Article de méthode

Visualisation immunohistochimique de l'hippocampe Neuron Activité Après l'apprentissage spatial dans un modèle de souris de troubles neurodéveloppementaux

DOI :

10.3791/52919

⸱

12 mai 2015

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons un protocole d'immunohistochimie pour étudier le profil d'activation des neurones de l'hippocampe après exposition à une tâche spatiale d'apprentissage dans un modèle de souris caractérisé par des déficits cognitifs d'origine neurologique du développement. Ce protocole peut être appliqué sur les deux modèles génétiques souris ou pharmacologiques, caractérisée par des déficits cognitifs.

Résumé

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Induction de la kinase extracellulaire régulée phosphorylée (pERK) est une lecture moléculaire fiable de l'activation neuronale apprentissage dépendant. Ici, nous décrivons un protocole d'immunohistochimie pERK d'étudier le profil de l'activation des neurones de l'hippocampe après exposition à une tâche spatiale d'apprentissage dans un modèle de souris caractérisé par des déficits cognitifs d'origine neurologique du développement. Plus précisément, nous avons utilisé un marquage pERK pour étudier l'activation neuronale suivante labyrinthe aquatique de Morris (MWM, une tâche d'apprentissage de l'hippocampe-dépendante classique) dans Engrailed-2 KO (En2 - / -) chez la souris, un modèle de troubles du spectre autistique (TSA). Par rapport à de type sauvage (WT) contrôles, En2 - / - souris ont montré d'importants déficits d'apprentissage spatial dans le MWM. Après MWM, des différences significatives dans le nombre de neurones pERK-positives ont été détectées dans les sous-champs spécifiques de l'hippocampe En2 - / - souris, par comparaison aux animaux WT. Ainsi, notre protocole robuste peut détecter des différences danspERK neurones positifs associés à une altération de l'apprentissage de l'hippocampe-dépendante dans un modèle murin de la TSA. Plus généralement, notre protocole peut être appliqué à étudier le profil de l'activation des neurones de l'hippocampe dans les deux modèles génétiques souris ou pharmacologiques, caractérisé par des déficits cognitifs.

Introduction

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Ces troubles neurologiques incluent un groupe de troubles tels que le syndrome de Down, le syndrome de l'X fragile (FXS), le syndrome de Rett, la neurofibromatose, la sclérose tubéreuse et ASD, dans lequel le développement et la maturation du système nerveux central (SNC) est perturbé tôt au cours de large et hétérogène la période prénatale 1. Ces dysfonctionnements cérébraux développement peuvent causer profonds effets à long terme sur la fonction motrice, la langue, l'apprentissage et le processus de la mémoire. Une pléthore de facteurs génétiques et environnementaux ont été impliqués dans la pathogenèse de troubles neurologiques du développement au cours des dernières années 2,3. Même si les mécanismes moléculaires sous-jacents le phénotype clinique demeurent inconnues, les résultats mentionnés ci-dessus ont permis le développement de plusieurs modèles de souris de ces troubles. les déficits de mémoire et d'apprentissage ont été identifiés dans un certain nombre de ces modèles de souris tels que TSC1 +/-, TSC2 +/-,Nf1 +/- et En2 - / - souris 2,4-7. Un défi important dans le domaine des troubles du développement neurologique est l'identification des processus cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la mémoire et le dysfonctionnement d'apprentissage. Les voies de signalisation activées sélectionnés pendant l'apprentissage ou de la mémoire peuvent induire la transcription de gènes spécifiques et finalement conduire à la synthèse de novo des protéines. Gènes précoces immédiats (IEG) activation et de protéines dépend modifications synaptiques sont induites rapidement dans les neurones du cerveau en réponse à l'activité neuronale et la formation comportementale 8,9.

Les déficits dans les voies de signalisation impliquant neurofibromine ont été associés à des troubles d'apprentissage dans les troubles du développement neurologique. Neurofibromin est le produit du gène NF1, dont la mutation entraîne la neurofibromatose de type 1, un syndrome génétique complexe caractérisé par des tumeurs du système nerveux, des retards et du comportement moteur et cognitif disabilités 10. hétérozygote Souris pour Nf1 suppression restreinte aux neurones inhibiteurs présentent des déficits dans la phase précoce de la potentialisation à long terme (LTP), ainsi que l'apprentissage spatial compromis dans MWM 5,11,12. Fait intéressant, la carence Nf1 dans ce modèle de souris conduit à une activation excessive de signalisation Ras dans les interneurones inhibiteurs au cours de l'apprentissage, entraînant une augmentation de la phosphorylation de ERK et enfin à une amélioration de la libération de GABA anormale de ces neurones 5.

Basé sur ces résultats, la visualisation de l'activité neuronale après tâches comportementales représente un moyen de reconstruire circuits spécifiques impliqués dans les maladies neurologiques du développement. Le protocole d'immunohistochimie décrit ici vise à évaluer et quantifier les niveaux de phosphorylation ERK hippocampe suivantes MWM dans un modèle de souris de TSA à des déficits cognitifs. MWM est largement utilisée pour étudier l'hippocampe apprentissage spatial et la mémoire dépendante chez les rongeurs 13,14 . Nous décidons d'utiliser la phosphorylation de ERK comme lecture moléculaire de l'apprentissage de l'hippocampe tâche dépendante, puisque ERK a été démontré qu'ils ont un rôle essentiel dans l'apprentissage et la formation de la mémoire 15. En outre, la voie ERK est nécessaire pour l'expérience de la plasticité du cortex visuel de développement 16. Enfin, les souris dépourvues de l'une des deux isoformes ERK (ERK2) dans le spectacle CNS marqués anomalies dans les comportements cognitifs, émotionnels et sociaux 17, indiquant que la signalisation ERK pourrait jouer un rôle essentiel dans la pathogenèse de troubles neurodéveloppementaux tels que l'ASD.

Nous avons utilisé Engrailed 2 KO (En2 - / -) chez la souris comme modèle de troubles du développement neurologique. En2 - / - souris montrent des caractéristiques anatomiques et comportementales "ASD-like", y compris la perte des interneurones du cerveau antérieur 18, réduction de l'expression de gènes liés ASD-19, une diminution de la sociabilité et de la flexibilité cognitive altérée 6,7,20. Learni spatialeng et troubles de la mémoire, telles que celles détectées dans MWM, sont particulièrement robuste dans En2 - / - souris 6,7 et pourraient être pertinentes pour les troubles cognitifs observés chez les patients TSA 21. En outre, nous avons montré que l'apprentissage spatial facultés affaiblies dans MWM est associée à l'expression de neurofibromine réduite et l'augmentation des niveaux Perk dans le hile En2 - / - souris adultes 7. Ici, nous présentons le protocole détaillé pour la caractérisation immunohistochimique de pERK suivante MWM dans ce modèle de souris de TSA.

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Protocole

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Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec la directive européenne 2010/63 / UE et ont été approuvés par le ministère italien de la Santé.

1. Animal Care, du logement et de traitement

  1. Effectuer tous les protocoles expérimentaux utilisant des souris en conformité avec les lignes directrices de la protection des animaux respective.
  2. Maintenir les animaux dans un 12 hr cycle lumière / obscurité avec de la nourriture et de l'eau ad libitum.
  3. Maison de la souris en groupes de 2-4, dans des cages polycarbonate souris de taille standard avec la sciure de bois et de matériaux de litière changé chaque semaine.
  4. Utilisez l'âge et du sexe des souris assortie, parce que la susceptibilité à la maladie peut varier avec l'âge et le sexe dans les modèles de troubles du développement neurologique de souris différentes.
  5. Choisissez un nombre approprié d'animaux pour atteindre une signification statistique (un minimum de 10 souris par génotype pour l'étude comportementale et 4 souris par génotype pour l'expérience de l'immunohistochimie).

2. Morris Maze eau (MWM)

  1. Utilisez un réservoir circulaire (diamètre 100 cm, hauteur 50 cm).
    1. Placez quelques repères visuels sur les cloisons autour du réservoir.
    2. Placer une plate-forme de 10 cm de diamètre dans le réservoir à un emplacement fixe dans le centre de l'un des quatre quadrants imaginaires. Gardez la plate-forme cachée dans le même quadrant pour tous les essais dans toutes les sessions de formation.
    3. Remplissez la piscine avec de l'eau du robinet jusqu'à la plate-forme est de 1 cm au-dessus de la surface de l'eau. Equilibrer la température de l'eau devrait être proche de 22 ° C; cette étape peut prendre plusieurs heures. Ajouter de l'eau chaude pour raccourcir le temps nécessaire pour équilibrer la température de l'eau.
    4. Ajouter environ 1,5-2 L de blanc, la peinture non toxique pour rendre l'eau opaque.
  2. Piste procédure d'acquisition
    1. Mettre en place le système de suivi de MWM avec des caméras CCD standard et les cartes vidéo. Choisissez un système de vidéo-tracking pour suivre et analyser plusieurs variables telles que la longueur du trajet, escape latence, et le temps passé dans chaque quadrant.
    2. Diviser l'arène en quatre quadrants et régler les paramètres de détection pour assurer un contraste optimal entre les animaux et pour le suivi en direct de fond.
    3. Spécifiez la région de la plate-forme.
    4. Réglez le temps d'essai maximale de 60 sec.
  3. Test MWM
    1. Avant le test de comportement, permettra souris une période d'adaptation de 20-25 min dans une zone où ils ne peuvent pas voir la piscine ou de repères spatiaux.
    2. Former chaque souris pendant 9 jours (deux essais consécutifs par jour, avec intervalle de 20-30 min entre eux).
    3. Allumez l'ordinateur et l'appareil photo et lancer le logiciel de système de vidéo-tracking.
    4. Prenez la souris par la queue et le placer dans l'eau, avec sa tête dirigée vers le côté de la piscine, à partir de l'une des quatre positions de départ (nord, sud, est, ouest). Pour chaque souris, la position de départ devrait être différent et pseudorandomized entre les essais.
    5. Laissez le bain de la souris et de recherche pour le Platorm pour un maximum de 60 secondes. Une fois que l'animal atteint la plate-forme, de lui permettre de rester sur la plate-forme pendant 20 sec.
    6. Si la souris n'a pas réussi à localiser la plate-forme au sein de ce moment-là, guider doucement la souris pour la plate-forme, en le tenant par la queue et laissez-le d'y rester pendant 20 sec. Une fois que l'animal a terminé toutes les deux essais, le sécher avec une serviette et le remettre en cage.
    7. Chaque jour de la période de formation, répétez la même procédure (étapes 2.3.4-2.3.6).
    8. Effectuer le test de la sonde au jour 9 après le dernier parcours de formation.
    9. Retirer la plate-forme de la piscine.
    10. Laissez le bain de la souris et de recherche pour la plate-forme pour un maximum de 60 secondes.
    11. Périodiquement, vérifiez la température de l'eau de sorte qu'il devrait être la même (22 ° C) et nettoyer la piscine.

3. Préparation des sections de perfusés Animaux

  1. Sacrifiez les souris à la fin de MWM. Quatre souris par génotype doivent être anesthésiés avant euthanization conformément aux directives locales et internationales.
  2. Perfuser l'animal transcardiaque (auriclewith droite intercepte une paire de ciseaux pour permettre un saignement et d'introduire une canule de papillon dans le ventricule gauche à perfuser) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 4-5 min, suivie de 4% de paraformaldehyde dans du PBS pendant 10 à 15 22 min.
  3. Disséquer et post-fixer les cerveaux dans 4% de paraformaldehyde à 4 ° C pendant au moins 12 h.
  4. Placez les cerveaux en tubes de 50 ml polystyrène coniques contenant 15 ml de 0,02% d'azoture de sodium dans 0,1 M de PBS et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de trancher.
  5. Couper et enlever le cervelet avant vibratome coupe.
  6. Collez le cerveau droit avec le site de coupe, en utilisant la superglue, sur la plaque de support de la vibratome.
  7. Couper le cerveau en 20-40 um coupes coronales épais, afin de série tout au long de l'hippocampe dorsal, sur vibratome appropriée.
  8. Recueillir vibratome tranches avec un pinceau et de transférer à un 24 plaque multi-puits contenant 1 ml de PBS 0,1 M à chaque puits.
  9. sections de stockage pour court terme dans PBS ou à long terme dans les 0,02% d'azoture de sodium dans du PBS à 4 ºC (tissus pourraient être utilisés pour un an au maximum).

4. immunohistochimie

  1. 5.3 Transfert des sections hippocampe dorsal pour chaque souris, 24 dans la plaque multi-puits contenant 500 pl de PBS 0,1 M à chaque puits.
  2. Laver les sections contenues dans chaque puits avec 500 pi de PBS 0,1 M (5 min, 3 fois avec agitation douce).
  3. Quench activité de peroxydase endogène, par incubation dans une des sections% de H 2 O 2 dans du PBS pendant 20 min sous agitation douce.
  4. Laver les sections dans 0,1 M de PBS avec une agitation douce (3 x 5 min).
  5. La perméabilisation de tissu: incuber les sections pendant 5 minutes dans 0,2% de Triton X-100 dans du PBS.
  6. Au cours des étapes ci-dessus (4,4; 4,5), faire assez tampon de blocage (sérum de chèvre à 10% et 0,1% de Triton-X100 dans du PBS) pendant toute l'expérience (number des sections x 100 pi x 3 marches).
  7. Remarque: L'utilisation de sérum de la même espèce, dans lequel le Ab secondaire (conjugué à la biotine) a été effectué.
  8. Empêcher la liaison non spécifique de l'anticorps, en faisant incuber les sections dans un tampon de blocage (100 ul / section) pendant 1 heure à la température ambiante (RT) sous agitation douce.
  9. Incuber les coupes dans l'enseignement primaire Ab (pERK) dilué dans du tampon de blocage, une nuit à 4 ° C, avec agitation douce.
  10. Laver les sections dans 0,1 M de PBS avec une agitation douce (3 x 5 min).
  11. Incuber avec l'Ab secondaire conjugué avec de la biotine (1: 250) dilué dans du tampon de blocage (même que celui utilisé à l'étape 4.6) pendant 1 heure à température ambiante avec agitation douce.
  12. Préparer le réactif ABC en même temps, parce que Avidin et la biotine besoin d'au moins 30 min à température ambiante au complexe.
  13. Préparer le volume nécessaire de réactif ABC selon le protocole du fabricant.
  14. Laver les sections dans 0,1 M de PBS avec une agitation douce (3 x 5 min).
  15. Incubatsections e pendant 45 min à température ambiante avec ABC réactif.
  16. Laver les sections dans 0,1 M de PBS avec une agitation douce (3 x 5 min).
  17. Préparer DAB solution de travail, chaque étape impliquant DAB doit être fait dans la hotte que DAB est cancérigène et tératogène.
  18. Transfert solution DAB à une nouvelle plaque à la pipette de transfert en plastique.
  19. sections de place dans la plaque contenant DAB solution et la plaque lentement tourbillon de travail à la main, afin de permettre une exposition maximale aux sections.
  20. Surveiller la réaction DAB sur microscope jusqu'au signal adéquat développe (2-5 min).
  21. Arrêter la réaction à l'intensité de couleur désirée par lavage du tissu dans 0,1 M de PBS (3 x 5 min).
  22. Utilisez l'eau de Javel pour désactiver toute solution de substrat DAB restant dans la hotte pendant la nuit et en disposer selon les directives de laboratoire.
  23. Sections de montage sur la gélatine revêtues diapositives en flottant dans PBS. Ensuite, séchez-les à température ambiante au moins 3-4 heures.
  24. Déshydrater la sections séquentiellement dans 50%, 70%, 95%et de l'éthanol à 100% pendant 2 min chacun, et clair dans 100% de xylène pendant 5 min.
  25. Lamelle en utilisant un milieu de montage et laisser dans la hotte à sécher pendant la nuit.

5. comte cellulaire

  1. Compter les cellules positives pERK trois à cinq sections au niveau de l'hippocampe dorsal doivent être analysées par animal.
  2. Acquérir plusieurs images champ clair de chaque section au grossissement de 200x en utilisant un microscope approprié, puis de les assembler en utilisant un logiciel de traitement d'image.
  3. Effectuer la numération des cellules sur les images en mosaïque tiff converti en utilisant le logiciel gratuit ImageJ.
  4. Compter les cellules pERK colorés dans la couche de cellules hile et le granule sur deux à trois boîtes de comptage de 100 × 100 um chacun.
  5. Les densités cellulaires sont exprimés en nombre de cellules marquées par fenêtre de comptage (100 x 100 um).
  6. Effectuer une analyse statistique pour évaluer différence significative entre les génotypes. Ceci peut être accompli avec t de Studentessai ou analyse de variance suivie par test post hoc appropriée en utilisant des logiciels commerciaux. Réglez le niveau de signification statistique à p <0,05.

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Résultats

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Le protocole décrit ici a été conçu pour visualiser, par immunohistochimie, l'expression d'un marqueur de l'activité des neurones de l'hippocampe après MWM spécifique dans un modèle de souris de troubles du développement neurologique. Toutes les données expérimentales présentées ici ont été prises à partir de notre récent travail 7. Mâle et femelle WT et En2 - / - littermates appariés pour l'âge adulte (3-5 mois; poids = 25-35 g) obtenues à partir de croisements hétérozygotes ont été utilisés. Ving...

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Discussion

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Ici, nous fournissons un protocole d'immunohistochimie pERK pour révéler l'activation neuronale suivante MWM en En2 souris - / -, un modèle de souris de troubles du développement neurologique. Diminution des niveaux de pERK ont été détectées dans le sous-champ CA3 de En2 - / - mutants par rapport à WT. A la différence de ce qui est observé dans le sous-champ CA3, une augmentation générale des neurones pERK-positifs a été détecté dans les deux à la place hile et GCL de En2 souris - / -<...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ont rien à communiquer

Remerciements

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Nous tenons à remercier le personnel administratif de CIBIO (Université de Trento) et CNR Institut des Neurosciences de l'aide. Giovanni Provenzano est soutenu par une bourse post-doctorale de Fondazione Veronesi (Milan, Italie). Ce travail a été financé par le ministère italien de l'Université et de la Recherche (PRIN 2008 subvention # 200894SYW2_002 et PRIN 2010-2011 subvention # 2010N8PBAA_002 à YB), Université de Trente (CIBIO subvention à YB start-up) et la Fondation Téléthon (# subvention de GGP13034 à YB).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
EthoVision XT 8Noldus Information TechnologyCette plate-forme logicielle n’est pas une exigence - il existe de nombreux autres logiciels comportementaux sur le marché.
Peinture à la détrempeGiotto - Fila Group CompanyBlanc et liquide, non toxique. Utilisé pour préparer de l’eau opaque dans le labyrinthe d’eau Morris.
VibratomeLeicaVT1200Des modèles équivalents d’autres sociétés peuvent être utilisés.
Plaque à 24 puitsSigmaCLS3524
100 % éthanolFisher ScientificA406-20Utilisé pour créer un gradient d’éthanol pour la déshydratation avant le montage de la glissière.
XylèneVWR66004-950Toxique - à utiliser sous le capot. Changez le xylène tous les mois en fonction de l’utilisation.
Azoture de sodiumSigma  ; S2002
PBSSigmaP3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100Sigma  ;T-8787
Peroxyde d’hydrogèneSigmaH1009-100ML
Sérum de chèvre normalAbcamG9023-10ML
ABC kit Vectastain  ;Vector LaboratoriesPK-6100Ajouter un volume de 5 ml de PBS 2 gouttes de réactif A, mélanger puis ajouter 2 gouttes de réactif B et mélanger.
Substrat de peroxydase DABLaboratoires VecteursSK-4100Ajouter un volume de 5 ml de ddH2O : 2 gouttes de solution mère tampon et mélanger ; 4 gouttes de DAB et mélanger ; 2 gouttes de H2O2 et mélanger.
[en-tête]
Anticorps pERKCell Signaling Technologies  ;4370dilution 1:500
Chèvre biotinylée Anti-Lapin IgGVecteur Anticorps LaboratoiresBA-1000  ;Dilution 1:250
Glissières SuperFrost  ;Carl Roth1879
LamellesFisher12-548-B
DPXSigma317616Support de montage pour glissières. Un support de montage équivalent peut être utilisé.
Microscope  ; Zeiss  ;Axio Imager.M2peut être utilisé.
Adobe PhotoshopAdobe Systems, San Jose, CAPour assembler des images.
ImageJ SoftwareNational Institute of HealthLe logiciel gratuit peut être téléchargé à l’adresse http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0Systat Software Inc. (États-Unis)Des logiciels équivalents pour l’analyse statistique peuvent être utilisés.
Prism 6GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, États-Unis)Des logiciels équivalents pour l’analyse statistique peuvent être utilisés.
Un microscope équivalent à

Références

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Mots-clés

Immunohistochimie de la pERKlabyrinthe aquatique de Morrisknockout d Engrailed 2troubles du spectre de l autismemicroscopie photoniquesectionnement du cerveau

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