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Article de méthode

Isolement et caractérisation de neutrophiles avec des propriétés anti-tumorales

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DOI :

10.3791/52933

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19 juin 2015

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1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Les neutrophiles jouent un rôle important non seulement dans la défense de l’hôte contre les micro-organismes envahisseurs, mais sont également impliqués dans la surveillance immunitaire des cellules tumorales. Ici, nous décrivons des techniques liées à l’isolement de neutrophiles ayant des propriétés antitumorales et des méthodes de surveillance de la fonction antitumorale des neutrophiles in vitro et in vivo.

Résumé

Les neutrophiles, les plus abondants de tous les globules blancs dans la circulation humaine, jouent un rôle important dans la défense de l'hôte contre les micro-organismes envahissants. De plus, les neutrophiles jouent un rôle central dans la surveillance immunitaire des cellules tumorales. Ils ont la capacité de reconnaître des cellules tumorales et induire la mort des cellules tumorales, soit par un mécanisme de contact cellule-dépendant impliquant le peroxyde d'hydrogène ou par cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Les neutrophiles ayant une activité anti-tumeur peut être isolé à partir du sang périphérique de patients atteints de cancer et des souris porteuses de tumeurs. Ces neutrophiles sont appelés neutrophiles tumorales entraînées (RTE) pour les distinguer des neutrophiles de sujets en bonne santé ou de souris naïves qui montrent pas d'activité cytotoxique significative de la tumeur. En comparaison avec d'autres globules blancs, des neutrophiles montrent flottabilité différente ce qui rend possible l'obtention d'un> 98% de la population de neutrophiles pur lorsqu'il est soumis à un gradient de densité. Cependant, en pluspour la population de neutrophiles à haute densité normale (HDN), chez les patients atteints de cancer, chez des souris porteuses de tumeurs, ainsi que dans des conditions inflammatoires chroniques, les populations de neutrophiles basse densité distincts (LDN) figurent dans la circulation. LDN co-purifient avec la fraction mononucléaire et peut être séparé à partir des cellules mononucléaires en utilisant soit des stratégies de sélection positive ou négative. Une fois que la pureté des neutrophiles isolés est déterminée par cytométrie de flux, ils peuvent être utilisés pour in vitro et in vivo des essais fonctionnels. Nous décrivons des techniques de surveillance de l'activité anti-tumorale de cellules neutrophiles, de leur capacité à migrer et à produire des espèces réactives de l'oxygène, ainsi que le suivi de leur capacité de phagocytose ex vivo. Nous décrivons en outre des techniques d'étiqueter les neutrophiles pour le suivi in vivo, et de déterminer leur capacité anti-métastatique in vivo. Toutes ces techniques sont essentielles pour comprendre comment obtenir et caractériser les neutrophiles avec anti-tumeurfonction.

Introduction

Les neutrophiles ont d’abord été caractérisés comme les cellules immunitaires innées qui servent de défense de première ligne contre les micro-organismes envahisseurs. Aujourd’hui, on sait que les neutrophiles ont des fonctions plus étendues, étant impliqués dans la montée de réponses immunitaires adaptatives contre les antigènes étrangers1,2, la régulation de l’hématopoïèse3, l’angiogenèse4 et la cicatrisation des plaies5. De plus, les neutrophiles peuvent affecter la croissance tumorale et la progression métastatique en raison de leurs activités pro- et anti-tumorales6,7. Les neutrophiles sont caractérisés par un noyau segmenté polymorphe (d’où l’appellation de leucocytes polymorphonucléaires [PMN]) et contiennent au moins trois sous-classes distinctes de granules ainsi que des vésicules sécrétoires8 (Figure 1A-C).

Les neutrophiles possèdent une capacité phagocytaire élevée et une activité élevée de la NADPH oxydase essentielles à l’élimination microbienne, et sécrètent une large gamme de chimiokines importantes pour l’attraction de neutrophiles supplémentaires et d’autres cellules immunitaires sur le site de l’inflammation8,9. Les neutrophiles sont caractérisés par l’expression d’un grand nombre de récepteurs de surface, y compris les récepteurs de type Toll (TLR), les récepteurs de lectine de type C (CLR), le récepteur du complément 3 (CD11b/CD18) et d’autres molécules d’adhésion (par exemple, L-selectin, LFA-1, VLA-4 et la molécule d’adhésion cellulaire 3 liée à l’antigène carcinoembryonnaire (CEACAM3/CD66b)), les récepteurs des chimiokines (par exemple, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), les récepteurs chimioattractants (par exemple, PAFR, LTB4R et C5aR), les récepteurs des cytokines (p. ex., G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), les récepteurs du peptide formyle (p. ex., FPR1-3) et les récepteurs Fc (p. ex., CD16 (FcγRIII), CD32 (FcγRII) et CD64 (FcγRI)10. Chez la souris, les neutrophiles sont généralement identifiés comme CD11b+Ly6G+, tandis que les neutrophiles humains sont identifiés à l’aide des marqueurs leucocytaires CD11b, CD15, CD16 et CD66b. Il est également généralement accepté de colorer les protéines granulaires myéloperoxydase (MPO) et l’élastase des neutrophiles (NE) pour la détection des neutrophiles dans les tissus.

Il n’est toujours pas clair si les diverses fonctions des neutrophiles sont médiées par la même cellule ou par des sous-populations cellulaires distinctes. L’accumulation des données suggère la présence d’une population de neutrophiles hétérogènes qui présente un haut degré de plasticité affecté par les stimuli pro-inflammatoires et le microenvironnement11,12. Fridlender et al.13 ont grossièrement divisé les neutrophiles dans le cancer en deux sous-populations principales appelées N1 avec des propriétés anti-tumorales et N2 avec des propriétés pro-tumorales. Dans le cancer, ainsi que dans l’inflammation chronique, il existe une sous-population supplémentaire composée de cellules suppressives dérivées de myéloïdes granulocytaires (G-MDSC) qui suppriment les réponses des lymphocytes T14. Les G-MDSC sont considérées comme des cellules myéloïdes immatures caractérisées par unphénotypeCD11b+Ly6C faibleLy6G hi chez la souris15, tandis qu’elles ont un phénotypefaible CD15+/CD16 chez l’homme16. Les G-MDSC expriment des niveaux plus élevés d’arginase et de myéloperoxydase, tandis que des niveaux plus faibles de cytokines et de chimiokines que les neutrophiles circulants normaux. Ils sont moins phagocytaires et migrateurs, mais produisent des niveaux plus élevés de ROS15,17,18. Dans le présent article, nous décrirons quelques méthodologies de base pour l’isolement et la caractérisation des neutrophiles ayant des propriétés antitumorales.

Alors que les neutrophiles constituent la plus grande population de globules blancs dans la circulation humaine (45 - 70 %; 1 800 - 6 000/μl), chez la souris, dans des conditions normales, ils sont plutôt clairsemés (10 - 15 %; 300 - 500/μl). Le nombre de neutrophiles augmente régulièrement lors de l’inflammation et parfois dans le cancer, ce qui représente un état d’inflammation chronique7. Les neutrophiles se développent à partir de cellules multipotentes précurseurs myéloïdes communs (CMP) dans la moelle osseuse, par un processus de différenciation passant par les stades des myéloblastes (MB), des promyélocytes (PM), des myélocytes (MC), des métamyélocytes (MM) et des cellules bandelées (BC)8. Les neutrophiles post-mitotiques matures peuvent rester dans la moelle osseuse pendant 4 à 7 jours avant d’être libérés dans la circulation8. Le renouvellement des neutrophiles dans le sang est généralement rapide avec une demi-vie moyenne de 6 à 12 heures, qui peut être prolongée dans des conditions inflammatoires. Les neutrophiles non stimulés ont une activité anti-tumorigène limitée, une caractéristique qui peut être acquise en exposant les neutrophiles naïfs aux chimiokines IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 et CXCL56,19 ou artificiellement, en les exposant à l’ester phorbol phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)6.

La courte demi-vie des neutrophiles sanguins ainsi que le faible nombre de neutrophiles (~ 3 - 5 x 105) obtenus à partir de 1 ml de sang d’une souris naïve âgée de 6 à 8 semaines, ont rendu difficile l’exploration de la fonction des neutrophiles de souris circulants in vitro. Pour pallier cette difficulté, d’autres sources ont été utilisées. Par exemple, un grand nombre de neutrophiles peuvent être obtenus à partir de la moelle osseuse20 ou du péritoine après l’induction d’une inflammation stérile (par exemple, après une injection intrapéritonéale de bouillon de thioglycolate ou de Zymosan A). Il est à noter que les neutrophiles obtenus à partir de la cavité péritonéale n’exercent aucune activité anti-tumorigène (observation non publiée).

Granot et al. 6 a observé que les souris BALB/c inoculées orthotopiquement avec la lignée cellulaire du carcinome du sein 4T1 de souris développent une neutrophilie qui s’aggrave avec la progression tumorale6 (Figure 2A), de sorte que 20 à 40 millions de neutrophiles sanguins peuvent être facilement isolés à partir de 1 ml de sang 3 à 4 semaines après l’inoculation de la tumeur. Ces neutrophiles ont acquis des activités anti-tumorales, et ont donc été appelés neutrophiles entraînés par la tumeur (TEN), afin de les distinguer des neutrophiles naïfs6 (Figure 2B). Alors que les neutrophiles de haute densité (HDN, Figure 1A) sont fortement anti-tumorigènes, les neutrophiles de basse densité (LDN, Figure 1B) générés dans le cadre du cancer ne sont pas21. De plus, les neutrophiles à haute densité de la moelle osseuse et de la rate de souris porteuses de tumeurs ont une activité antitumorale (données non publiées). Il convient de noter qu’avec la progression tumorale, la rate s’élargit progressivement (splénomégalie), avec des quantités croissantes de neutrophiles.

Il convient de noter que les TEN sont également générés dans d’autres modèles de cancer, y compris spontanés (tumeurs mammaires MMTV-PyMT et MMTV-Wnt1 et tumeurs pulmonaires induites par k-Ras) et injectés (cellules de carcinome du sein AT-3 (MMTV-PyMT) et E0771, cellules de carcinome pulmonaire LLC Lewis et cellules de mélanome B16-F10). Cependant, l’étendue de la mobilisation des neutrophiles dans ces modèles tumoraux est bien inférieure à celle des souris inoculées au 4T1, atteignant 5 - 10 x 106 neutrophiles dans 1 ml de sang après 3 semaines.

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Protocole

Animaux : Des souris BALB/c âgées de 5 à 7 semaines sont achetées à Harlan (Israël). Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université hébraïque. Échantillons humains : La collecte de sang de patients atteints de cancer et de volontaires sains a été approuvée par le comité d’examen institutionnel (IRB) du centre médical Hadassah.  

1. Induction de neutrophiles aux propriétés antitumorales in vivo à l’aide d’un modèle murin de cancer du sein.

REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées à l’aide de solutions stériles dans une enceinte de biosécurité à flux d’air laminaire (LAF).

  1. Semez 5 x 105 cellules 4T1 dans une plaque de culture tissulaire de 100 mm dans 10 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 4,5 g/L de D-glucose complété par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 2 mM de D-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/ml de pénicilline G et 100 μg/ml de sulfate de streptomycine. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2 pendant 3 à 4 jours. Assurez-vous que les cellules sont confluentes à 50 - 100 % le jour de l’expérience.
  2. Pour détacher les cellules tumorales de la plaque de culture tissulaire, aspirez le milieu de culture, lavez les cellules avec 5 ml de PBS, aspirez le PBS et ajoutez 3 ml d’une solution de trypsine de 2,5 g/L. Incuber les cellules 2 à 3 min avec de la trypsine à 37 ºC.
  3. Ajoutez 10 ml de milieu contenant du sérum pour neutraliser la trypsine et pipetez de haut en bas jusqu’à ce que toutes les cellules aient été détachées. Transférez la suspension des cellules dans un tube à centrifuger conique de 15 ml.
  4. Centrifugez les cellules à 200 x g pendant 5 min à RT. Aspirez le milieu en laissant 200 μl de milieu au-dessus de la pastille de cellule. Remettez les cellules en suspension dans le volume résiduel et ajoutez 10 ml de PBS. Retournez le tube 2 à 3 fois pour obtenir une suspension cellulaire homogène et retirez 10 μl pour compter les cellules dans un hémocytomètre. Utilisez du bleu trypan pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 x g à RT. Aspirer le PBS et remettre en suspension les cellules dans le PBS à une concentration finale de 2 x 106 cellules/ml. S’assurer que la suspension unicellulaire n’a pas d’agglutination.
  6. Injecter 1 x 10cellules 6 4T1 ou des cellules 4T1 exprimant la luciférase dans 50 μl de PBS par voie orthotopique dans le coussinet adipeux mammaire inguinal gauche de souris femelles BALB/c à l’aide d’une seringue de 0,3 ml avec une aiguille de 30G x 8 mm.
    1. Avant l’injection, anesthésez les souris dans une chambre d’induction recevant un débit lent d’isoflurane (3 à 5 %) dans 100 % d’oxygène.
    2. Posez la souris sur un tampon chirurgical stérile et assurez-vous que la tête est correctement placée à l’intérieur du cône nasal de l’isoflurane. Confirmez la bonne anesthésie en pinçant la patte. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Rasez les poils autour du site d’injection et désinfectez-les avec 70 % d’EtOH.
    3. À l’aide d’un ensemble stérile d’outils chirurgicaux, faites une petite incision horizontale (5 mm) à peu près à mi-chemin entre les mamelons inguinaux et abdominaux, exposez le coussinet adipeux et injectez 1 x 106 cellules 4T1 dans 50 μl. Fermez les incisions avec des clips de 9 mm qui doivent être retirés une semaine plus tard. L’injection de cellules exprimant la luciférase permet de surveiller la taille de la tumeur et les métastases par imagerie par bioluminescence.
      REMARQUE : Cette procédure peu invasive ne nécessite aucun traitement post-chirurgical et les souris injectées se rétablissent en 2 à 3 minutes.
    4. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles reprennent conscience et assurez-vous qu’elles reprennent pleinement conscience avant de rejoindre la compagnie d’autres souris.
  7. Après 3 à 4 semaines, lorsque la tumeur primitive a atteint un volume de 2 cm3, sacrifiez les souris par un lent flux de CO2, et immédiatement après le dernier souffle, prélevez du sang par ponction cardiaque à l'aide d'une aiguille de 25G x 5/8' reliée à une seringue à tuberculine de 1 ml prétraitée à l'héparine. Gardez la bouche de l’aiguille vers le haut lorsque vous insérez la seringue en position horizontale à travers le diaphragme vers le cœur, et aspirez lentement et progressivement le sang en évitant l’excès de pression (Figure 3).

2. Isolement des neutrophiles

  1. Isolement de neutrophiles cytotoxiques à partir du sang de souris porteuses de tumeurs.
    1. Diluer 1 ml de sang prélevé sur une souris porteuse d’une tumeur (voir Protocole 1.11) dans du PBS contenant 0,5 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) jusqu’à un volume final de 6 ml.
    2. Fractionnement du sang dilué sur un gradient discontinu de saccharose fraîchement préparé :
      1. Ajouter 3 ml de saccharose stérile filtré 1,119 g/ml au fond d’un tube à centrifuger conique en polypropylène de 15 ml.
      2. Lentement et soigneusement, superposez 3 ml de saccharose filtré stérile 1,077 g/ml sur la couche de 1,119 g/ml. Par la suite, ajoutez lentement et soigneusement les 6 ml de sang dilué (Protocole 2.1.1) par-dessus la couche de 1,077 g/ml (Figure 4A). Il est recommandé de maintenir le tube incliné et d’ajouter les différents composants par un flux lent mais continu, en maintenant la bouche de la pipette vers la paroi inférieure du tube, de sorte qu’aucune turbulence ne se forme.
    3. Centrifuger le tube contenant le sang dilué sur le gradient de saccharose à 700 x g pendant 30 min à RT sans frein.
    4. Retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse sans provoquer de turbulences. La plupart des érythrocytes se trouvent au fond du tube. Les neutrophiles de haute densité (HDN) se trouvent sous la forme d’un cycle blanc à rouge à l’interface entre les couches de 1,119 g/ml et de 1,077 g/ml (autour de la marque des 3 ml), tandis que les leucocytes de faible densité se trouvent dans un anneau blanc à l’interface entre la couche de 1,077 g/ml et le PBS contenant du BSA (autour de la marque de 6 ml, voir la figure 4B).
    5. Aspirer le PBS + 0,5 % BSA jusqu’à ce qu’il atteigne 5 mm au-dessus de la couche cellulaire de faible densité. Pipetez les cellules de faible densité par aspiration lente dans un embout de 1 ml en tourbillonnant lentement autour des cellules. Transférez les cellules dans 30 ml de PBS avec 0,5 % de BSA.
    6. Aspirez la couche supérieure dans le même tube dégradé jusqu’à ce qu’elle atteigne 5 mm au-dessus de la bande cellulaire à haute densité. Pipetez les cellules à haute densité, qui sont pour la plupart des neutrophiles de haute densité, et transférez les cellules dans 30 ml de PBS contenant 0,5 % de BSA.
    7. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 10 min à RT.
    8. Aspirer les érythrocytes surnageants et lyser en remettant les cellules en suspension dans 36 ml d’eau stérile de qualité HPLC pendant 30 secondes. L’isotonicité doit être restaurée par l’ajout de 9 ml d’un PBS concentré 5x complété par 2,5 % (p/v) BSA.
    9. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 10 min à RT.
    10. Aspirez le surnageant et mettez les cellules en suspension dans PBS-BSA. Comptez le nombre de neutrophiles dans un hémocytomètre et utilisez le bleu trypan pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
    11. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 10 min à RT et remettre les neutrophiles en suspension dans le milieu d’incubation souhaité jusqu’à la densité cellulaire finale. Utilisez les neutrophiles immédiatement.
    12. Puis, après une autre centrifugation, remettre les neutrophiles en suspension dans le milieu d’incubation jusqu’à la densité cellulaire finale. Utilisez les neutrophiles immédiatement.
  2. Isolement des neutrophiles circulants chez les patients atteints de cancer.
    1. Mélangez 10 ml de sang humain hépariné (20 U/ml) avec un volume égal de 3 % de Dextran T500 dans une solution saline et incubez pendant 30 min à RT. Au cours de cette incubation, les érythrocytes vont se sédimenter.
    2. Préparez un tube conique en polypropylène de 50 ml avec 10 ml de saccharose 1,077 g/ml et superposez lentement le surnageant riche en leucocytes sur la couche de saccharose de 1,077 g/ml (figure 4C).
    3. Centrifugeuse à 400 x g pendant 30 min à RT sans frein. Les neutrophiles à haute densité (HDN) apparaîtront dans la cuillère. Les neutrophiles de basse densité (LDN) co-purifient avec les monocytes et les lymphocytes à l’interface entre la couche de saccharose de 1,077 g/ml et le plasma (Figure 4D).
    4. Remettre les neutrophiles en suspension dans 10 ml de NaCl à 0,2 % pendant 30 secondes pour lyser les érythrocytes contaminants, et rétablir l’isotonicité en ajoutant 10 ml de NaCl à 1,6 % et inverser une fois.
    5. Centrifuger 5 min à 160 x g à RT, et laver trois fois dans 20 ml de solution saline équilibrée de Hanks. Centrifugez après chaque lavage et aspirez le surnageant.
    6. Comptez les neutrophiles et remettez en suspension les cellules dans le RPMI-1640 complété par 2 % de FBS à raison de 2 x 106 neutrophiles/ml ou au choix.

3. Enrichissement des neutrophiles sanguins à l’aide de billes magnétiques

  1. Sélection positive
    1. Prélever 1 ml de sang sur une souris comme décrit dans le Protocole 1.8, avec une seringue héparinisée.
    2. Centrifuger le sang dans un tube conique de 15 ml à 400 x g pendant 5 min à RT.
    3. Aspirez le surnageant ou conservez le plasma sanguin pour des études ultérieures.
    4. Lyser les érythrocytes en remettant les cellules en suspension dans 8 ml d’eau de qualité HPLC. Après 30 secondes, rétablissez l’isotonicité en ajoutant 2 ml de PBS concentré 5x contenant 2,5 % de BSA. Comptez les cellules.
    5. Centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à RT.
    6. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μl de PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA pour 108 cellules.
    7. Ajouter 50 μl d’anticorps anti-Ly6G biotinylé. Bien mélanger et incuber 10 min au réfrigérateur (pas sur glace).
    8. Ajouter 150 μl de PBS froid contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA.
    9. Vortex, la solution mère de microbilles magnétiques enrobées d’anti-biotine. Transférer 100 μl dans la suspension cellulaire. Bien mélanger et incuber 15 min au réfrigérateur (pas sur de la glace).
    10. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA, et centrifuger à 400 x g pendant 10 min à RT.
    11. Aspirer complètement le surnageant et le remettre en suspension dans 500 μl de PBS froid contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA.
    12. Insérez une colonne de séparation magnétique dans un support magnétique fixé à un support magnétique et rincez-le avec 500 μl de PBS froid contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA.
    13. Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne. Le flux contient des cellules LyG6 négatives non étiquetées.
    14. Lavez la colonne avec 500 μl de PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA. D’autres cellules non étiquetées seront dans le flux.
    15. Répétez l’étape de lavage avec un autre PBS de 500 μl contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA.
    16. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la sur un tube de prélèvement de 15 ml. Ajoutez 1 ml de PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA, et rincez les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne. Le flux contient des neutrophiles Ly6G+.
  2. Sélection négative
    1. Préparez les leucocytes sanguins conformément aux étapes 3.1.1 à 3.1.5.
    2. Mettre en suspension 1 x 108 cellules dans 1 ml de PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA dans un tube en polystyrène à fond rond de 5 ml.
    3. Ajouter 50 μl de sérum de rat normal.
    4. Ajouter 50 μl de cocktail d’enrichissement en neutrophiles (contenant des anticorps biotinylés spécifiques des globules blancs non neutrophiles), bien mélanger et incuber 15 min au réfrigérateur.
    5. Laver les cellules en ajoutant 4 ml de PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA, et centrifuger 400 x g pendant 10 min.
    6. Jetez le surnageant et mettez les cellules en suspension dans 1 ml de PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA.
    7. Ajouter 50 μl de complexes d’anticorps tétramères dirigés contre la biotine et le dextran. Bien mélanger et incuber 10 min au réfrigérateur.
    8. Vortex bien le tube contenant des billes magnétiques recouvertes de dextran avant d’ajouter 150 μl à la suspension cellulaire. Bien mélanger et incuber 10 min au réfrigérateur.
    9. Portez la suspension cellulaire à un volume total de 2,5 ml en ajoutant du PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA. Mélangez doucement pour obtenir une suspension cellulaire homogène.
    10. Insérez le tube (sans le capuchon) dans l’aimant et laissez reposer pendant 3 min.
    11. Retournez l’aimant avec le tube dans un mouvement continu de sorte que les cellules non liées dans le fluide soient transférées dans un nouveau tube. Laissez l’aimant et le tube inversés pendant 2 à 3 secondes, puis revenez en position verticale. Les cellules indésirables marquées magnétiquement resteront liées à la paroi du tube d’origine, tandis que les neutrophiles non liés seront dans le liquide transféré.

4. Coloration cytologique des neutrophiles

  1. Remettez en suspension 1x105 neutrophiles dans 50 μl de PBS et transférez la suspension cellulaire dans un adaptateur de préparation cellulaire à couche mince tel qu’un Cytospin. Centrifugez l’adaptateur à 150 x g pendant 5 min. Séparez la lame de verre pré-étiquetée de l’adaptateur.
  2. Fixez les cellules en trempant les lames de verre dans de l’éthanol à 70 % pendant 2 min. Laissez les préparations de l’adaptateur (voir étape 4.1) sécher à RT avant de colorer. Trempez les lames 5 à 6 fois dans de l’eau distillée.
  3. Colorer 1 à 2 min dans la solution d'hématoxyline de Mayer. Rincer 1 min à l’eau du robinet. Coloration 10 sec dans la solution d’éosine Y. Laver à l’eau du robinet. Déshydrater en rinçant les lames à des concentrations croissantes d’éthanol (70 %, 96 % et 100 %). Laissez les lames de verre sécher brièvement à l’air libre et inspectez-les au microscope optique.
    REMARQUE : L’hématoxyline a une couleur bleu-violet profond et colore les acides nucléiques, tandis que l’éosine est rose et colore les protéines de manière non spécifique. Les granules cytoplasmiques des neutrophiles ne sont pas colorés par des colorants acides ou basiques, d'où l'origine du nom « aimer être neutre ». Alors que les granulocytes basophiles se colorent en bleu foncé avec l’hématoxyline et l’éosine et que les granulocytes éosinophiliques sont en rouge vif, les neutrophiles apparaissent en rose neutre (voir figure 1A). Les neutrophiles matures sont caractérisés par un noyau polymorphonucléaire, qui est en général de grande taille avec 2 à 5 lobes « neutrophiles segmentés » (figures 1A et 1C). Les neutrophiles immatures sont caractérisés par un noyau unilobé, incurvé ou en forme d’anneau (Figure 1B).

5. Détermination de la pureté des neutrophiles par cytométrie en flux.

  1. Mettre en suspension 1x10cellules 6 dans 100 μl de tampon FACS (PBS contenant 0,5 % de BSA, 2 mM d’EDTA et 0,02 % de NaN3). Pour les échantillons de sang total, une hémolyse est nécessaire avant la coloration (étapes 3.1.1 à 3.1.5). Ajouter 10 μl de réactif de blocage FcR pendant 5 min.
  2. Ajouter 0,5 μg d’anticorps marqués par fluorescence avec une spécificité à Ly-6G pour les neutrophiles de souris ou à CD11b et CD66b pour les neutrophiles humains, bien mélanger et incuber pendant 15 min à RT.
  3. Ajustez le volume à 500 μl avec du PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA et analysez la coloration par cytométrie en flux.

6. Suivre Neutrophile Gate in vivo

  1. Marquage BrdU in vivo des neutrophiles
    1. Injecter 100 μl d’une solution de bromodéoxyuridine (BrdU) à 10 mg/ml dans du PBS stérile par voie intrapéritonéale à des souris porteuses de tumeurs.
    2. Isoler les neutrophiles sanguins 48 heures après l’injection conformément au protocole 2.1. Colorez les neutrophiles marqués à BrdU à l’aide d’un kit d’écoulement BrdU.
  2. Marquage CFSE des neutrophiles
    1. Mettre en suspension 10à 7 neutrophiles dans 1 ml de PBS préchauffé.
    2. Ajouter 2 μl d’une solution mère de 5 mM de CFSE aux neutrophiles en suspension jusqu’à une concentration finale de 10 μM. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 37 °C. 5 mM de CFSE est préparé en dissolvant 2,8 mg de CFSE (diacétate de 5-(et 6-)-carboxyfluorescéine, ester de succinimidyle) dans 1 ml de DMSO. Diviser en aliquotes de 10 μl dans des tubes stériles de 200 μl et conserver dans l’obscurité à -20 °C.
    3. Neutralisez l’excès de CFSE en ajoutant un volume égal de RPMI-1640 contenant 10 % de FBS. Incuber pendant 10 min à 37 °C. Centrifuger les neutrophiles à 400 x g pendant 10 min à RT. Laver les neutrophiles deux fois dans 10 ml de RPMI-1640 contenant 10 % de FBS.
    4. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min et remettre en suspension dans un volume approprié de PBS. Les neutrophiles (par exemple, 1 x 107 cellules) peuvent maintenant être injectés par voie intraveineuse ou par injection cardiaque à des souris receveuses.

7. Dosage in vitro de la luciférase pour surveiller l’activité antitumorale des neutrophiles isolés.

  1. Cultiver des cellules tumorales marquées à la luciférase comme décrit pour les cellules 4T1 dans le protocole 1.1-1.5, mais remettre en suspension les cellules dissociées de la trypsine dans un milieu sérique réduit optimisé complété par 2 % de FBS. Ajustez la densité cellulaire à 5 x 104 cellules par ml.
  2. Ensemencez 5 000 cellules tumorales marquées à la luciférase dans un milieu sérique réduit optimisé de 100 μl contenant 0,5 % de FBS dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire blanche à 96 pieds plats.
  3. 4 heures après l’ensemencement des cellules tumorales, ajoutez 1 x 105 neutrophiles dans un milieu sérique réduit optimisé de 50 μl contenant 0,5 % de FBS, et incubez O/N. Préparez une suspension de cellules neutrophiles d’une densité de 2 x 106 cellules/ml. Les puits de contrôle doivent obtenir un milieu de 50 μl sans neutrophiles. Faites plusieurs répétitions de chaque cadre expérimental.
  4. Le lendemain matin, aspirez doucement le surnageant et lavez chaque puits avec 200 μl de PBS. Aspirez le PBS et ajoutez 50 μl de tampon de lyse passive. Pour détacher facilement les cellules (telles que les cellules AT-3), ne lavez pas dans du PBS et ajoutez le tampon de lyse de culture cellulaire immédiatement après avoir aspiré le milieu de croissance.
  5. Recouvrez la plaque de papier d’aluminium et incubez-la sur un agitateur orbital à 150 tr/min pendant 20 min à RT.
  6. Placez la plaque dans un lecteur de plaque à luminescence. Injectez une solution de dosage de luciférase de 50 μl et lisez la chimiluminescence pendant 10 secondes par puits.
  7. Calculez le % de lyse tumorale à l’aide de la formule suivante : % de lyse tumorale = (1-[luminescence des échantillons avec des neutrophiles]/[luminescence des échantillons dans le milieu]) x 100 %.

REMARQUE : Pour évaluer la contribution des neutrophiles à l’ensemencement métastatique, les neutrophiles peuvent être appauvris comme décrit dans le protocole 8.1. Pour une déplétion efficace, administrez des anticorps appauvrissant les neutrophiles à partir du 7e jour après la greffe tumorale.

8. Activité anti-métastatique des neutrophiles dans un modèle murin de cancer du sein.

  1. Appauvrissement in vivo des neutrophiles.
    1. Préparez fraîchement 12,5 μg d’anticorps anti-Ly6G (anticorps déplévant les neutrophiles) ou d’anticorps de contrôle des isotypes de rat (IgG2a, Κ) dans une solution saline à un volume final de 100 μl par souris.
    2. À partir du 3e jour post-greffe tumorale, injecter quotidiennement une dose intrapéritonéale de 12,5 μg d’anticorps anti-Ly6G de rat (100 μl). Injecter chez les souris témoins ou 12,5 μg (100 μl) d’anticorps de contrôle d’isotype de rat (IgG2a, Κ).
    3. À partir du 14e jour, administrez les anticorps deux fois par jour, car le taux de production de neutrophiles augmente considérablement lorsque la tumeur 4T1 se développe.
    4. Tous les deux jours, prélevez un échantillon de sang (2 à 3 gouttes) en entaillant la veine caudale latérale. Prélevez le sang dans un tube contenant un anticoagulant (héparine, citrate ou EDTA).
    5. Vérifier la déplétion des neutrophiles à l’aide de la cytométrie en flux comme décrit dans le protocole 5.
  2. Test de neutralisation tumorale (test Winn modifié)
    1. Isolez les neutrophiles de souris porteuses de tumeurs. Mélangez 1 x 106 cellules tumorales et 3 x 106 neutrophiles dans une solution saline de 50 μl (par souris).
    2. Injectez les cellules par voie sous-cutanée sur le flanc de souris BALB/c naïves âgées de 6 à 8 semaines. Rasez le flanc avant la greffe de tumeur pour permettre des mesures précises de la taille de la tumeur. Mesurez la taille de la tumeur quotidiennement à partir du 5e jour après la greffe.
  3. Transfert adoptif de neutrophiles
    1. Injectez 2 x 10 cellules tumoralesexprimant la luciférase dans 200 μl de PBS dans la veine de la queue.
    2. Le transfert de neutrophiles doit être effectué 4 heures après l’injection de cellules tumorales. Par conséquent, commencez la purification de HDN à partir de souris porteuses de tumeurs (protocole 2.1) environ 2 heures avant leur transfert in vivo prévu. Remettre les neutrophiles en suspension dans le PBS à une concentration finale de 2,5 x 107 cellules/ml.
    3. 4 heures après l’introduction des cellules tumorales, placez les souris sous une lampe chauffante pendant 5 min. Placez les souris dans un dispositif de contention et injectez 5 x 106 HDN (200 μl) par la veine de la queue. Les souris témoins sont injectées avec le véhicule (PBS).
    4. Surveiller la formation de métastases pulmonaires à différents moments à l’aide d’un système d’imagerie in vivo par bioluminescence ou par immunohistochimie.
  4. Essai d’ensemencement métastatique pulmonaire
    1. Injecter orthotopiquement 0,5 à 1 x 106 cellules parentales 4T1 dans le coussinet adipeux mammaire inguinal gauche, comme décrit dans le protocole 1.
    2. Le 10e jour, remettre en suspension les cellules 4T1 exprimant la GFP dans le PBS à une concentration finale de 5 x 105 cellules/ml. Placez les souris sous une lampe chauffante pendant 5 min.
    3. Placez les souris dans un dispositif de contention et injectez 1x105 cellules 4T1 exprimant la GFP (200 μl) par voie intraveineuse à des souris porteuses de tumeurs 4T1 ou à des souris naïves.
    4. Le lendemain, euthanasiez les souris et perfuser les poumons avec 20 ml de PBS pour éliminer les globules rouges restants.
    5. Exciser les poumons pour l’analyse des cellules GFP-positives par immunohistochimie.
      REMARQUE : Pour évaluer la contribution des neutrophiles à l’ensemencement métastatique, les neutrophiles peuvent être appauvris comme décrit dans le protocole 8.1. Pour une déplétion efficace, administrez des anticorps appauvrissant les neutrophiles à partir du 7e jour après la greffe tumorale.

9. Suppression de la prolifération des lymphocytes T par les neutrophiles de souris porteuses de tumeurs.

  1. Retirez la rate d’une souris BALB/c naïve euthanasiée et placez-la dans 10 ml de PBS.
  2. Placez la rate sur une crépine cellulaire de 40 μm qui est fixée sur une boîte de Pétri remplie de RPMI-1640. À l’aide de l’extrémité du piston de la seringue, écrasez la rate à travers la passoire cellulaire dans la boîte de Pétri. Rincez la passoire cellulaire avec 5 ml de RPMI. Jetez la passoire.
  3. Transférez les cellules remises en suspension dans un tube conique de 50 ml et centrifugez 400 x g pendant 10 min.
  4. Jetez le surnageant et lysez les érythrocytes en suspendant les cellules dans 36 ml d’eau pure pendant 20 secondes, et ajustez à l’isotonicité en ajoutant 4 ml de PBS concentré x 10. Alternativement, lyser les érythrocytes en suspendant les cellules dans 5 ml de tampon de lyse des érythrocytes (ACK), et incuber 5 min à RT. Neutraliser l’ACK en ajoutant 10 ml de milieu RPMI-1640. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min à RT. Remettre les cellules en suspension dans 5 ml de PBS et compter les cellules.
  5. Remettre en suspension les splénocytes dans le PBS jusqu’à une densité finale de 4 × 107cellules/2 ml dans un tube de 15 ml. Ajouter 2 ml d’une solution de CFSE de 2,5 μM dans du PBS. Retournez rapidement le tube et incubez pendant 10 min à 37 °C avec mélange occasionnel (toutes les 2 min), à l’abri de la lumière.
  6. Tremper l’excès de CFSE en ajoutant 4 ml de FBS préchauffé (100 %) et incuber pendant 1 min à RT. Ajouter 3 ml de PBS et centrifuger à 400 x g pendant 10 min.
  7. Laver les cellules avec 30 ml de PBS et centrifuger à 400 x g pendant 10 min.
  8. Filtrez les cellules à travers une passoire de cellules de 40 μm et lavez-les à nouveau avec du PBS.
  9. Remettre en suspension les cellules dans le milieu RPMI-1640 complété par 10 % de FBS jusqu’à une densité finale de 2 x 107 cellules / ml.
  10. Grainer 2 x 106/puits (200 μl) dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits.
  11. Stimulez les cellules en ajoutant 1 μg d’anticorps CD3ε anti-souris de hamster arménien purifié dans 500 μl de RPMI-1640 avec 10 % de FBS.
  12. Ajouter 2 x 106 HDN ou LDN dans 300 μl de RPMI-1640 avec 10 % de FBS aux splénocytes marqués au CFSE, et incuber pendant 3 jours à 37 °C. Les puits sans neutrophiles devraient obtenir un milieu de 300 μl. Le volume total dans chaque puits doit être de 1 ml.
  13. Collectez les cellules et préparez-les pour la cytométrie en flux. Remettez les cellules en suspension dans un tampon FACS de 100 μl (protocole 5) et ajoutez 10 μl de réactif de blocage FcR. Incuber pendant 5 min à RT.
  14. Ajouter 1 μl d’anticorps anti-CD8α conjugué à l’APC et incuber pendant 15 min à RT.
  15. Déterminer l’intensité de fluorescence CFSE sur les lymphocytes T CD8+ par cytométrie en flux (Figure 5). L’intensité de la CFSE est réduite de moitié à chaque division cellulaire. Ainsi, le nombre de divisions cellulaires peut être déterminé par l’intensité de la coloration CFSE.

10. Essai de migration des neutrophiles

  1. Grainez 5x105 cellules 4T1 dans un milieu sérique réduit optimisé de 7 ml, complété par 0,5 % de FBS dans un flacon de culture tissulaire de25 cm et incubez, 24 heures à 37 °C.
  2. Transférez 800 μl du surnageant dans la chambre inférieure d’une plaque de migration avec une taille de pores de 5 μm.
  3. Mettre en suspension 2 x 105 neutrophiles dans 400 μl de milieu sérique réduit optimisé complété par 0,5 % de FBS. Appliquez la suspension cellulaire dans la chambre supérieure et incubez pendant 2 heures à 37 °C.
  4. À la fin de l’incubation, retirez la chambre supérieure et comptez le nombre de neutrophiles qui ont migré vers la chambre inférieure.

11. Surveillance de la production de neutrophiles d’espèces réactives de l’oxygène (ROS).

  1. Préparez 1,1 x 106 neutrophiles/ml dans la solution saline équilibrée de Hank sans rouge de phénol. Plaque de 180 μl contenant 2 x 105 neutrophiles dans chaque puits d’une plaque blanche à fond plat de 96 puits.
  2. Placez la plaque dans un lecteur de plaque à luminescence. Ajoutez 20 μl d’une solution de luminol de 500 μM dans du PBS dans chaque puits pour obtenir une concentration finale de 50 μM. Lisez la chimiluminescence basale pendant 1 seconde sur une durée de 5 min avec des intervalles de 10 secondes.
  3. Ajouter un stimulant (p. ex., PMA à une concentration de 10 nM ou 100 nM ou fMLP à une concentration de 10 μM). Préparez une solution concentrée 10 fois de chaque agent dans la solution saline équilibrée de Hank sans rouge de phénol et ajoutez 22 μl dans les puits respectifs. Pour contrôler les puits, ajoutez 22 μl de véhicule.
  4. Mesurez la chimiluminescence dans le lecteur de plaques. Faites à la fois un cours court (toutes les 10 secondes pendant 5 minutes) et un long (toutes les minutes pendant 1 heure).

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Résultats

Dans une étude récente, nous avons identifié une fonction anti-métastatique pour les neutrophiles6. Les neutrophiles provenant de souris porteuses de tumeurs acquièrent un phénotype cytotoxique et ont la capacité de tuer les cellules tumorales6. Ceci contraste avec les neutrophiles provenant de souris naïves, qui n'ont aucun effet anti-tumoral significatif6. Plusieurs des techniques décrites dans la section Protocole ont été utilisées pour étudier la fonction des neutrophiles anti-tumorau...

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Discussion

Les neutrophiles sont les plus abondants de tous les globules blancs et sont les premiers intervenants en cas d’infection et d’inflammation. En tant que tels, ils sont très sensibles aux signaux externes et sont facilement activés. De plus, les neutrophiles ont une demi-vie très courte et un renouvellement rapide. L’ensemble de ces caractéristiques soulève plusieurs difficultés dans le travail avec les neutrophiles, de sorte que des stratégies expérimentales uniques sont nécessaires. Par exemple, il existe plusieurs stra...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

ZG est soutenu par des subventions du programme I-CORE de la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 41/11), de la Fondation Abisch-Frenkel, du Rosetrees Trust, de la Fondation israélienne pour la recherche sur le cancer (ICRF - Research Career Development Award) et de la fondation CONCERN. ZGF est soutenu par des subventions de la Fondation israélienne pour la recherche sur le cancer (ICRF - Research Career Development Award), du scientifique en chef du ministère israélien de la Santé et de l’Association pulmonaire d’Israël.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
LIGNÉES CELLULAIRES
Souris 4T1 cellules de carcinome du seinADCCCRL-2539Milieu de croissance : DMEM + 10 % FBS INACTIVÉ PAR LA CHALEUR
ARTICLES ET ÉQUIPEMENTS EN
24 puits Plaque de culture tissulaire  ;Falcon353047Plaque de culture tissulaire stérile
de 100 mm  ;Corning430167Stérile
25 cm2 Flacon de culture tissulaireNunc156340
Stérile 90 mm Plat de culture bactérienne  ;Miniplast, Ein Shemer, Israël20090-01-017
Tube à centrifuger conique stérile de 15 ml  ;Miniplast, Ein Shemer, Israël835015-40-111Tube
centrifuger conique stérile stérile de 50 ml  ;Miniplast, Ein Shemer, Israël835050-21-111Faucon stérile
12 x 75 mm Tube en polystyrène à fond rond.Becton Dickinson352058
Plaque de migration stérile Millicell 24 avec une taille de pores de 5&mu ; m  ;Merck MilliporePSMT010R1
Assiette stérile à fond plat blanc 96Costar3917stériles
(40 mm)  ;BD Falcon352340Aiguille stérile
20G x 1,5BD Microlance 3  ;301300Aiguille stérile
23G x 1"BD Microlance 4300800Aiguille stérile
25G x 5/8"BD Microlance 5300600Seringue stérile
0,3 ml avec aiguille 30G x 8 mmMicro-Fine Plus Demi320829Clips stériles
de 9 mm.BD, AutoClip  ;427631Aimant EasySep stérile
STEMCELL Technologies18000
MACS LS Colonne de séparation  ;Miltenyi Biotech130-042-201
Aimant séparateur MidiMACSMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultiStandMiltenyi Biotech130-042-303
Lame de verre de microscope.Menzel-Glä ; ser Superfrost  ; AgitateurJ1800AMNZ
  ;Sky line, ELMIS-3.02.10L
Lecteur de plaques  ;TECANInfiniteF200Pro
POUDRE
Albumine sérique bovine (BSA), fraction VSigmaA7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  ;BD Pharmingen550891Stérile
CFSE (diacétate de 5-(et 6-)-carboxyfluorescéine, ester de succinimidyle)Sondes moléculairesC1157
Dextran T500Sigma31392
Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine  ;SigmaH3149
Azoture de sodium (NaN3)SigmaS8032Hautement toxique, manipuler avec précaution
Poudre de thioglycolate  ;Difco225650
Zymosan ASigmaZ4250
MILIEUX ET SUPPLÉMENTS
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)SigmaD5796Stérile
Opti-MEM® ; J’ai réduit le sérum moyen  ;Life Technologies31985062Stérile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 moyenSigmaR8758
Sérum bovin fœtal stérile (FBS), inactivé par la chaleurSigmaF9665Stérile
L-GlutamineBiological Industries, Beth HaEmek, Israël03-020-1A
Pyruvate de sodiumBiological Industries, Beth HaEmek, Israël03-042-1B
Pénicilline stérile Streptomycine x 1000 solutionBiological Industries, Beth HaEmek, Israël03-031-5
Solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) sans Mg2+ et Ca2+  ;Biological Industries, Beth HaEmek, Israël02-023-1PBS
stérile x 10 sans Ca2+ et Mg2+.Biological Industries, Beth HaEmek, Israël02-023-5AEau stérile
de qualité HPLC  ;J.T. Baker4218-03Autoclave
SOLUTIONS
ACK &ndash ; Technologies de la vie à l’ammonium-chlorure de potassiumA10492-01
Solution de broméoxyuridine (BrdU) (10 mg/ml) dans du PBSDissoudre 10 mg de BrdU dans 1 ml de PBS et un filtre stérile.
CFSE, 5 mM dans du DMSODissoudre 2,8 mg de CFSE dans 1 ml de DMSO. Répartir en aliquotes de 10 ml dans des tubes stériles de 200 ml et conserver dans l’obscurité à -20oC.
Solution d’éosine YSigmaHT110-2-32
Solution saline équilibrée de HanksBiological Industries, Beth HaEmek, Israël02-016-1A
Héparine stérile, 20 mg/ml dans du PBSDissoudre 100 mg d’héparine dans 5 ml de PBS stérile, et filtrer stérile à travers un filtre de 0,2 mm.  ;
Histopaque-1119  ;Sigma11191Filtre stérile à travers un filtre de 0,2 mm.
Histopaque-1077  ;Sigma10771Filtre stérile à travers un filtre de 0,2 mm.
Tampon de lyse de culture cellulaire luciférase x5PromegaE153ADiluer 1:5 dans de l’eau stérile juste avant utilisation.
Solution de dosage de la luciférasePromegaE1501Contient de la poudre de substrat de dosage de la luciférase (E151A) et du tampon de dosage de la luciférase (E152A)
Solution d’hématoxyline de Mayer  ;SigmaMHS-32
PBS + 0,5 % BSADissoudre 2,5 g BSA dans 500 ml de PBS, et filtrer stérilement à travers un filtre de 0,2 mm.
PBS + 1 % BSADissoudre 1g BSA dans 100 ml de PBS, et filtrer stérilement à travers un filtre de 0,2 mm.
Dissoudre 12,5 g de BSA dans un mélange de 250 ml d’eau stérile de qualité HPLC et de 250 ml de PBSx10, et filtrer stérilement à travers un filtre de 0,2 mm.
PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTADissoudre 250 mg de BSA dans 50 ml de PBS stérile et ajouter 200 ml d’EDTA 0,5M pH 8,0, filtre stérile à travers un filtre de 0,2 mm.
Tampon FACS (PBS contenant 0,5 % de BSA, 2 mM d’EDTA et 0,02 % de NaN3)Dissoudre 250 mg de BSA dans 50 ml de PBS stérile et ajouter 200 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0 et 500 ml de 2 % de NaN3, filtre stérile à travers un filtre de 0,2 mm.
Solution saline (0,9 % de NaCl)Dissoudre 9 g de NaCl dans 1 000 ml de ddw, solution
NaCl à 0,2 %Dissoudre 2 g de NaCl dans 1 000 ml de ddw, solution
NaCl à 1,6 %Dissoudre 16 g de NaCl dans 1 000 ml de ddw, autoclave
2 % d’azoture desodium Dissoudre 1 g d’azoture de sodium dans 50 ml de ddw stérile, conserver à 4oC. Hautement toxique.
de thioglycolate à 3 %  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Dissoudre 3 g de poudre de thioglycolate dans 100 ml de jj.  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Faire bouillir jusqu’à ce que la solution devienne jaune et autoclave.
Solution de bleu de trypan (0,4 %)SigmaT8154Diluer 1:10 dans du PBS pour obtenir une solution à 0,04 %.
Trypsine solution B  ;Biological Industries, Beth HaEmek, Israël03-046-1
Zymosan A stérile 1 mg/ml Zymosan AResuspension 1 mg Zymosan A dans 1 ml de PBS stérile dans un tube Eppendorf. Agitez vigoureusement et incubez le tube à 37 oC pendant 30 min. Ne pas autoclave. Préparez la solution fraîchement avant de l’utiliser.
KITS
EasySep PE selectionkit STEMCELL Technologies18557
EasySep PE selection cocktail  ;STEMCELL Technologies18151
les nanoparticules magnétiques EasySep.STEMCELL Technologies18150
Anti-Ly6G souris MicroBead KitMiltenyi Biotec130-092-332
EasySep Kit d’enrichissement en neutrophiles de sourisSTEMCELL Technologies19762
EasySep Kit d’enrichissement en neutrophiles humainsSTEMCELL Technologies19257
FITC BrdUflow kit BD Pharmingen  ;
MACS Kit d’isolement des neutrophilesMiltenyi Biotec130-097-658
Kit de dosage de la phagocytose  ;Cayman Chemical Company  ;500290
ANTICORPS
bloquant le FcRBiolegend101302
Anticorps anti-Ly6G purifié contre le rat  ;BD Pharmingen  ;551459Clone 1A8
Anticorps anti-souris Ly6G de rat conjugué au PE  ;Biolegend127608Clone 1A8
FITC-conjugué rat anti-souris Ly6GBD Pharmingen  ;551460Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 anti-souris Ly6G  ;TONBO Biosciences65-1276Clone 1A8
violetFluor 450-conjugué rat anti-souris Ly6G  ;TONBO Biosciences75-1276Clone 1A8
RAT conjugué FITC anti-souris CD11bBD Pharmingen  ;553310Clone M1/70
anti-souris conjugué FITC Ly-6G et Ly-6C (GR-1)BD Pharmingen  ;553127Clone RB6-8C5
RAT CONJUGUÉ PE ANTI-SOURIS CD45BD Pharmingen  ;553081Clone 30-F11
FITC-conjugué rat anti-souris F4/80  ;Abcamab60343Clone BM8
souris conjuguée FITC anti-humaine CD66b  ;Biolegend305103Clone G10F5
Anticorps de contrôle des isotypes de rat purifié (IgG2a, k)  ;BD Pharmingen  ;553927 Clone R35-95
LEAF hamster arménien purifié anti-souris Anticorps CD3eBioLegend100314Clone 145-2C11
PLASTIQUE à Filtre à cellules " de BD stérile orbital Thermo Plus stérile de en autoclave de en autoclave Solution 559619

Références

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Isolement des neutrophilesgradient de densitneutrophiles entra n s par la tumeurneutrophiles de faible densitneutrophiles de haute densitcytom trie en fluxessai la lucif rasecytotoxicit cellulaireesp ces r actives de l oxyg necapacit phagocytaire
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