieures à 6-8. À notre connaissance, la synthèse de nanostructures individuelles linéaires contenant du cuivre et évolutives en phase liquide dans des conditions biologiques n’a pas été décrite auparavant.

L’un des matériaux de départ utilisés pour la synthèse des nanocomposites, à savoir les CNP, a déjà été signalé comme étant très toxique pour les cellules 4. Il a récemment été rapporté qu’après la formation des nanocomposites, ces structures sont moins toxiques en masse que les NPs de départ 9. Ainsi, la synthèse décrite ici peut être dérivée d’une réaction biologique et biochimique qui a une utilité dans la stabilisation des espèces réactives de cuivre, à la fois dans le sens de transformer la forme NP en structures plus grandes et dans la production de composites moins toxiques pour les cellules.

Contrairement à de nombreuses autres formes de nanomatériaux qui sont connues pour s’agréger ou s’agglomérer lors de l’interaction avec des milieux liquides biologiques 10,11, une fois formés, les composites hautement linéaires décrits ici évitent l’agrégation, peut-être en raison d’une redistribution de charge qui a été précédemment signalée 9. Comme détaillé dans le travail actuel, cet évitement de l’agrégation est pratique pour travailler avec les structures une fois formées pour au moins 3 raisons : 1) les structures composites une fois formées peuvent être concentrées par centrifugation, puis facilement dispersées à nouveau par mélange vortex ; 2) les structures formées peuvent être réduites en taille moyenne par sonication pour différentes périodes de temps ; et 3) les structures linéaires formées peuvent fournir un outil supplémentaire pour éviter l'« effet d’anneau de café » récemment décrit 12 et ainsi fournir un dopant pour créer des revêtements de matériaux plus uniformément répartis, en particulier ceux contenant des particules sphériques.

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Protocole

1. Planification d'expériences

  1. Déterminer le volume de nanocomposites de cuivre nécessaires pour la synthèse. Sur cette base, choisir un certain nombre de petits flacons de volume (25 cm 2), ou les grands flacons, comme indiqué ci-dessous dans la préparation des matériaux.
  2. Pour cette synthèse, en utilisant un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 et au moins 40% d'humidité. Assurez-vous que un tel incubateur est disponible et qu'il ne sera pas perturbé à plusieurs reprises au cours de la période de synthèse (environ 24 h).
    ATTENTION: l'ouverture et la fermeture répétées de l'incubateur va certainement causer des fluctuations de température qui peuvent résulter de la synthèse modifiée des structures nanocomposites.

2. Préparation des matériaux

  1. Préparer tous les nouveaux matériaux avant le début d'une expérience, en ajoutant des matériaux solides aux solvants juste avant la synthèse est de commencer. Garder solutions de stockage de matériaux de cystine et de départ de cuivre dans le liquide pour de longues durées bvant l'expérience est déconseillé et peut conduire à des résultats variables. Une fois ouvert auprès du fournisseur, garder les matières sèches en enveloppant le haut du conteneur avec du Parafilm départ.
    Remarque: Le protocole suivant est utilisé comme un exemple de réaction dans un 25 flacon de culture cm 2 de cellules en utilisant 7 ul de cystine, 6,643 pi d'eau stérile, et 350 ul de CNPs.
  2. Préparer une solution à 2 mg / ml de nanoparticules de cuivre en pesant au moins 2 mg de CNPs. Porter des gants jetables lors de cette étape pour éviter tout risque de contact avec la peau du CNPS. Placez les nanoparticules dans un vide stérile 16 ml flacon en verre.
    1. Pour le flacon contenant CNPS, ajouter de l'eau déminéralisée stérile dans le volume approprié de faire une solution à 2 mg / ml et vortex la solution pendant 20 secondes afin de fournir dispersion des nanoparticules de synthèse commence avant (au moins 1 ml volume total est recommandé). Ne pas remplir le plus de la moitié du flacon avec de l'eau car cela va inhiber le mélange au vortex. CNPs will régler rapidement au fond du flacon et apparaîtra de couleur foncée (gris au noir).
    2. Soniquer la solution CNP pour 17 min à température ambiante pour assurer une dispersion maximale de CNPs avant le début de la synthèse. Vérifiez régulièrement pour vous assurer que CNPs confondez due à ultrasons. Après un traitement par ultrasons succès, CNPs restent en suspension dans la solution pendant au moins 30 min et la solution sera de couleur foncée.
  3. Peser une masse suffisante de la cystine pour former une solution / ml de 72,9 mg pour la synthèse. Depuis cystine est pas directement soluble dans l'eau, placez la cystine pesé dans un récipient de pesée antistatique.
    1. Dans le récipient contenant la cystine pesage, ajouter un volume suffisant de, 1 M de NaOH stérile, de sorte que la cystine se dissout complètement. Par exemple, dissoudre 7,29 mg de cystine complètement dans 100 pi de NaOH 1 M, de faire un / ml solution 72,9 mg.
    2. Pour maintenir des conditions stériles, réaliser cette étape dans un tissu d'écoulement culture hotte stérile.
      ATTENTION: NaOHà 1 M concentration est caustique, donc porter des gants jetables lors de cette étape pour éviter le contact de NaOH concentré avec la peau
  4. Travailler dans une culture tissulaire hotte stérile, ajouter 7 pi de cystine avec 6643 ul d'eau stérile dans le flacon de synthèse stérile premier, et laisser incuber pendant 30 minutes dans l'incubateur à 37 ° C avec le bouchon de flacon ventilé (en vrac) pour fournir efficace mélange. Reprendre le / ml solution CNP 2 mg par vortex pendant 30 secondes, depuis CNPs aura réglé après l'étape de traitement par ultrasons.
    1. Ajouter CNP solution dans le ballon de synthèse (en utilisant une technique stérile) afin de maintenir les rapports de composants suivants: combiner une cystine parties, 50 parties CNPS, et 949 parties d'eau stérile dans un 25 cm2 ballon de culture de cellule pour commencer la synthèse. Par exemple, pour un volume de synthèse 7 ml, mélanger 7 pi de solution cystine boursier, 350 pi du CNPS, et 6643 pi d'eau stérile. Replacez le bouchon sur le flacon et serrer de sorte qu'il est sécure.
    2. Après combinant tous les composants pour la synthèse, mélanger doucement dans le ballon en secouant 4-5 fois. Placer la fiole dans incubateur à CO 2 et évacuer la fiole en dévissant le bouchon de sorte qu'il y ait un échange de gaz dans et hors de la fiole pendant la synthèse.
  5. Laisser la synthèse afin de fonctionner dans l'incubateur pendant environ 24 h. Lors de la synthèse, on peut observer, à la microscopie et à l'oeil, la formation de composites très linéaires.
    Remarque: Le processus de formation des structures peut arriver tout à coup dans le sens que les structures sont d'abord difficile à détecter, puis apparition procède rapidement à une augmentation de la densité. Formation peut donc se produire avant 24 h. Le processus peut également être observée à l'oeil fois que les structures deviennent plus grandes et leur densité augmente. Alors que la génération des structures peut être observée au fil du temps sous le microscope et à l'œil à des moments plus tard, interrompant continuellement les conditions de synthèse et la température va conduire à une mauvaiseles résultats de la synthèse.
  6. Mettre fin à la synthèse de biocomposites en coiffant hermétiquement la fiole de synthèse et le stockage du récipient dans un réfrigérateur (4 ° C). Structures, une fois générés, restent stables sous cette forme pendant au moins un an. Etiqueter le flacon avec des conditions de synthèse, y compris les composants utilisés, la date de la synthèse, et le temps d'incubation de la synthèse avant la fin.

3. Synthèse Utilisation de sulfate de cuivre

  1. Réaliser la synthèse auto-assemblage en remplaçant CNPs avec du sel de sulfate de cuivre. En utilisant une technique stérile, dissoudre au moins 2 mg de sulfate de cuivre dans un volume suffisant d'eau déminéralisée stérile de faire un / ml, solution à 2 mg. Les cristaux de sulfate de cuivre vont facilement dans la solution à cette concentration, mais Vortex le flacon si nécessaire, et inspectent visuellement à assurer que tous les cristaux sont dissous.
  2. Après la préparation du sulfate de cuivre, de réaliser la synthèse comme décrit précédemment, mais en remplaçant CNPs avec le sulfate de cuivre.
    Remarque: nanocomposites auto-assemblées à l'aide de sulfate de cuivre comme matériau de départ ont été trouvés à être beaucoup plus cohérent dans la forme finale que pour des structures synthétisées à partir de PNC.
  3. Terminer la synthèse de biocomposites de sulfate de cuivre pour les composites CNP (étape 2.6) et les stocker à long terme à 4 ° C.

4. Caractérisation et la manipulation des Biocomposites post-synthèse

  1. Caractériser biocomposites dérivés de CNPs et de sulfate de cuivre par microscopie à lumière blanche 9 et par microscopie électronique 9.
    1. Pour la caractérisation et l'inspection des biocomposites post-synthèse par microscopie de lumière blanche, utiliser un microscope inversé comme composites se déposent à la surface inférieure de la fiole à quelques minutes de la pose du flacon plat, et peuvent ensuite être mis en évidence. Utilisez le réglage de champ clair sur le microscope pour optimiser le contraste entre les biocomposites et le milieu liquide. Composites dérivés de PNC et flicpar sulfate seront tous deux être clair à opaque en couleur, mais agrégats CNP pas réagi apparaît une couleur très sombre.
      1. Utilisation d'un appareil photo numérique connecté au microscope pour capturer des images des composites. Une gamme de longueurs pour les structures individuelles sera observée.
    2. Pour la caractérisation et l'inspection des biocomposites post-synthèse et après stockage à 4 ° C, permettent flacons à venir à la température ambiante pendant au moins 15 min en flacons formeront condensation initialement lors de l'enlèvement du réfrigérateur, qui obscurcir efficace en se concentrant tout en effectuant l'imagerie microscopique. Après avoir laissé l'équilibre à la température ambiante, essuyer les surfaces supérieure et inférieure de la fiole avec une serviette en papier propre pour maximiser la qualité de l'imagerie microscopique.
    3. Lorsque vous travaillez avec ou imagerie composites qui ont été stockées à long terme, vortex le flacon pendant 30 secondes à se dissocier des touffes de composites qui forment alors dans le réfrigérateur. Après vortex, inspecter les structures avec un micro inverséroscope pour assurer que les agrégats ont dissocié, et répéter vortex si nécessaire.
    4. Utilisez microscopie inversée de lumière blanche pour évaluer l'efficacité de la synthèse d'une expérience donnée en utilisant CNPs. Par exemple, le document de la présence ou de l'absence de CNPs qui n'a pas réagi dans des flacons de synthèse utilisés pour biocomposites CNP-dérivés de flacons avec différents paramètres tels que le temps de synthèse.
      Remarque: individuel CNPs sont trop petits pour observer avec un microscope optique, mais qui n'a pas réagi CNP regroupe apparaîtra comme forme arrondie et objets sombres, contrairement aux CNP-composites synthétisés avec succès ce qui aura un rapport de haute aspect, forme linéaire, et aura une gamme de longueurs différentes. Éviter d'effectuer la synthèse pendant trop longtemps d'une période de temps avant la fin, car cela va entraîner très ramifiées structures de type «oursins», qui sont difficiles à disperser dans des structures individuelles une fois formés.
    5. Utilisez la microscopie de lumière blanche inversée pour évaluer l'efficacitéde la synthèse pour une expérience donnée en utilisant du sulfate de cuivre. Depuis le sulfate de cuivre va pleinement dans la solution en utilisant ce protocole, la solution apparaît moins sombre que la solution de synthèse en utilisant CNPs. Document, la taille et l'étendue des composites de sulfate de cuivre en comparant les flacons avec différentes conditions de synthèse tel que le temps de synthèse avant la fin.
      Remarque: composites synthétisé avec succès montreront une gamme de longueurs différentes. Éviter d'effectuer la synthèse pendant trop longtemps d'une période de temps avant la fin, comme cela se traduira par des agrégats hautement branchés de composites, dont certaines seront "oursin-like" dans la structure, et qui sont difficiles à disperser dans des structures individuelles une fois formés .
  2. Pour concentrer biocomposites post-synthèse, solutions centrifugeuses de composites dans un tube de centrifugeuse. Ajouter 6 ml de chacune des structures CNP-structures dérivées ou dérivées de sulfate de cuivre dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Centrifuger pendant 10 minà 500 x g à la température ambiante pour former une pastille. Pour les plus petits volumes, ajouter 500 pi de structures dans une solution à 0,6 ml tubes de taille. Centrifuger à 2000 xg à température ambiante pendant au moins 10 min pour former une pastille.
    1. Après centrifugation pendant une durée suffisante (au moins 10 min pour microfuges), à l'exception du culot observable au fond du tube, où les structures sont concentrés en éliminant soigneusement le liquide surnageant au-dessus de la pastille. structures biocomposites issus de sulfate de cuivre apparaissent en bleu dans la couleur et des structures dérivées de CNPs sont plus sombres (gris au noir).
    2. Ajouter plus de composites à ce tube et répéter le processus dans le même tube de se concentrer structures si désiré. Pour disperser les pastilles concentrées, ajouter le volume désiré de solution dans le tube, et pour 10 à 30 vortex sec.
  3. Structures Soniquer fois formés, pour déplacer la taille moyenne de la population (de longueurs) des structures à des valeurs inférieures. La place des structures dans l'eau déminéralisée stérile et soniquer au least 10 min. Grâce à ce procédé, au fil du temps, les structures deviennent fragmentées et de plus petite longueur moyenne (voir Figure 6 du texte). Les modifications des documents dans les tailles composites avec différents temps de sonication en utilisant un microscope à lumière blanche inversé et appareil photo numérique.

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Résultats

La figure 1 montre un organigramme schématique des étapes de synthèse pour former les biocomposites linéaires décrits dans cet ouvrage. CNPs ou sulfate de cuivre comme matières de départ sont combinés avec de l'eau stérile pour former une / ml, solution 2 mg, cette solution est mélangé et traité par ultrasons pour fournir un mélange homogène, et cette solution de cuivre est ensuite mélangé dans le rapport suivant de synthèse: 949 parties stérile l'eau: 50 parties de mélange de cuivre: solution c...

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Discussion

Alors que l'évaluation des effets toxiques potentiels des nanomatériaux dont CNPS, il a été observé que sur le long terme, PNC ont été transformés à partir d'une distribution de particules initialement plus dispersée à une forme agrégée plus grande (Figure 2). Dans certains cas, ces formations très agrégés qui ont été produites dans le plat de culture cellulaire, dans des conditions biologiques, formés projections très linéaires de l'agrégat central, rappelant cuivre décrit précédemment cont...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Alfred Gunasekaran pour l’aide technique qu’ils ont apportée dans le cadre d’études de microscopie électronique à l’Institut de microfabrication de l’Université Louisiana Tech, ainsi que le Dr Jim McNamara pour son aide dans le cadre d’études de microscopie supplémentaires. Le travail décrit a été soutenu en partie par le conseil des régents de Louisiane PKSFI Contract No. LEQSF (2007-12)-ENH-PKSFI-PRS-04 et la chaire James E. Wyche III de l’Université Louisiana Tech (à M.D.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mini VortexerVWR (https://us.vwr.com)58816-121
CO2 Incubateur Modèle # 2425-2VWR (https://us.vwr.com)Contacterle fournisseurModèle actuel calalog # 98000-360
Centrifugeuse Eppendorf (Microcentrifugeuse réfrigérée)Labnet (http://labnetinternational.com/)C2500-RModèle Prism R
Centrifugeuse de culture cellulaire Modèle Z323KLabnet (http://labnetinternational.com/)Contacterle vendeurModèle actuel Z206A catalogue # C0206-A
Sonicator (Nettoyeur à ultrasons)Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)1510R-MTH
BalanceSartorius (http://dataweigh.com)Modèle CP225D modèle similaire CPA225D
Olympus IX51 Microscope à lumière inverséeOlympus ( http://olympusamerica.comContacter le vendeur
Olympus DP71 microscope appareil photo numériqueOlympus (http://olympusamerica.comContacter le fournisseur
d’alimentation externe - lumière blanche pour microscopeOlympus Olympus (http://olympusamerica.comTH4-100
10X, 20X et 40XOlympus (http://olympusamerica.comContacter le fournisseur
Microscope électronique à balayageHitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)modèle S-4800
Microscope électronique à transmissionZeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)modèle Libra 120
de travail de table Banc de nettoyage à flux unidirectionnelEnvirco (http://envirco-hvac.com)modèle PNG62675Utilisé pour la culture cellulaire stérile technique
bloc objectifs de microscope Station

Références

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Mots-clés

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