L'application d'un système d'expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

La virulence de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatif dépend de systèmes de sécrétion spécialisés de détourner des cellules hôtes eucaryotes. Les bactéries utilisent ces systèmes de sécrétion d'injecter des protéines de virulence bactérienne (effecteurs) dans la cellule hôte afin de moduler une variété d'activités cellulaires et biochimiques. L'étude des protéines effectrices a non seulement fourni un remarquable aperçu sur les aspects fondamentaux de interactions hôte / pathogène mais aussi dans la biologie fondamentale des cellules eucaryotes ^1. La modulation de l'apoptose de la cellule hôte a été démontré être un mécanisme de virulence important pour de nombreux agents pathogènes intracellulaires, et un certain nombre de protéines effectrices de modulation de l'apoptose ont été identifiés ^9.2. Cependant, les mécanismes moléculaires précis d'activité demeurent insaisissables dans de nombreux cas.

Apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, joue un rôle important dans les réponses immunitaires à l'infection ^10. Deux principales voies conduisant à l'apoptose ontété identifiés: le ciblage des mitochondries (apoptose intrinsèque) ou la transduction directe du signal par les récepteurs de mort cellulaire à la membrane plasmique (apoptose extrinsèque). La voie de la mort cellulaire intrinsèque ou à médiation par les mitochondries est déclenché par des signaux intracellulaires et implique l'activation de Bax et Bak, deux membres pro-apoptotiques de la famille Bcl-2. Cette famille est composée de protéines régulatrices pro- et anti-apoptotiques qui contrôlent la mort des cellules ^11-14. L'activation de l'apoptose conduit à une oligomérisation de Bax et Bak suivi ultérieur par perméabilisation de la membrane externe des mitochondries, ce qui entraîne la libération du cytochrome C dans le cytoplasme. Libération de cytochrome c initie l'activation des caspases effectrices 3 et 7 par activation de la caspase 9 dans le apoptosome ^15. Cela conduit à la protéolyse de substrats sélectionnés qui, entre autres, des résultats de l'exposition de la phosphatidylsérine sur la surface de la cellule ¹⁶ et libère une DNase dédié qui fragmente chromatin ^17,18.

Afin de déterminer l'emplacement dans la cascade apoptotique une protéine effectrice individuel gêne, un système d'expression inductible a été utilisé ^19. Les systèmes de régulation pour l'expression conditionnelle de transgènes ont été un outil précieux dans l'analyse de la fonction d'une protéine dans la cellule ou de son importance pour les tissus, organes et le développement de l'organisme, ainsi que lors de l'initiation, la progression et l'entretien de la maladie ^20-23. Typiquement, les systèmes de contrôle inductibles, tels que le système Tet ²⁴ employée ici, forment une unité de transcription artificielle (voir Figure 1). Un composant est un facteur de transcription appelé tTA conçue artificiellement (transcription activateur tétracycline-dépendant), formé par fusion de répresseur de la transcription bactérienne ²⁵ TetR à un domaine de protéine de mammifère qui médie l'activation transcriptionnelle ou taire ^24,26. Le deuxième composant est un hybridepromoteur, appelé TRE (élément de tetracycline sensible), consistant en un promoteur minimal eucaryote, contenant au moins une boîte TATA et un site d'initiation de transcription, reliée à plusieurs répétitions de la site de liaison à l'ADN apparenté pour TetR, tetO ^24,25. Le troisième composant est le ligand naturel de TetR, la tétracycline ou un de ses dérivés, tels que la doxycycline ou ²⁵ anhydrotétracycline. Lors de l'addition de ligand dans le milieu de culture, TetR perd son affinité pour tetO et se dissocie du TRE. De ce fait, la transcription du gène cible est supprimée. L'expression du transgène peut, ainsi, être étroitement contrôlé d'une manière temps et dose-dépendante à la fois dans la culture cellulaire et chez les animaux ^20,23,24. Avec tTA, l'expression du transgène se produit de manière constitutive, sauf en présence d'une tetracycline. Cela peut être un inconvénient dans l'étude des protéines cytotoxiques ou oncogènes parce tétracycline doit d'abord être retiré du système, avant transgène expression se produit et les effets de la protéine cible sur la cellule peut être surveillé. Cela peut prendre beaucoup de temps et ne sont pas toujours complète, en particulier dans ²⁷ des animaux transgéniques. Pour remédier à cette limitation, un mutant avec TetR une réponse inverse de la présence de doxycycline a été utilisé pour générer un nouveau facteur de transcription, rtTA (tTA inverse) ^28. Il se lie uniquement au TRE et, de façon concomitante, active la transcription en présence de doxycycline. Perméabilité résiduelle du système, à savoir., L'expression du transgène en l'absence de TRE lié facteur de transcription, provenant soit (i) d'effets de position à un site d'intégration génomique, (ii) à partir du TRE lui-même ^29, ou (iii) de non spécifique de la liaison de tTA / rtTA ^28, a été adressée par l'introduction d'un silencieux de transcription supplémentaire, appelée TTS (dépendant de la tétracycline silencieux transcription) ³⁰ dans le système. Il forme un réseau de régulateur double avec rtTA (voir Figure 1).En l'absence de doxycycline, TTS se lie à TRE et arrête toute transcription reste activement. En présence de doxycycline, TTS dissocie de TRE et rtTA lie induire simultanément l'expression du gène cible. Cette couche supplémentaire de rigueur est souvent nécessaire pour exprimer des protéines cytotoxiques très actifs ^31-34.

Grâce à ce système à double régulateur étroitement contrôlé, la cascade apoptotique peut être initié à une étape définie permettant l'analyse de savoir si la protéine effecteur donné peut interférer avec induction d'apoptose. Cette méthode ne peut pas être utilisé pour étudier l'activité anti-apoptotique des protéines effectrices bactériennes mais également pour l'expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer les interférences avec d'autres voies de signalisation.

1. Génération de lignées cellulaires stables exprimant la protéine d'intérêt

1. Préparer les médias par l'ajout de FCS inactivé à la chaleur et 1% de pénicilline / streptomycine à disponibles dans le commerce Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec du GlutaMAX-I, le pyruvate, et 4,5 g / L de D-glucose.
2. Cultiver des cellules HEK293 dans un milieu à 37 ° C dans 5% de _CO2. Sous-cultiver les cellules tous les trois jours. Retirez les médias et remettre les cellules dans 15 ml de médias fraîches. Pipette de 1 ml dans un nouveau 75 cm ² de culture cellulaire ballon et ajouter 14 ml médias.
3. Analyser le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre.
4. Seed cellules HEK293 dans une plaque à 6 puits à une densité de 2 x 10 ⁵ cellules par puits et incuber pendant 24 heures.
5. Pour la transfection en utilisant le protocole fourni par le fabricant du réactif de transfection. Transfecter des cellules avec pEGFP-C2 ou pEGFP-C2-CAEB en utilisant le réactif de transfection. Avant d'utiliser, réchauffer le GCI de transfectionent et les médias nécessaires à la RT. Utiliser un ratio de 3: 1 de réactif de transfection à l'ADN.
   1. Dans le détail, une pipette 1,5 ul de réactif de transfection directement dans 50 ul de milieu DMEM exempt de sérum. Pour la formation du complexe, une pipette 0,5 pg d'ADN codant pour la GFP ou GFP-CAEB au mélange réactif contenant transfection et incuber pendant 15 min à température ambiante.
   2. Transfecter des cellules en ajoutant le mélange réactionnel d'une manière goutte à goutte et laisser incuber à 37 ° C dans 5% de _CO2 pendant 24 heures.
6. Ajouter 1 mg / ml de généticine pour la sélection de clones GFP-positives à 37 ° C dans 5% de _CO2.
7. Après 6 jours, isoler des cellules uniques par cytométrie de flux de tri dans une plaque de 96 puits hébergeant moyen et HEK293 surnageant dans un rapport de 1: 1. Générer à partir de cellules HEK293 surnageant de culture confluente HEK293 qui ont été centrifugées pendant 15 min à 4966 x g.
8. Le jour suivant, remplacer le milieu de culture avec du milieu contenant 1,50; mg / ml de généticine. Changer les médias une fois par semaine. Si les cellules forment une monocouche confluente, les transférer sur une plaque de 24 puits. Sous-cultiver les cellules deux fois par semaine dans un rapport de 1: 5 dans un milieu contenant 1,5 mg / ml de généticine. Enfin, l'analyse du pourcentage de cellules positives pour la GFP par analyse par immunotransfert et cytométrie de flux.

2. Analyse des lignées cellulaires stables par analyse immunoblot

1. Retirer le surnageant et laver les cellules adhérentes une fois avec du PBS chaud. Reprendre les cellules dans 100 ul de 2x Laemmli tampon d'échantillon, de la chaleur pendant 5 min à 95 ° C et à -20 ° C.
2. Charge d'environ 4 x 10 ⁴ cellules par échantillon sur un gel SDS-PAGE à 12%. En outre, la charge 6 ul d'une échelle de protéines commercial en tant que marqueur de poids moléculaire. Exécuter gels dans un système d'électrophorèse sur gel dans une tension constante de 180 V pendant 45 à 60 min avec du tampon Laemmli 1x fonctionnement.
3. Blot protéines sur des membranes de PVDF (taille des pores de 0.45 pm) à une tension constante de 16 V pendant 60 min en utilisant un Trans-Blot SD cellule de transfert semi-sec.
4. membranes de blocs dans 10 ml de lait en poudre écrémé 5% dans PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) pour 1 heure à température ambiante.
5. Diluer 4 ul d'anticorps anti-GFP dans 4 ml de MPT et incuber les membranes O / N à 4 ° C.
6. Effectuer trois 10 min étapes de lavage avec 10 ml de PBS / Tween 20 0,05%.
7. Incuber les membranes avec 0,8 ul d'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort-dans 4 ml de MPT.
8. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 2.6) et détecter l'activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement standard pour le développement du film à visualiser les bandes de protéines.

3. Analyser les cellules en utilisant un cytomètre de flux.

1. Remettre en suspension les cellules dans du PBS. Utiliser des cellules HEK293 comme contrôle négatif pour ajuster avant scAtter (FSC) et de la diffusion latérale (SSC), de sorte que les cellules sont à l'échelle. Tracer une grille sur des cellules vivantes en excluant les doublets de cellules, les agrégats et les débris cellulaires.
2. Ajustez le tube photomultiplicateur (PMT) gain de sorte que les cellules non colorées sont à l'extrême gauche de l'histogramme pour le canal FL1 (488 nm laser argon).
3. Pour analyser l'intensité de fluorescence des cellules HEK293-GFP et HEK293-GFP-CAEB ouvrir l'histogramme du canal FL1 et acquérir 10.000 événements de la population fermée.
4. Analyser les données en utilisant FACS commerciales logiciel d'analyse.

4. La transfection de la lignée cellulaire stable avec le système de vecteur d'expression inductible

1. cellules HEK293 de semences exprimant de manière stable la GFP ou la GFP-CAEB dans une plaque à 12 puits à une densité de 1 x 10 ⁵ cellules / puits.
2. 19 heures après l'ensemencement, co-transfecter les cellules avec régulateur plasmide et la réponse plasmide codant soit Bax ou caspase 3.
   1. Co-transfecter les cellules HEK293 stablesavec 100 ng de pWHE125 plasmide régulateur-P (figure 2) et 100 ng de plasmides d'intervention pWHE655-hBax ou pWHE655-revCasp3 (figure 3) et 0,4 ul de polyéthylène-imine.
   2. Préparer l'ADN et polyéthylènimine réactif de transfection chacun dans 75 pi de milieu Opti-MEM et incuber pendant exactement 5 minutes à température ambiante. Pour la formation du complexe, les deux mélanges incuber ensemble pendant 15 min à température ambiante.
3. Ajouter la solution goutte à goutte aux cellules polyéthylèneimine / ADN et incuber à 37 ° C dans 5% de _CO2.

5. induction de l'apoptose

1. 5 heures après la transfection, induire l'expression des protéines pro-apoptotiques par addition de 1 ug / ml de doxycycline dans le milieu de culture. Incuber les cellules pendant 18 heures à 37 ° C dans 5% de _CO2.

6. Analyse de la cellule hôte apoptose par analyse immunoblot

1. Inspectez cellules avant harvesting sous le microscope optique pour vérifier la mort des cellules induction. Les cellules apoptotiques sont détectables par la présence de corps apoptotiques qui entourent la cellule meurt.
2. Retirer le surnageant et laver les cellules adhérentes une fois avec du PBS chaud. Reprendre les cellules dans 100 ul de 2x Laemmli tampon d'échantillon, de la chaleur pendant 5 min à 95 ° C et à -20 ° C.
3. Charge d'environ 4 x 10 ⁴ cellules par échantillon sur un gel SDS-PAGE à 12%. En outre, la charge 6 ul d'une échelle de protéines commercial en tant que marqueur de poids moléculaire. Exécuter gels dans un système d'électrophorèse sur gel dans une tension constante de 180 V pendant 45 à 60 min avec du tampon Laemmli 1x fonctionnement.
4. Blot protéines sur des membranes de PVDF (taille de pores de 0,45 um) à une tension constante de 16 V pendant 60 min en utilisant une cellule de transfert semi-sec Trans-Blot SD.
5. membranes de blocs dans 10 ml de lait en poudre écrémé 5% dans PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) pour 1 heure à température ambiante.
6. Diluer 4 μl d'anticorps anti-poly clivé ADP-ribose polymerase (PARP) dans 4 ml de MPT et incuber O / N à 4 ° C.
7. Effectuer trois 10 min étapes de lavage avec 10 ml de PBS / Tween 20 0,05%.
8. Incuber membranes avec 0,8 Anticorps secondaires ul de la peroxydase de raifort conjugué dilué dans 4 ml MPT.
9. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7) et détecter l'activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement standard pour le développement du film à visualiser les bandes de protéines.
10. Éliminer les anticorps liés par incubation de 30 min à température ambiante avec 7 ml Western Blot Décapage tampon.
11. Après trois lavages avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7), la sonde les membranes avec 4 ul d'anticorps anti-actine dans 4 ml de MPT O / N à 4 ° C.
12. Après trois étapes de lavage avec MPT (comme décrit dans 6.7), incuber les membranes avec 0,8 ul d'hodes anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de rseradish dilués dans 4 ml de MPT.
13. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7 et détecter l'activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement de série pour le développement de films à visualiser les bandes de protéine.
    Remarque: Toutes les étapes d'incubation ont été réalisées sur un agitateur de plaque pendant le temps indiqué et la température.

Premièrement, des lignées de cellules HEK293 exprimant de manière stable la protéine d'intérêt (CAEB) en tant que protéine de fusion GFP ont été établies. A titre de témoin, les lignées cellulaires HEK293 exprimant de manière stable GFP ont également été générées. L'expression de la GFP et GFP-CAEB a été vérifiée par analyse par immunotransfert. Le représentant immunoblot (figure 4A) démontre l'expression stable et clairement détectable de la GFP et GFP-CAEB. Cependant, ce test ne peut déterminer si toutes les cellules expriment la GFP ou la GFP-CAEB. Par conséquent, les lignées de cellules HEK293 transfectées de manière stable ont également été analysées par cytométrie de flux. Comme le montre la Figure 4B, plus de 90% des cellules dans les deux lignées cellulaires exprime la GFP. Ainsi, ces lignées cellulaires stables peuvent être utilisés pour analyser la fonction en outre de la DGVEE. Dans l'étape suivante, l'activité anti-apoptotique de la DGVEE a été analysée par une analyse par immunotransfert en utilisant un anticorps contre PARP clivée. Le clivage protéolytique de la PARP nucléaire inactive l'activité de réparation d'ADN et est un marqueur typique de la termistades finale de l'apoptose. Le clivage de la PARP est pas détectée dans les cellules HEK293-GFP ou des cellules HEK293-GFP-CAEB, ce qui démontre que ni l'expression de la GFP, ou de GFP-CAEB est toxique pour les cellules. Toutefois, lorsque les cellules ont été traitées à la staurosporine, un puissant inducteur de l'apoptose intrinsèque, le clivage de la PARP a été détectée (figure 5). Fait important, les cellules HEK293-GFP-CAEB présentent une clivage de la PARP réduites, ce qui indique l'activité anti-apoptotique de la Coxiella burnetii de type IV protéine effectrice du système de sécrétion CAEB 7.

Pour analyser à quelle étape CAEB interfère avec la voie de l'apoptose, le système Tet-On a été employé. Dans le détail, les cellules HEK293-GFP ou HEK293-GFP-CAEB ont été transfectées avec un plasmide régulateur exprimant de manière constitutive une double répresseur / configuration de doxycycline contrôlée activateur (figure 2) et un codage pTRE réponse plasmidique soit pleine longueur Bax humaine ou la forme activée de caspase 3 humain, appelé revCasp 3 (Figure 3). Ce système est étroitement régulée, comme en témoigne l'absence de clivage de la PARP dans des conditions non-induisant conditions (figure 6). L'addition de doxycycline dans les cellules transfectées a donné lieu à l'expression de Bax ou revCasp 3. Si CAEB interfère avec la voie apoptotique en aval de Bax, alors le signal généré par apoptose et l'activation subséquente expression de Bax doit être bloqué par expression CAEB. En effet, les cellules HEK293 exprimant de façon stable GFP-CAEB inhiber profondément induction de l'apoptose par doxycycline contrôlée Bax expression, tandis que les cellules HEK293-GFP affichés évident clivage PARP. Ce résultat indique que les blocs CAEB induction de l'apoptose en aval de l'activation de Bax. Ensuite, il a été examiné si CAEB peut interférer avec activation caspase 3 - un événement à la fin de la voie apoptotique. Les cellules HEK293-GFP, ainsi que des cellules HEK293-GFP-CAEB, exposition clivage PARP (figure 6), ce qui indique que, une fois la caspase effectrice 3 est activATED, CAEB ne peut pas empêcher l'apoptose de se produire. Prises ensemble, ces données démontrent que CAEB agit entre Bax et de la caspase 3 activation.

Figure 1. Aperçu schématique du système de réglementation des tétracyclines. Le système Tet-On est composé de deux plasmides différents, les plasmides de réglementation et d'intervention. Le plasmide codant pour la réglementation transsilencer Tet-réactive (TTS; cercle rempli) et le transactivateur inverse Tet-réactive (rtTA, cercle ouvert). Les deux protéines sont exprimées de manière constitutive sous le contrôle du fort allongement constitutive facteur-1 alpha promoteur (P EF-1a). TTS et rtTA sont des facteurs de transcription chimériques comprenant un domaine de régulation de transcription eucaryote (silencieux ou activateur, respectivement) et un répresseur bactérien tétracycline (TetR). TetR médiation de liaison à l'ADN de sept tet </em> opérateur (tetO) des séquences de ce plasmide de réponse. TetO est situé en amont du promoteur inductible minimal de cytomegalovirus (CMV P), formant ensemble l'élément sensible à Tet (TRE). Dans des conditions non-induisant, TTS est lié à TRE empêchant l'expression. Après addition de doxycycline (Dox; losange plein), rtTA interagit avec Dox conduisant à des changements conformationnels et activation. Activé rtTA remplace TTS sur le plasmide de réponse, permettant la transcription des gènes cibles respectifs Bax et de la caspase 3, conduisant ainsi à induction de l'apoptose et la mort cellulaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Présentation schématique du plasmide pWHE125 réglementaire. Éléments essentiels pour la propagation dans bactères, y compris une origine de replication (ori pBR) et une cassette de résistance aux antibiotiques contre l'ampicilline (AmpR), et pour l'expression des Tet-transregulators, tels que la forte, constitutive précoce immédiat du promoteur / amplificateur du cytomegalovirus humain (P / E hCMV), un site interne de liaison des ribosomes de la polio-virus (PV-IRES) et un site polyA du virus simien 40 (SV40 polyA) sont affichées. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Vue d'ensemble schématique du plasmide de réponse. Les éléments essentiels pour la propagation dans des bactéries, y compris une origine de replication (ori pBR) et une cassette de résistance à un antibiotique (Amp R), et pour l'expression inductible dans des eucaryotes, tels que le transgène Expressisur la cassette avec le promoteur Tet-dépendant TREtight minimal (P TREtight), le gène d'intérêt Bax humaine (hBax) et un site de polyA du virus simien 40 (SV40 polyA), sont représentées. La cassette d'expression du transgène est flanqué par des répétitions directes en tandem de deux copies de la séquence centrale HS4 de l'isolateur de poulet (noyau HS4). En outre, une cassette de résistance à G418 constitué d'un promoteur murin phosphoglycérate kinase 1 (P MPGK), un gène de résistance à la néomycine (G418 R) et un site polyA de la thymidine kinase humaine (TK polyA) est présent. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4. HEK293-GFP et HEK293-GFP-CAEB exprimer de manière stable les protéines fluorescentes vertes. (A) lysats de cellules entières de HEK293-GFP etCellules HEK293-GFP-CAEB ont été immunotransférés pour la GFP de montrer une expression stable. (B) cytométrie de flux Représentant (FACS) de HEK293-GFP et les cellules HEK293-GFP-CAEB est représenté à démontrer l'intensité de l'expression de la GFP. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Les effets de l'expression de GFP-CAEB sur l'apoptose induite par la staurosporine. HEK293-GFP et les cellules HEK293-GFP-CAEB ont été traités avec 4 uM de staurosporine pendant 6 heures pour induire l'apoptose intrinsèque. L'apoptose a été analysée par analyse PARP clivée par immunotransfert. Clivage PARP a été réduite dans les cellules HEK293-GFP-CAEB en comparaison aux cellules HEK293-GFP. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandede ce chiffre.

Figure 6. Utilisation du système de Teton d'affiner le point d'action de la DGVEE. (A) L'apoptose a été induite par l'expression de Bax dans HEK293-GFP et les cellules HEK293-GFP-CAEB. L'apoptose a été analysée par analyse PARP clivée par immunotransfert. Clivage PARP a été réduite dans les cellules HEK293-GFP-CAEB en comparaison à des cellules HEK293-GFP. (B) L'apoptose a été induite par l'expression de revCasp 3 HEK293-GFP et les cellules HEK293-GFP-CAEB. L'apoptose a été analysée par analyse PARP clivée par immunotransfert. Clivage PARP était comparable dans les cellules HEK293-GFP-CAEB et HEK293-GFP. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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