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Article de méthode

Asymétrique Walkway: A Novel Assay pour l'étude du comportement asymétrique Locomotion

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DOI :

10.3791/52921

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15 janvier 2016

 ,  , 
1Neural Engineering Laboratory, Biomedical Research Center, West Virginia University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour quantifier le piétinement précis chez les rongeurs. Les signaux corticaux et du générateur de motif central de la colonne vertébrale sont nécessaires pour un placement précis du pied lors d’une locomotion obstruée. Nous rapportons ici la nouvelle tâche de marche contrainte qui examine directement le comportement précis du pas.

Résumé

Tests comportementaux sont couramment utilisés pour l'évaluation de la déficience sensori-motrice dans le système nerveux central (SNC). Les méthodes les plus sophistiquées pour quantifier les déficits locomoteurs chez les rongeurs est de mesurer les perturbations minute de contrainte démarche Overground (par ex., Le score de BBB manuel ou automatisé Catwalk). Toutefois, les entrées corticales ne sont pas nécessaires pour la génération de locomotion de base produite par le générateur de motif central de la colonne vertébrale (CPG). Ainsi, les tâches de marche sans contrainte tester déficits locomoteurs grâce au moteur cortical dépréciation qu'indirectement. Dans cette étude, nous proposons un nouveau, précise tâche locomotrice pieds placement qui évalue entrées corticales à l'CPG moelle. Un PEG-chemin instrumentée a été utilisé pour imposer des tâches locomotrices symétriques et asymétriques mimant déficits de mouvement latéralisés. Nous démontrons que les changements de longueurs entre foulée équidistantes de 20% produisent des changements dans les caractéristiques de phase des membres antérieurs de position lors de la locomotion avec preflongueur de la foulée commis une erreur. De plus, nous proposons que la passerelle asymétrique permet des mesures de résultats comportementaux produites par des signaux de commande corticales. Ces mesures sont pertinentes pour l'évaluation de la dépréciation après lésions corticales.

Introduction

Post-AVC de morbidité dans la population survivante comprend déficiences motrices qui constituent un défi pour l'évaluation quantitative chez les humains affichent des modèles de course et animales de troubles neurologiques 1. Dans le contexte clinique, ces déficiences motrices sont mesurées en utilisant des critères subjectifs, qui sont plus sensibles à la déficience grave plutôt que modérée présentée par la majorité des patients. De même, ces évaluations subjectives de comportement moteur post-traumatique chez les animaux sont fréquents, par exemple., Basso, Beattie, et Bresnahan (BBB) ​​échelle locomoteur méthode 2,3. Bien que ces méthodes d'évaluation subjectives aident traduction entre les études de réhabilitation de la marche dans les modèles et les humains des animaux quadrupèdes, les détails de déficits moteurs associés à l'activité des groupes de muscles distincts ne sont pas évalués. En outre, l'évaluation du cortex moteur contribution à la locomotion, comme le coupable présumé du déficit moteur dans un accident cérébro-vasculaire,ne peuvent être obtenus de manière indirecte, même en utilisant les plus nouvelles méthodes quantitatives les 4,5 automatisés, car elles reposent sur ​​plein champ ou les tâches de marche linéaires. Ces tâches ne nécessitent pas de contribution corticale et peuvent être effectuées par les mécanismes neuronaux de la moelle épinière, les animaux-à-dire, le générateur de motif central (CPG) réseau qui est épargné dans la plupart des modèles animaux de lésions nerveuses, par exemple, spinalisés 6 -.. 8 . Contribution essentielle corticale à ces mécanismes de la colonne vertébrale a été expérimentalement impliqué dans les tâches qui nécessitent des ajustements posturaux anticipés 9 et atteignant 10, ainsi que l'intensification 10 précise.

En outre, la plupart des dommages neurologiques est asymétrique; par exemple, accident vasculaire cérébral provoque hemiparesis, à savoir, la faiblesse sur un côté du corps, ce qui conduit à une allure asymétrique 11 -. 14. L'asymétrie de la marche hémiplégique est produite par spatiotempor asymétriquel'activation des muscles al manifeste le plus nettement dans le raccourcissement de la phase d'appui associée extenseur et l'allongement de la phase d'oscillation associée fléchisseur du cycle de l'étape sur le côté parétique 15,16. Cette tendance n'a pas encore été exploré à travers une gamme de vitesses de locomotion chez les animaux sains ou parétiques. Dans la présente étude, nous avons utilisé l'analyse des caractéristiques de durée de la phase 17 qui décrit la relation entre la durée de battants ou stance phases en fonction de la durée de cycle à chaque étape. Le modèle de régression linéaire obtenu est ensuite décrite plus en détail par une analyse de l'asymétrie dans toutes les branches.

Nous rapportons une nouvelle méthode à faible coût pour évaluer l'activité de descendre entrées corticales dans le système moteur des animaux quadrupèdes basé sur une tâche précise stepping locomoteur. Cette tâche est conçu pour défier le cortex moteur en imposant des exigences sur le placement des pieds sur une plage naturelle de vitesses de marche. en outre, Les exigences pieds placement sont manipulés pour contester préférentiellement du côté gauche ou droit du système de moteur. Dans une tâche de locomotion semblable, Metz & Whishaw (2009) ont examiné les taux d'échec, le nombre d'étapes manquées sur passerelle échelon irrégulière, chez les rats. Notre méthode est complémentaire à cette étude précédente, et il détaille la qualité du contrôle de phase dans "réussie" 18 étapes.

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Protocole

Le paradigme de la formation suivante emploie l'analyse des ajustements de phase de l'adulte moyen rat Sprague-Dawley. S'il vous plaît assurez-vous que le protocole décrit ici est en conformité avec les directives de votre protection des animaux. Toutes les procédures dans cette étude ont été effectuées en conformité avec le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) et l'Office for Laboratory Animal Welfare (OLAW) à l'École de médecine de l'Université West Virginia et respecte par les Instituts nationaux de directives de santé pour l'utilisation de expérimentale animaux.

1. Équipement Setup

  1. Construire la passerelle asymétrique comme une boîte en plastique open-top contreventement avec supports en aluminium à chaque coin mesurant 155 cm x 104 cm (Figure 1). Préparez les bords supérieurs de la boîte avec des barres d'aluminium rainurés sur les deux côtés pour permettre la mise en place de cheville autre, le long du périmètre de la boîte, de sorte que chaque pion consécutive sur le même côté définit la longueur de la foulée.
  2. Placez un 20 cm x 20 cm plate-forme sur chaque coin (quatre au total) séparant les conditions représentées sur chaque côté. Cette distance doit être suffisante pour la prise en compte de la distance parcourue par un cycle de l'étape de rat unique.
    1. Utiliser des chevilles en aluminium avec des dimensions de 20 cm x 1 cm x 0,5 cm. Pliez le haut de chaque pion de 2,5 cm de la pointe pour produire une plate-forme de placement des pieds.
    2. Fixez les piquets pour les barres rainurées utilisant équerres coulissantes à l'intérieur à travers les trous usinés à la même distance pour assurer le niveau le positionnement horizontal. Ajuster les positions à l'aide d'un tournevis et d'une règle. Utilisez un 1 cm de largeur de cheville qui correspond à peu près à la taille moyenne de la patte de rat; chevilles fines ou plus larges sont soit mal à l'aise ou augmenter la variabilité de placement des pieds.
  3. Manipuler le placement de cheville sur chaque côté pour produire l'une des trois conditions de contestation de progression précis.
    1. Produire une tâche locomotrice symétrique avec une longueur de pas de 15 cm (de SL15) en éditant la gauche inter-stride longueur (l ISL) et bonne longueur inter-stride (r ISL) à la moitié de la longueur de la foulée (7,5 cm).
    2. Imposer une condition symétrique supplémentaire (SL12) en changeant les longueurs l ISL ISL et r à 6,0 cm.
    3. Produire les tâches asymétriques en modifiant la distance entre les chevilles sur les côtés gauche et droit, dite longueur entre la foulée. Pour contester le système moteur asymétrique, changer le L et R ISL ISL de 20% d'imposer de courtes longueurs inter-stride soit sur ​​le (condition L6R9) gauche ou sur la droite (L9R6) secondaires. Les perturbations de 1,5 cm imposent un ISL l de 6 cm et r ISL de 9 cm pour la condition L6R9, ou un l ISL de 9 cm et une ISL r de 6 cm à l'état L9R6
  4. Pour les rats, garder la longueur de la foulée pour toutes les conditions, sauf pour SL12 à un privilégiées 15 cm.
  5. Pour plus de commodité, affecter chaque côté long de la passerelle une condition asymétrique favorisant la gauche ou la right côté du sujet, tout en réservant les deux côtés courts pour la condition de commande symétrique.
  6. Configuration d'une caméra haute définition avec un taux d'au moins 60 Hz d'échantillonnage pour que le placement de membres sur des chevilles est dégagée avec la caméra pointant perpendiculairement à la passerelle avec le champ de vision couvrant environ 7 étapes. Les premières et dernières étapes de la proximité des plates-formes sont ignorés.

2. Formation sur Appareil

  1. S'il vous plaît utiliser les ressources de formation standard, par exemple., NIH formation dans Basique Biomethodology pour des rats de laboratoire, de se familiariser avec la formation comportementale générale des rongeurs.
  2. Au début de la formation, acclimater sujets en plaçant et de les récompenser sur la plate-forme cm 20 x 20 pendant au moins 5 min. Ensuite, guider les animaux à travers un régime de parité avec une longueur de foulée entre 1 cm de la plate-forme suivante par la présentation d'une récompense alimentaire. Récompensez animaux verbalement et avec caresser pour atteindre la plate-forme.
  3. AFTEr 5 descentes d'entraînement, l'espace les chevilles un supplément de 1 - 2 cm de distance et effectuer les 5 prochaines courses d'entraînement. Le nombre de répétitions figurant dans ce document est suffisant pour produire la taille de l'échantillon statistiquement appropriée (20 - 35 marches).
    1. Si l'animal acquiert la tâche plus lentement en juger par la cohérence de pas (pas d'arrêt) et la posture (dos voûté), puis se concentrer la formation sur le renforcement de ces compétences à la longueur de foulée courtes (S12) avant de reprendre l'entraînement sur les longues enjambées ( S15) éventuellement approche de la longueur de la foulée souhaitée.
    2. Si le nouvel espacement induit l'anxiété ou de l'inconfort à la tâche, réajuster les chevilles au réglage précédent et répéter le paradigme de la formation.
    3. Procéder à cette formation jusqu'à ce que les longueurs inter-stride appropriées sont atteints pour les quatre conditions et normes de locomotion sont remplies. Dans notre expérience, les rats réagissent bien à l'encouragement vocale comme repères pour entreprendre un essai. Le test peut être fait sur le même jour que la formation fournieles sujets sont motivés pour accomplir la tâche.
      Remarque: Les normes de locomotion sont comme suit: la marche est constante et ne se comporte pas arrêts ou faux; tête-pompage est minime; le dos est voûté et la queue est soulevée lors de la locomotion; chaque membre est clairement visible à partir d'une vue orthogonale de la passerelle à l'apparition et le décalage de la phase d'appui. Ce processus de sélection est essentiel que la présente étude se concentre uniquement sur la marche plutôt que d'autres comportements de gaiting.

3. Test et analyse des données

  1. Les animaux de laboratoire sur les tâches S12, S15, L9R6 et L6R9 (décrits dans la section 1.3) en utilisant une conception de la session randomisée. Utilisez des pauses pour éviter l'adaptation dans une tâche.
  2. Sessions d'enregistrement avec caméra haute définition avec un taux d'au moins 60 Hz d'échantillonnage. Importer des enregistrements vidéo sans ré-échantillonnage dans le logiciel de montage vidéo et de sélectionner uniquement les épisodes de marche pour une analyse plus approfondie.
  3. Mark Onsets et décalages de phases cinématiquesdans des enregistrements vidéo de chaque sujet.
  4. Ici, utilisez le logiciel personnalisé appelé Vidéoa écrit en Matlab pour identifier manuellement le temps de la position début et la fin pour chaque membre sur une base trame par trame, où la position apparition est indiquée par la perte de flou de mouvement associé à la mise en place de membre sur une cheville, et la position de décalage, se produisant à l'apparition de la branche lift-off, est indiqué par la première preuve de flou de mouvement.
  5. Calculer la durée de la phase d'oscillation que le temps restant entre deux onsets stance cinématiques consécutifs. Exclure tout comportement non conforme à la marche quadrupède Overground, par exemple., Lorsque la démarche contient une double phase de swing (les deux membres antérieurs ou postérieurs du sol), de procédure analyses.
  6. Tracer la durée de chaque phase en fonction de la durée du cycle de l'étape correspondante. Capturez la relation avec le modèle de régression linéaire (Tphase = B1 + B2 * Tc) obtenu pour chaque membre, où Tc est la durée du cycle, Tphase est eTe position ither liés extenseur ou Tf, qui est le swing liés fléchisseur, et B1 et B2 sont des constantes empiriques (offset et la pente) du modèle de régression.
    Remarque: La pente (B2) représente la quantité de changement de la durée de phase avec la variation de vitesse de locomotion.
  7. Utiliser des équations 1 et 2 (figure 2C) pour chaque membre de calculer l'indice d'asymétrie (AI). Les deux équations ont la même forme d'un rapport simple qui normalise la différence des deux valeurs à leur somme.
    1. En utilisant l'équation 1, calculer la différence horizontale (AI h) qui utilise la différence entre les pentes de la position de modulation gauche (L) et droit (R) membres. De même, le calcul de la asymétrie verticale (AI v) en utilisant les pentes de l'avant / antérieure (a) et à l'arrière / postérieures (p) membres. Le résultat de l'application de ces deux équations est le jeu de données de 4 points xy correspondant à 1) membre antérieur de l'asymétrie, aAI h; 2) des membres postérieurs asymétrie, Pai h; 3) membre antérieur gauche-postérieur asymétrie, Lai c; 4) membre antérieur-postérieur asymétrie droite, Rai v.
    2. Tracer ces valeurs sous forme de patch (figure 2B) pour la représentation visuelle de l'asymétrie dans toutes les branches.
  8. Calcul diagonalité indices (DI) pour évaluer le couplage diagonale entre les paramètres d'un membre antérieur et postérieur de son controlatéral (équation 3, figure 2C).
  9. Testez la DI, ainsi que la différence de quatre IA entre les conditions d'opposition à l'asymétrie (ΔAI = | AIL9R6 - AIL6R9 |) pour la signification statistique en utilisant une ANOVA à une voie avec la comparaison post-hoc de moyens d'analyse 19

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Résultats

La figure 2 montre l'analyse de l'asymétrie dans les tâches de locomotion pour un même objet représentant. Les valeurs ont été calculées pour toutes les conditions à l'aide de l'équation 1 et 2 à partir de tous les sujets individuellement (figure 2) et à partir des données composites de 8 rats femelles Sprague-Dawley (250-400 g, figure 3). Généralement, la modulation de la phase des membres antérieurs d'appui était mo...

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Discussion

La raison d’être de cette étude était de développer une tâche comportementale qui évalue quantitativement les changements dans le contrôle précis des comportements locomoteurs asymétriques. L’existence de la CPG spinale a été démontrée fonctionnellement depuis un certain temps20, mais les caractéristiques anatomiques et fonctionnelles qui décrivent son mécanisme ainsi que ses entrées modulatrices provenant de voies de rétroaction descendante ou sensorielle n’ont pas été caractérisées avant la dernière décennie...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Kriss Franklin, Amanda Pollard et Justine Shaffer ont participé au dressage des animaux et à la collecte de données. Sarah Freeman et Alisa Ivanova ont contribué à l’analyse des données. Cette étude est soutenue par WVU School of Medicine Start-Up, NIH/NIGMS U54GM104942 et NIH CoBRE P20GM109098.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MATLAB® ; R2013uneMathWorksDesign pour le logiciel d’annotation vidéo personnalisé
Sony HDR-CX380/B High Definition Handycam27-HDRCX330/BPériphérique d’acquisition vidéo.
Jif Beurre de cacahuète crémeux - Sans gluten 454 gJ.M. Smucker CompanyStimulus de récompense alimentaire.
Comprimé de saccharose - Chocolat 1800 gTestDiet1811256Stimulus de récompense alimentaire.
Manzanita Wood Gnawing SticksBioServeW0016Pour la présentation du stimulus de récompense alimentaire.
plate-forme Sony

Références

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