Method Article

L'application d'un système d'expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

DOI:

10.3791/52903

⸱

June 25th, 2015

 ,  ,  , 
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode décrite ici est utilisée pour induire la cascade de signalisation apoptotique à des étapes définies afin de disséquer l’activité d’une protéine effectrice bactérienne anti-apoptotique. Cette méthode peut également être utilisée pour l’expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer l’interférence avec d’autres voies de signalisation.

Abstract

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La technique présentée ici permet d'analyser une étape au cours de laquelle une protéine cible, ou en variante, une petite molécule, interagit avec les composants d'une voie de signalisation. La méthode est basée, d'une part, sur l'expression inductible d'une protéine spécifique pour initier un événement de signalisation à un pas prédéterminé et défini dans la cascade de signalisation sélectionné. Expression concomitante, d'autre part, du gène d'intérêt permet alors l'investigateur d'évaluer si l'activité de la protéine cible exprimée est situé en amont ou en aval de l'événement de signalisation initiée, en fonction de l'affichage de la voie de signalisation qui est obtenue. Ici, la cascade apoptotique a été choisi comme une voie de signalisation définis pour démontrer la fonctionnalité de protocole. Les bactéries pathogènes, telles que Coxiella burnetii, translocation des protéines effectrices qui interfèrent avec l'induction de la mort de la cellule hôte dans la cellule hôte afin d'assurer la survie des bactéries dans la cellule et pour promouvoir leurla diffusion dans l'organisme. Les C. protéines effectrices burnetii CAEB inhibe efficacement la mort de la cellule hôte après l'induction de l'apoptose avec la lumière UV ou à la staurosporine. Pour affiner à quelle étape CAEB interfère avec la propagation du signal apoptotique, protéines sélectionnées ayant une activité pro-apoptotique bien caractérisé ont été exprimés de manière transitoire dans une manière de doxycycline inductible. Si CAEB agit en amont de ces protéines, l'apoptose se dérouler librement. Si CAEB agit en aval, la mort cellulaire sera inhibée. Les protéines d'essai ont été sélectionnés Bax, qui agit au niveau de la mitochondrie, et de la caspase 3, ce qui est la principale protease exécuteur. CAEB interfère avec la mort cellulaire induite par l'expression de Bax, mais pas par la caspase 3 expression. CAEB, par conséquent, coopère avec la cascade apoptotique entre ces deux protéines.

Introduction

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La virulence de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatif dépend de systèmes de sécrétion spécialisés de détourner des cellules hôtes eucaryotes. Les bactéries utilisent ces systèmes de sécrétion d'injecter des protéines de virulence bactérienne (effecteurs) dans la cellule hôte afin de moduler une variété d'activités cellulaires et biochimiques. L'étude des protéines effectrices a non seulement fourni un remarquable aperçu sur les aspects fondamentaux de interactions hôte / pathogène mais aussi dans la biologie fondamentale des cellules eucaryotes 1. La modulation de l'apoptose de la cellule hôte a été démontré être un mécanisme de virulence important pour de nombreux agents pathogènes intracellulaires, et un certain nombre de protéines effectrices de modulation de l'apoptose ont été identifiés 9.2. Cependant, les mécanismes moléculaires précis d'activité demeurent insaisissables dans de nombreux cas.

Apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, joue un rôle important dans les réponses immunitaires à l'infection 10. Deux principales voies conduisant à l'apoptose ontété identifiés: le ciblage des mitochondries (apoptose intrinsèque) ou la transduction directe du signal par les récepteurs de mort cellulaire à la membrane plasmique (apoptose extrinsèque). La voie de la mort cellulaire intrinsèque ou à médiation par les mitochondries est déclenché par des signaux intracellulaires et implique l'activation de Bax et Bak, deux membres pro-apoptotiques de la famille Bcl-2. Cette famille est composée de protéines régulatrices pro- et anti-apoptotiques qui contrôlent la mort des cellules 11-14. L'activation de l'apoptose conduit à une oligomérisation de Bax et Bak suivi ultérieur par perméabilisation de la membrane externe des mitochondries, ce qui entraîne la libération du cytochrome C dans le cytoplasme. Libération de cytochrome c initie l'activation des caspases effectrices 3 et 7 par activation de la caspase 9 dans le apoptosome 15. Cela conduit à la protéolyse de substrats sélectionnés qui, entre autres, des résultats de l'exposition de la phosphatidylsérine sur la surface de la cellule 16 et libère une DNase dédié qui fragmente chromatin 17,18.

Afin de déterminer l'emplacement dans la cascade apoptotique une protéine effectrice individuel gêne, un système d'expression inductible a été utilisé 19. Les systèmes de régulation pour l'expression conditionnelle de transgènes ont été un outil précieux dans l'analyse de la fonction d'une protéine dans la cellule ou de son importance pour les tissus, organes et le développement de l'organisme, ainsi que lors de l'initiation, la progression et l'entretien de la maladie 20-23. Typiquement, les systèmes de contrôle inductibles, tels que le système Tet 24 employée ici, forment une unité de transcription artificielle (voir Figure 1). Un composant est un facteur de transcription appelé tTA conçue artificiellement (transcription activateur tétracycline-dépendant), formé par fusion de répresseur de la transcription bactérienne 25 TetR à un domaine de protéine de mammifère qui médie l'activation transcriptionnelle ou taire 24,26. Le deuxième composant est un hybridepromoteur, appelé TRE (élément de tetracycline sensible), consistant en un promoteur minimal eucaryote, contenant au moins une boîte TATA et un site d'initiation de transcription, reliée à plusieurs répétitions de la site de liaison à l'ADN apparenté pour TetR, tetO 24,25. Le troisième composant est le ligand naturel de TetR, la tétracycline ou un de ses dérivés, tels que la doxycycline ou 25 anhydrotétracycline. Lors de l'addition de ligand dans le milieu de culture, TetR perd son affinité pour tetO et se dissocie du TRE. De ce fait, la transcription du gène cible est supprimée. L'expression du transgène peut, ainsi, être étroitement contrôlé d'une manière temps et dose-dépendante à la fois dans la culture cellulaire et chez les animaux 20,23,24. Avec tTA, l'expression du transgène se produit de manière constitutive, sauf en présence d'une tetracycline. Cela peut être un inconvénient dans l'étude des protéines cytotoxiques ou oncogènes parce tétracycline doit d'abord être retiré du système, avant transgène expression se produit et les effets de la protéine cible sur la cellule peut être surveillé. Cela peut prendre beaucoup de temps et ne sont pas toujours complète, en particulier dans 27 des animaux transgéniques. Pour remédier à cette limitation, un mutant avec TetR une réponse inverse de la présence de doxycycline a été utilisé pour générer un nouveau facteur de transcription, rtTA (tTA inverse) 28. Il se lie uniquement au TRE et, de façon concomitante, active la transcription en présence de doxycycline. Perméabilité résiduelle du système, à savoir., L'expression du transgène en l'absence de TRE lié facteur de transcription, provenant soit (i) d'effets de position à un site d'intégration génomique, (ii) à partir du TRE lui-même 29, ou (iii) de non spécifique de la liaison de tTA / rtTA 28, a été adressée par l'introduction d'un silencieux de transcription supplémentaire, appelée TTS (dépendant de la tétracycline silencieux transcription) 30 dans le système. Il forme un réseau de régulateur double avec rtTA (voir Figure 1).En l'absence de doxycycline, TTS se lie à TRE et arrête toute transcription reste activement. En présence de doxycycline, TTS dissocie de TRE et rtTA lie induire simultanément l'expression du gène cible. Cette couche supplémentaire de rigueur est souvent nécessaire pour exprimer des protéines cytotoxiques très actifs 31-34.

Grâce à ce système à double régulateur étroitement contrôlé, la cascade apoptotique peut être initié à une étape définie permettant l'analyse de savoir si la protéine effecteur donné peut interférer avec induction d'apoptose. Cette méthode ne peut pas être utilisé pour étudier l'activité anti-apoptotique des protéines effectrices bactériennes mais également pour l'expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer les interférences avec d'autres voies de signalisation.

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Protocol

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1. Génération de lignées cellulaires stables exprimant la protéine d'intérêt

  1. Préparer les médias par l'ajout de FCS inactivé à la chaleur et 1% de pénicilline / streptomycine à disponibles dans le commerce Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec du GlutaMAX-I, le pyruvate, et 4,5 g / L de D-glucose.
  2. Cultiver des cellules HEK293 dans un milieu à 37 ° C dans 5% de CO2. Sous-cultiver les cellules tous les trois jours. Retirez les médias et remettre les cellules dans 15 ml de médias fraîches. Pipette de 1 ml dans un nouveau 75 cm 2 de culture cellulaire ballon et ajouter 14 ml médias.
  3. Analyser le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre.
  4. Seed cellules HEK293 dans une plaque à 6 puits à une densité de 2 x 10 5 cellules par puits et incuber pendant 24 heures.
  5. Pour la transfection en utilisant le protocole fourni par le fabricant du réactif de transfection. Transfecter des cellules avec pEGFP-C2 ou pEGFP-C2-CAEB en utilisant le réactif de transfection. Avant d'utiliser, réchauffer le GCI de transfectionent et les médias nécessaires à la RT. Utiliser un ratio de 3: 1 de réactif de transfection à l'ADN.
    1. Dans le détail, une pipette 1,5 ul de réactif de transfection directement dans 50 ul de milieu DMEM exempt de sérum. Pour la formation du complexe, une pipette 0,5 pg d'ADN codant pour la GFP ou GFP-CAEB au mélange réactif contenant transfection et incuber pendant 15 min à température ambiante.
    2. Transfecter des cellules en ajoutant le mélange réactionnel d'une manière goutte à goutte et laisser incuber à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 24 heures.
  6. Ajouter 1 mg / ml de généticine pour la sélection de clones GFP-positives à 37 ° C dans 5% de CO2.
  7. Après 6 jours, isoler des cellules uniques par cytométrie de flux de tri dans une plaque de 96 puits hébergeant moyen et HEK293 surnageant dans un rapport de 1: 1. Générer à partir de cellules HEK293 surnageant de culture confluente HEK293 qui ont été centrifugées pendant 15 min à 4966 x g.
  8. Le jour suivant, remplacer le milieu de culture avec du milieu contenant 1,50; mg / ml de généticine. Changer les médias une fois par semaine. Si les cellules forment une monocouche confluente, les transférer sur une plaque de 24 puits. Sous-cultiver les cellules deux fois par semaine dans un rapport de 1: 5 dans un milieu contenant 1,5 mg / ml de généticine. Enfin, l'analyse du pourcentage de cellules positives pour la GFP par analyse par immunotransfert et cytométrie de flux.

2. Analyse des lignées cellulaires stables par analyse immunoblot

  1. Retirer le surnageant et laver les cellules adhérentes une fois avec du PBS chaud. Reprendre les cellules dans 100 ul de 2x Laemmli tampon d'échantillon, de la chaleur pendant 5 min à 95 ° C et à -20 ° C.
  2. Charge d'environ 4 x 10 4 cellules par échantillon sur un gel SDS-PAGE à 12%. En outre, la charge 6 ul d'une échelle de protéines commercial en tant que marqueur de poids moléculaire. Exécuter gels dans un système d'électrophorèse sur gel dans une tension constante de 180 V pendant 45 à 60 min avec du tampon Laemmli 1x fonctionnement.
  3. Blot protéines sur des membranes de PVDF (taille des pores de 0.45 pm) à une tension constante de 16 V pendant 60 min en utilisant un Trans-Blot SD cellule de transfert semi-sec.
  4. membranes de blocs dans 10 ml de lait en poudre écrémé 5% dans PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) pour 1 heure à température ambiante.
  5. Diluer 4 ul d'anticorps anti-GFP dans 4 ml de MPT et incuber les membranes O / N à 4 ° C.
  6. Effectuer trois 10 min étapes de lavage avec 10 ml de PBS / Tween 20 0,05%.
  7. Incuber les membranes avec 0,8 ul d'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort-dans 4 ml de MPT.
  8. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 2.6) et détecter l'activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement standard pour le développement du film à visualiser les bandes de protéines.

3. Analyser les cellules en utilisant un cytomètre de flux.

  1. Remettre en suspension les cellules dans du PBS. Utiliser des cellules HEK293 comme contrôle négatif pour ajuster avant scAtter (FSC) et de la diffusion latérale (SSC), de sorte que les cellules sont à l'échelle. Tracer une grille sur des cellules vivantes en excluant les doublets de cellules, les agrégats et les débris cellulaires.
  2. Ajustez le tube photomultiplicateur (PMT) gain de sorte que les cellules non colorées sont à l'extrême gauche de l'histogramme pour le canal FL1 (488 nm laser argon).
  3. Pour analyser l'intensité de fluorescence des cellules HEK293-GFP et HEK293-GFP-CAEB ouvrir l'histogramme du canal FL1 et acquérir 10.000 événements de la population fermée.
  4. Analyser les données en utilisant FACS commerciales logiciel d'analyse.

4. La transfection de la lignée cellulaire stable avec le système de vecteur d'expression inductible

  1. cellules HEK293 de semences exprimant de manière stable la GFP ou la GFP-CAEB dans une plaque à 12 puits à une densité de 1 x 10 5 cellules / puits.
  2. 19 heures après l'ensemencement, co-transfecter les cellules avec régulateur plasmide et la réponse plasmide codant soit Bax ou caspase 3.
    1. Co-transfecter les cellules HEK293 stablesavec 100 ng de pWHE125 plasmide régulateur-P (figure 2) et 100 ng de plasmides d'intervention pWHE655-hBax ou pWHE655-revCasp3 (figure 3) et 0,4 ul de polyéthylène-imine.
    2. Préparer l'ADN et polyéthylènimine réactif de transfection chacun dans 75 pi de milieu Opti-MEM et incuber pendant exactement 5 minutes à température ambiante. Pour la formation du complexe, les deux mélanges incuber ensemble pendant 15 min à température ambiante.
  3. Ajouter la solution goutte à goutte aux cellules polyéthylèneimine / ADN et incuber à 37 ° C dans 5% de CO2.

5. induction de l'apoptose

  1. 5 heures après la transfection, induire l'expression des protéines pro-apoptotiques par addition de 1 ug / ml de doxycycline dans le milieu de culture. Incuber les cellules pendant 18 heures à 37 ° C dans 5% de CO2.

6. Analyse de la cellule hôte apoptose par analyse immunoblot

  1. Inspectez cellules avant harvesting sous le microscope optique pour vérifier la mort des cellules induction. Les cellules apoptotiques sont détectables par la présence de corps apoptotiques qui entourent la cellule meurt.
  2. Retirer le surnageant et laver les cellules adhérentes une fois avec du PBS chaud. Reprendre les cellules dans 100 ul de 2x Laemmli tampon d'échantillon, de la chaleur pendant 5 min à 95 ° C et à -20 ° C.
  3. Charge d'environ 4 x 10 4 cellules par échantillon sur un gel SDS-PAGE à 12%. En outre, la charge 6 ul d'une échelle de protéines commercial en tant que marqueur de poids moléculaire. Exécuter gels dans un système d'électrophorèse sur gel dans une tension constante de 180 V pendant 45 à 60 min avec du tampon Laemmli 1x fonctionnement.
  4. Blot protéines sur des membranes de PVDF (taille de pores de 0,45 um) à une tension constante de 16 V pendant 60 min en utilisant une cellule de transfert semi-sec Trans-Blot SD.
  5. membranes de blocs dans 10 ml de lait en poudre écrémé 5% dans PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) pour 1 heure à température ambiante.
  6. Diluer 4 μl d'anticorps anti-poly clivé ADP-ribose polymerase (PARP) dans 4 ml de MPT et incuber O / N à 4 ° C.
  7. Effectuer trois 10 min étapes de lavage avec 10 ml de PBS / Tween 20 0,05%.
  8. Incuber membranes avec 0,8 Anticorps secondaires ul de la peroxydase de raifort conjugué dilué dans 4 ml MPT.
  9. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7) et détecter l'activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement standard pour le développement du film à visualiser les bandes de protéines.
  10. Éliminer les anticorps liés par incubation de 30 min à température ambiante avec 7 ml Western Blot Décapage tampon.
  11. Après trois lavages avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7), la sonde les membranes avec 4 ul d'anticorps anti-actine dans 4 ml de MPT O / N à 4 ° C.
  12. Après trois étapes de lavage avec MPT (comme décrit dans 6.7), incuber les membranes avec 0,8 ul d'hodes anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de rseradish dilués dans 4 ml de MPT.
  13. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7 et détecter l'activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement de série pour le développement de films à visualiser les bandes de protéine.
    Remarque: Toutes les étapes d'incubation ont été réalisées sur un agitateur de plaque pendant le temps indiqué et la température.

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Results

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Premièrement, des lignées de cellules HEK293 exprimant de manière stable la protéine d'intérêt (CAEB) en tant que protéine de fusion GFP ont été établies. A titre de témoin, les lignées cellulaires HEK293 exprimant de manière stable GFP ont également été générées. L'expression de la GFP et GFP-CAEB a été vérifiée par analyse par immunotransfert. Le représentant immunoblot (figure 4A) démontre l'expression stable et clairement détectable de la GFP et GFP-CAEB. Cependant, ce test ne peut déterminer si tou...

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Discussion

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De nombreuses bactéries pathogènes hébergent des systèmes de sécrétion ou de sécréter des protéines effectrices translocation bactérienne dans la cellule hôte. Ces protéines effectrices ont la capacité de moduler les processus et les voies dans la cellule hôte, ce qui permet aux bactéries de survivre et de se répliquer à l'intérieur de leur niche intracellulaire respectif. Comprendre les activités biochimiques et les mécanismes moléculaires des protéines effectrices aidera à une meilleure compréhension de la pathogé...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) par le biais de l’Initiative de Recherche Collaborative 796 (SFB796) à A.L. et C.B., et par le biais de l’appel ERA-NET PathoGenoMics 3rd à A.L.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMlife technologies31966-021
FCSBiochromS0115
Pen/Streplife technologies15140-122
OptiMEMlife technologies51985
X-tremeGENE 9Roche6365752001
GeneticinRothCP11.3
PolyéthyléniminePolysciènes23966
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-8000EDU
Trans-Blot SD Cellule de transfert semi-sècheBio-Rad170-3940
PageRuler Échelle de protéines précoloréesThermo Scientific26616
MembranePVDFMilliporeIPVH00010
anti-GFP  ;life technologiesA6455
anti-clivé PARPBD Bioscience611038
anti-actineSigma AldrichA2066
IgG de souris (H+L)-HRPODianova111-035-062
IgG de lapin (H+L)-HRPODianova111-035-045
Substrat de transfert WesternECL Thermo Scientific32106
Tampon de décapage Restore Plus Western BlotThermo Scientific46428

References

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