Article de méthode

Un rendement élevé et Expression System coût-efficace de granzymes humain dans des cellules de mammifères

DOI :

10.3791/52911

⸱

10 juin 2015

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1Cellular and Molecular Medicine Program, Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Medicine, University of Fribourg, 3Centre Médical Universitaire, University of Geneva

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici un système d’expression de granzyme rentable utilisant des cellules HEK293T qui produit des rendements élevés de protéase pure, entièrement glycosylée et enzymatiquement active.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lorsque les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) ou les cellules tueuses naturelles (NK) reconnaissent des cellules tumorales ou des cellules infectées par des pathogènes intracellulaires, ils libèrent leur contenu en granules cytotoxiques pour éliminer les cellules cibles et l’agent pathogène intracellulaire. La mort des cellules hôtes et des agents pathogènes intracellulaires est déclenchée par les protéases à sérine granulaires, granzymes (Gzms), délivrées dans le cytosol de la cellule hôte par la protéine perforine formant les pores (PFN) et dans les agents pathogènes bactériens par la granulysine procéphine perturbatrice de la membrane procaryote (GNLY). Pour étudier les mécanismes moléculaires de la mort cellulaire cible médiée par les Gzms dans des contextes expérimentaux in vitro, des systèmes d’expression et de purification des protéines qui produisent de grandes quantités d’enzymes actives sont nécessaires. Les systèmes d’expression des protéines sécrétées par les mammifères impliquent le potentiel de produire des protéines correctement repliées et entièrement fonctionnelles qui supportent des modifications post-traductionnelles, telles que la glycosylation. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode de précipitation calcique rentable pour la transfection transitoire de cellules HEK293T avec des Gzms humains clonés dans le plasmide d’expression pHLsec. La purification de Gzm à partir du surnageant de culture a été réalisée par chromatographie d’affinité de nickel immobilisée à l’aide de l’étiquette de polyhistidine C-terminale fournie par le vecteur. L’insertion d’un site d’entérokinase à l’extrémité N-terminale de la protéine a permis la génération d’une protéase active qui a finalement été purifiée par chromatographie d’échange cationique. Le système a été testé en produisant des niveaux élevés de Gzm A, B et M humains cytotoxiques et devrait être capable de produire pratiquement toutes les enzymes du corps humain à des rendements élevés.

Introduction

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Les Gzms sont une famille de serine proteases homologues fortement localisées dans les lysosomes spécialisées des CTL et les cellules NK 1. Les granules cytotoxiques de ces cellules tueuses contiennent également des protéines de la membrane perturbateurs PFN et GNLY qui sont libérés simultanément avec les Gzms lors de la reconnaissance d'une cellule cible destiné à l'élimination 2,3. Il existe cinq Gzms chez l'homme (GZMA, B, H, K et M), et 10 chez des souris (Gzms GZMA - G, K, M et N). GZMA et GZMB sont les plus abondants et largement étudiés chez l'homme et la souris 1. Cependant, des études plus récentes ont commencé à enquêter sur les voies de mort cellulaire ainsi que les effets biologiques supplémentaires induits par les autres, soi-disant Gzms orphelins de la santé et de la maladie 4.

La fonction la plus connue des Gzms, en particulier de GZMA et GZMB, est l'induction de la mort cellulaire programmée dans des cellules de mammifère lorsqu'elle est remise dans les cellules cibles par PFN 5,6. Pourtant, Des études plus récentes ont également démontré des effets extracellulaires des Gzms avec un impact profond sur la réglementation et l'inflammation immunitaire, indépendamment de livraison cytosolique par PFN 7,8. Le spectre de cellules qui sont tuées efficacement cytosolique après l'entrée des Gzms a également été récemment élargie à partir de cellules de mammifères à des bactéries et même 9,10 11 certains parasites. Ces découvertes récentes ont ouvert un nouveau champ pour les chercheurs GZM. Par conséquent, un, à haut rendement système d'expression mammalien rentable solution va considérablement faciliter la voie à ces études futures.

Gzms natives humaines, de souris et de rat ont été purifiés avec succès à partir de la fraction de granulés de CTL et NK lignées cellulaires 14/12. Cependant, dans les mains, le rendement de ces techniques de purification est dans la gamme de culture inférieure à 0,1 mg / L de cellules (observation non publiée et 12). En outre, la résolution chromatographique d'un seul GZM sans contamination par other Gzms et / ou des protéines qui sont également présentes dans les granules contestent (données non publiées et 12,14). Gzms recombinants ont été produites dans des bactéries, des levures 15 16, des cellules d'insectes 17 et même dans des cellules de mammifères telles que HEK 293 18,19. Seuls les systèmes d'expression de mammifères portent le potentiel de produire des enzymes recombinantes avec des modifications post-traductionnelles identiques à la protéine native cytotoxique. Modifications post-traductionnelles ont été impliqués avec l'absorption spécifique par endocytose et la localisation intracellulaire de la protease dans les cellules cibles de 20 à 22. Par conséquent, en utilisant pHLsec 23 (un cadeau genre de Radu Aricescu et Yvonne Jones, Université d'Oxford, Royaume-Uni) comme l'épine dorsale de plasmide pour l'expression GZM, nous avons établi un système simple, rapide et économique efficace pour la production de protéines à haut rendement dans des cellules HEK293T. pHLsec combine un activateur de CMV avec un promoteur de poulet Β-actine; Ensemble, ces éléments démonstrationsted la plus forte activité de promoteur dans diverses lignées cellulaires 24. En outre, le plasmide contient un Β-globine de lapin intron, des signaux de sécrétion et de Kozak optimisée, une 6xHis-tag-Lys et un signal poly-A. Les inserts peuvent être clonées idéalement entre le signal de sécrétion et la-6xHis-tag Lys (Figure 1) assurer une expression optimale et l'efficacité de la sécrétion de protéines dépourvues appropriées domaines N-terminaux. Pour l'expression des Gzms, nous avons remplacé la séquence signal de sécrétion endogène avec le signal de sécrétion fournie par le vecteur suivie par une entérokinase (EK) place (DDDDK) afin que le traitement EK activé le Gzms sécrétées (Gzms actifs commencer par la N-terminal séquence d'acides aminés IIGG 25). De plus en faveur de cette méthode, les cellules HEK293T se développent rapidement en basse à prix moyen, comme milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), et sont bien adaptés pour la méthode de transfection au phosphate de calcium rentable.

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Protocole

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1. Production du plasmide d'expression pHLsec-GZM

  1. Préparation de l'ARN total à partir de cellules NK humaines (cellules primaires préparées comme dans 26 ou la lignée de cellules NK NK-92 exprimant les cinq Gzms humaines) en utilisant un procédé d'isolement d'ARN appropriée et transcription inverse en utilisant un premier brin kit ADNc de synthétiser la suite de la manufacturer` s recommandations. Amplifier GZM ADNc par PCR et clone dans pHLsec comme décrit dans 23 (don genre de Radu Aricescu et Yvonne Jones, Université d'Oxford, Royaume-Uni) en utilisant les sites Agel et Kpnl (Figure 1).
    REMARQUE: Utilisez les amorces suivantes indiquées dans le tableau 1.
  2. Confirmez inserts correctes par séquençage. Développez les plasmides d'expression dans des cellules DH5a et purifier en utilisant un kit d'isolement de plasmide libre endotoxine et suivez les instructions du fabricant.
  3. Reprendre les plasmides purifiés dans de l'eau stérile sans endotoxine à une concentration de 2 mg / ml et conserver à -20 ° C until utilisation.

2. Expression de Gzms dans des cellules HEK293T

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparer le milieu de culture standard. Pour milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant taux élevé de glucose (25 mM), Glutamax (4 mM), du pyruvate de sodium (1 mM) ajouter 10% de sérum standard de veau foetal (FCS), la pénicilline (100 unités / ml), la streptomycine ( 100 ug / ml).
    2. Préparer milieu de transfection. Pour milieu de culture sans pénicilline-streptomycine ajouter 25 pg / ml chloroquine (ajouter fraîchement sur le jour de la transfection de 1,000x stocks dans PBS, stockés à -20 ° C).
    3. Préparer un milieu de culture exempt de sérum: A un milieu sans sérum pour cellules HEK293 ajouter de la glutamine (4 mM), de la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 ug / ml), et 2,5 mg / L de l'amphotéricine B.
    4. Préparer les solutions décrites dans le tableau 2 et le filtre avec un filtre de 0,45 um avant utilisation:
  2. Expansion des cellules HEK293T
    1. Cultiver les cellules HEK293T dans 20 ml culteSupport d'ure utilisant 150 x 25 mm boîtes de culture de tissu.
    2. Cellules Split à 80% de confluence (split-ratio de 1: 4, généralement tous les 3 ème jour). Cellules attachent vaguement, ils peuvent être détachés mécaniquement sans traitement à la trypsine par pipetage rigoureusement haut et en bas.
    3. cellules de la plaque avant la transfection nuit pour donner 60 à 70% de confluence au jour de la transfection (densité d'ensemencement ~ 2 x 10 5 cellules / ml). Une taille de la préparation habituelle consiste de 20 à 25 boîtes de culture.
  3. La transfection au phosphate de calcium
    1. 1 h avant la transfection, remplacer le milieu de culture standard à 20 ml de milieu de transfection. Près de la fin de cette étape d'incubation de 1 heure, mélanger 400 ug d'ADN plasmidique avec 10,95 ml ddH 2 0 et 1,55 ml de 2M CaCl2 en tubes de 50 ml (1 tube / 5 plats).
    2. 1 à 2 min avant la transfection, ajouter 12,5 ml 2x HBS à 12,5 ml de la solution ADN-Calcium, mélanger par inversion des tubes et incuber pendant 30 secondes à la température ambiante.
    3. Ajouter èmee mélange préparé en 2.3.2 directement aux cellules (5 ml par boîte), goutte à goutte dans le milieu. Saupoudrer uniformément sur toute la surface, en tournant le support à une couleur légèrement orangée.
    4. Incuber les boîtes de culture de 7 à 11 h dans un incubateur de culture de tissu (37 ° C, 5% de CO2 dans de l'air humidifié). Après l'incubation, une amende précipité est visible. Retirez le milieu de transfection, rincer soigneusement préchauffé PBS et ajouter 20 ml de milieu de culture sans sérum préparé à 2.1.3. Incuber pendant 72 heures dans un incubateur de culture de tissu.
    5. Analyser l'efficacité de transfection et l'expression par l'exécution d'un échantillon (~ 20 ul) du surnageant de cellule sur SDS-PAGE et coloration avec du bleu brillant de Coomassie pour visualiser une bande de granzyme.
  4. Purification de Gzms de surnageant de culture par Nickel-IMAC
    1. Après l'incubation, décanter le surnageant de culture de cellules dans 250 ml tubes et claire par centrifugation. Effectuer une première rotation (400 xg, 10 min, 4 °C) qui va effacer le milieu à partir des cellules individuelles. Transférer le surnageant dans fraîches 250 ml tubes et tournent à 4000 g, 30 min à 4 ° C pour éliminer les débris de cellules restant.
    2. Ajouter 5 ml de NaCl 5 M, 6,25 ml de 2 M de Tris-Base (pH 8) et 1 ml de 0,25 M NiSO 4 par 250 ml de surnageant clarifié. Filtrer le surnageant à l'aide d'une unité de filtration sous vide de 500 ml (0,45 mm).
    3. Equilibrer une colonne nickel-IMAC avec Sa liaison tampon A (10 volumes de colonne, CV) en utilisant un système FPLC approprié.
    4. Appliquer le surnageant clarifié à la colonne équilibrée à un débit de 0,5 ml / min à 4 ° C.
    5. Après le surnageant a été appliqué, colonne de lavage avec Sa liaison tampon jusqu'à ce que l'absorbance UV de référence est atteint (généralement 10 CV).
    6. Gzms éluées avec un gradient de 20 ml-linéaire (0 à 250 mM imidazole) à un débit de 0,5 ml / min tout en recueillant des fractions de 2 ml. Analyser les fractions d'élution par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie.
  5. Enterokinase (EK)le traitement et le nettoyage final par Chromatographie d'échange de cations
    1. Piscine GZM fractions contenant dans un tube de dialyse MWCO avec ≤10. Stocker un petit échantillon à -20 ° C que le contrôle pré-EK.
    2. Ajouter EK à 0,02 unité / ml de 50 surnageant initial directement à la fraction groupée dans le tube de dialyse et dialyse O / N (au moins 16 heures) à la température ambiante dans EK-tampon (4 L, le changement tampon une fois).
    3. Le lendemain, analyser EK Gzms traitée par rapport à la pré-EK contrôle par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie.
    4. Lorsque le traitement N-terminal est terminée, modifier un tampon de dialyse à tampon A S (4 L) et on dialyse pendant 4 heures à température ambiante. Filtre dialysat (0,45 um).
    5. Équilibrer une colonne S-S avec du tampon de l'échantillon A. charger sur la colonne avec à un débit de 0,5 ml / min à 4 ° C.
    6. Après chargement de l'échantillon, laver la colonne avec le tampon de S A jusqu'à ce que la ligne de base UV absorbance est atteint (environ 10 CV). Éluer les Gzms avec un gradient linéaire de 30 ml (150 à 1 000 mM de NaCl). GZMA eluths à ~ 650 mM de NaCl, GZMB à ~ 700 mM de NaCl et GzmM à ~ 750 mM de NaCl.
    7. Analyser élution fractions par SDS-PAGE et essais colorimétriques (voir ci-dessous). Piscine fractions contenant Gzms et concentré (environ 30 fois, à une concentration d'environ 100 pM) dans les filtres de rotation (15 ml, 10 MWCO). Aliquoter les préparatifs GZM concentrés et conserver à -80 ° C.

3. Test de l'activité GZM

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparer le tampon de dosage colorimétrique: 50 mM de Tris-Base, pH 7.
      1. Pour la mesure de GZMA, ajouter Na-CBZ-L-Lysine thiobenzyle ester (S-Bzl) (BLT) pour le tampon d'essai à une concentration finale de 0,2 mM et 5,5'-dithio-bis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB) à une concentration de 0,22 mM. Pour GZMB, inclure 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) et 0,22 mM DTNB. Pour GzmM, y compris 0,2 mM de Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (pNA) (AAPL). Les peptides synthétiques sont ajoutés à partir de solutions d'achat d'actions appropriées (dans le DMSO, stored à -20 ° C) dans la mémoire tampon fraîchement avant l'essai.
    2. Préparer le tampon de dosage de clivage: 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-Base, pH 7,5
  2. Dosages colorimétriques
    1. Distribuez de petits échantillons GZM (<5 pi) de fractions d'élution ou des stocks concentrés dans les plaques à 96 puits à fond plat. Inclure un contrôle positif (GZM préparations testées ou brut lysats de cellules NK) et un contrôle négatif (tampon seulement).
    2. Ajouter 100 ul de tampon de dosage à chaque puits (à l'aide d'une pipette multi-canaux). Incuber pendant 10 min à 37 ° C. Mesurer la DO à 405 nm dans un lecteur de microplaques.
  3. Dosage Décolleté
    1. Pour les essais de clivage à l'aide de substrats purifiés, co-incuber un substrat protéique (native ou recombinante, de 100 à 400 nM; quelques exemples de substrats de GZM efficaces sont présentés dans la section de résultat et à la note à la fin de cette section) avec des dilutions en série d'un GZM (à partir de 400 nM) dans du tampon analytique pour différents moments.Analyse par SDS-PAGE et coloration à l'argent ou au bleu de Coomassie; ou par Western blot en utilisant des anticorps spécifiques.
    2. Pour les essais de clivage à l'aide de lysats de cellules, de suspendre 10 6 cellules HeLa (ou toute lignée cellulaire de tumeur disponible) dans 1 ml de tampon de dosage et lyse par congélation dans un / bain de glace sèche de l'éthanol et décongélation à 37 ° C trois fois. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation (15 000 xg pendant 10 min à 4 ° C).
    3. Co-incuber le lysat clarifié avec Gzms à diverses concentrations et heures ci-dessus. Le clivage est détecté par immunotransfert en utilisant des anticorps appropriés.
      NOTE: Quelques exemples de substrats de bonne foi pour laquelle les anticorps commerciaux sont disponibles: Offre (BH3-interaction agoniste domaine de mort) et de la caspase 3 clivée par GZMB 27,28; plusieurs ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNPA1, A2 et U) clivées par GZMA 29; cytomégalovirus phosphoprotéine 71 par GzmM 30.

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Résultats

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Dans la section suivante, nous allons présenter une documentation complète d'une préparation GZMA pour éclairer la méthode. Nous avons également purifié succès GZMB et GzmM, produisant des résultats similaires en ce qui concerne l'efficacité et l'activité purification. Cependant, à partir de ces préparations plus tard nous ne montrer quelques morceaux choisis de données. Préparations GZMB à partir de cellules 293T en suivant le protocole actuel ont été utilisés dans plusieurs études publiées, mettant en évidence leur ac...

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Discussion

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Le rôle classique et d'études approfondies et de GZMA GZMB est l'induction de l'apoptose dans des cellules de mammifères après leur livraison cytosolique de la protéine formant des pores PFN 1. Récemment, le spectre des Gzms cytotoxique a été élargi de façon significative à partir de cellules de mammifères à 9,10 bactéries, ainsi qu'à 11 certains parasites. En outre, les fonctions, extracellulaires non-classiques de GZMA et GZMB ainsi que la signification biologique des d...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Novartis pour la recherche médico-biologique et du Pool de recherche de l’Université de Fribourg (à MW). Nous remercions Li Zhao, Zhan Xu et Solange Kharoubi Hess pour leur soutien technique, ainsi que Radu Aricescu et Yvonne Jones (Université d’Oxford, Royaume-Uni) pour avoir fourni le plasmide pHLsec, et Thomas Schürpf (Harvard Medical School) pour les discussions utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
TRIzolReagent Invitrogen15596-026Kit d’isolement de l’ARN total
SuperScript II Transcriptase inverseInvitrogen18064-014
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530L
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
EX-CELL 293 Milieu sans sérum pour cellules HEK 293Sigma14571C
DMEM, hyperglycémie, supplément GlutaMAX, pyruvateGibco31966-021
Tube de dialyse SnakeSkin, 10K MWCOThermo Scientific68100
Entérokinase de l’intestin bovinSigmaE4906recombinant, &ge ; 20  ; unités/mg de protéines
HisTrap Excel 5 ml colonneGE Healthcare17-3712-06  ;Nickel IMAC
HiTrap SP HP 5 ml colonneGE Healthcare17-1152-01  ;Colonne S
N-&alpha ;-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)SigmaC3647Substrat GzmA
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)MP Biomedicals2193608 _10mgSubstrat GzmB
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)Substrat BachemGzmM
5,5&prime ;-dithio-bis(2-nitrobenzoïque) (DTNB)SigmaD8130Réactif d’Ellman

Références

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Granzyme ExpressionMammalian Cell TransfectionCalcium Phosphate MethodImmobilized Metal Affinity ChromatographyCation Exchange ChromatographyEnterokinase ActivationHEK293T CellsProtein PurificationEnzymatic Activity AssayGlycosylated Protease

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