Les neutrophiles jouent un rôle important non seulement dans la défense de l’hôte contre les micro-organismes envahisseurs, mais sont également impliqués dans la surveillance immunitaire des cellules tumorales. Ici, nous décrivons des techniques liées à l’isolement de neutrophiles ayant des propriétés antitumorales et des méthodes de surveillance de la fonction antitumorale des neutrophiles in vitro et in vivo.
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Article de méthode
Isolement et caractérisation de neutrophiles avec des propriétés anti-tumorales
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les neutrophiles, les plus abondants de tous les globules blancs dans la circulation humaine, jouent un rôle important dans la défense de l'hôte contre les micro-organismes envahissants. De plus, les neutrophiles jouent un rôle central dans la surveillance immunitaire des cellules tumorales. Ils ont la capacité de reconnaître des cellules tumorales et induire la mort des cellules tumorales, soit par un mécanisme de contact cellule-dépendant impliquant le peroxyde d'hydrogène ou par cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Les neutrophiles ayant une activité anti-tumeur peut être isolé à partir du sang périphérique de patients atteints de cancer et des souris porteuses de tumeurs. Ces neutrophiles sont appelés neutrophiles tumorales entraînées (RTE) pour les distinguer des neutrophiles de sujets en bonne santé ou de souris naïves qui montrent pas d'activité cytotoxique significative de la tumeur. En comparaison avec d'autres globules blancs, des neutrophiles montrent flottabilité différente ce qui rend possible l'obtention d'un> 98% de la population de neutrophiles pur lorsqu'il est soumis à un gradient de densité. Cependant, en pluspour la population de neutrophiles à haute densité normale (HDN), chez les patients atteints de cancer, chez des souris porteuses de tumeurs, ainsi que dans des conditions inflammatoires chroniques, les populations de neutrophiles basse densité distincts (LDN) figurent dans la circulation. LDN co-purifient avec la fraction mononucléaire et peut être séparé à partir des cellules mononucléaires en utilisant soit des stratégies de sélection positive ou négative. Une fois que la pureté des neutrophiles isolés est déterminée par cytométrie de flux, ils peuvent être utilisés pour in vitro et in vivo des essais fonctionnels. Nous décrivons des techniques de surveillance de l'activité anti-tumorale de cellules neutrophiles, de leur capacité à migrer et à produire des espèces réactives de l'oxygène, ainsi que le suivi de leur capacité de phagocytose ex vivo. Nous décrivons en outre des techniques d'étiqueter les neutrophiles pour le suivi in vivo, et de déterminer leur capacité anti-métastatique in vivo. Toutes ces techniques sont essentielles pour comprendre comment obtenir et caractériser les neutrophiles avec anti-tumeurfonction.
Introduction
Les neutrophiles ont d’abord été caractérisés comme les cellules immunitaires innées qui servent de défense de première ligne contre les micro-organismes envahisseurs. Aujourd’hui, on sait que les neutrophiles ont des fonctions plus étendues, étant impliqués dans la montée de réponses immunitaires adaptatives contre les antigènes étrangers1,2, la régulation de l’hématopoïèse3, l’angiogenèse4 et la cicatrisation des plaies5. De plus, les neutrophiles peuvent affecter la croissance tumorale et la progression métastatique en raison de leurs activités pro- et anti-tumorales6,7. Les neutrophiles sont caractérisés par ....
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Protocole
Animaux : Des souris BALB/c âgées de 5 à 7 semaines sont achetées à Harlan (Israël). Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université hébraïque. Échantillons humains : La collecte de sang de patients atteints de cancer et de volontaires sains a été approuvée par le comité d’examen institutionnel (IRB) du centre médical Hadassah.
1. Induction de neutrophiles aux propriétés antitumorales in vivo à l’aide d’un modèle murin de cancer du sein.
REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées à l....
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Résultats
Dans une étude récente, nous avons identifié une fonction anti-métastatique pour les neutrophiles6. Les neutrophiles provenant de souris porteuses de tumeurs acquièrent un phénotype cytotoxique et ont la capacité de tuer les cellules tumorales6. Ceci contraste avec les neutrophiles provenant de souris naïves, qui n'ont aucun effet anti-tumoral significatif6. Plusieurs des techniques décrites dans la section Protocole ont été utilisées pour étudier la fonction des neutrophiles anti-tumorau.......
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Discussion
Les neutrophiles sont les plus abondants de tous les globules blancs et sont les premiers intervenants en cas d’infection et d’inflammation. En tant que tels, ils sont très sensibles aux signaux externes et sont facilement activés. De plus, les neutrophiles ont une demi-vie très courte et un renouvellement rapide. L’ensemble de ces caractéristiques soulève plusieurs difficultés dans le travail avec les neutrophiles, de sorte que des stratégies expérimentales uniques sont nécessaires. Par exemple, il existe plusieurs stra.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
ZG est soutenu par des subventions du programme I-CORE de la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 41/11), de la Fondation Abisch-Frenkel, du Rosetrees Trust, de la Fondation israélienne pour la recherche sur le cancer (ICRF - Research Career Development Award) et de la fondation CONCERN. ZGF est soutenu par des subventions de la Fondation israélienne pour la recherche sur le cancer (ICRF - Research Career Development Award), du scientifique en chef du ministère israélien de la Santé et de l’Association pulmonaire d’Israël.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| LIGNÉES CELLULAIRES | |||
| Souris 4T1 cellules de carcinome du sein | ADCC | CRL-2539 | Milieu de croissance : DMEM + 10 % FBS INACTIVÉ PAR LA CHALEUR |
| ARTICLES ET ÉQUIPEMENTS EN | |||
| 24 puits Plaque de culture tissulaire ; | Falcon | 353047 | Plaque de culture tissulaire stérile |
| de 100 mm ; | Corning | 430167 | Stérile |
| 25 cm2 Flacon de culture tissulaire | Nunc | 156340 | |
| Stérile 90 mm Plat de culture bactérienne ; | Miniplast, Ein Shemer, Israël | 20090-01-017 | |
| Tube à centrifuger conique stérile de 15 ml ; | Miniplast, Ein Shemer, Israël | 835015-40-111 | Tube |
| centrifuger conique stérile stérile de 50 ml ; | Miniplast, Ein Shemer, Israël | 835050-21-111 | Faucon stérile |
| 12 x 75 mm Tube en polystyrène à fond rond. | Becton Dickinson | 352058 | |
| Plaque de migration stérile Millicell 24 avec une taille de pores de 5&mu ; m ; | Merck Millipore | PSMT010R1 | |
| Assiette stérile à fond plat blanc 96 | Costar | 3917 | stériles |
| (40 mm) ; | BD Falcon | 352340 | Aiguille stérile |
| 20G x 1,5 | BD Microlance 3 ; | 301300 | Aiguille stérile |
| 23G x 1" | BD Microlance 4 | 300800 | Aiguille stérile |
| 25G x 5/8" | BD Microlance 5 | 300600 | Seringue stérile |
| 0,3 ml avec aiguille 30G x 8 mm | Micro-Fine Plus Demi | 320829 | Clips stériles |
| de 9 mm. | BD, AutoClip ; | 427631 | Aimant EasySep stérile |
| STEMCELL Technologies | 18000 | ||
| MACS LS Colonne de séparation ; | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| Aimant séparateur MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Lame de verre de microscope. | Menzel-Glä ; ser Superfrost ; Agitateur | J1800AMNZ | |
| ; | Sky line, ELMI | S-3.02.10L | |
| Lecteur de plaques ; | TECAN | InfiniteF200Pro | |
| POUDRE | |||
| Albumine sérique bovine (BSA), fraction V | Sigma | A7906 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) ; | BD Pharmingen | 550891 | Stérile |
| CFSE (diacétate de 5-(et 6-)-carboxyfluorescéine, ester de succinimidyle) | Sondes moléculaires | C1157 | |
| Dextran T500 | Sigma | 31392 | |
| Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine ; | Sigma | H3149 | |
| Azoture de sodium (NaN3) | Sigma | S8032 | Hautement toxique, manipuler avec précaution |
| Poudre de thioglycolate ; | Difco | 225650 | |
| Zymosan A | Sigma | Z4250 | |
| MILIEUX ET SUPPLÉMENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Sigma | D5796 | Stérile |
| Opti-MEM® ; J’ai réduit le sérum moyen ; | Life Technologies | 31985062 | Stérile |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 moyen | Sigma | R8758 | |
| Sérum bovin fœtal stérile (FBS), inactivé par la chaleur | Sigma | F9665 | Stérile |
| L-Glutamine | Biological Industries, Beth HaEmek, Israël | 03-020-1A | |
| Pyruvate de sodium | Biological Industries, Beth HaEmek, Israël | 03-042-1B | |
| Pénicilline stérile Streptomycine x 1000 solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israël | 03-031-5 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) sans Mg2+ et Ca2+ ; | Biological Industries, Beth HaEmek, Israël | 02-023-1 | PBS |
| stérile x 10 sans Ca2+ et Mg2+. | Biological Industries, Beth HaEmek, Israël | 02-023-5A | Eau stérile |
| de qualité HPLC ; | J.T. Baker | 4218-03 | Autoclave |
| SOLUTIONS | |||
| ACK &ndash ; Technologies de la vie à l’ammonium-chlorure de potassium | A10492-01 | ||
| Solution de broméoxyuridine (BrdU) (10 mg/ml) dans du PBS | Dissoudre 10 mg de BrdU dans 1 ml de PBS et un filtre stérile. | ||
| CFSE, 5 mM dans du DMSO | Dissoudre 2,8 mg de CFSE dans 1 ml de DMSO. Répartir en aliquotes de 10 ml dans des tubes stériles de 200 ml et conserver dans l’obscurité à -20oC. | ||
| Solution d’éosine Y | Sigma | HT110-2-32 | |
| Solution saline équilibrée de Hanks | Biological Industries, Beth HaEmek, Israël | 02-016-1A | |
| Héparine stérile, 20 mg/ml dans du PBS | Dissoudre 100 mg d’héparine dans 5 ml de PBS stérile, et filtrer stérile à travers un filtre de 0,2 mm. ; | ||
| Histopaque-1119 ; | Sigma | 11191 | Filtre stérile à travers un filtre de 0,2 mm. |
| Histopaque-1077 ; | Sigma | 10771 | Filtre stérile à travers un filtre de 0,2 mm. |
| Tampon de lyse de culture cellulaire luciférase x5 | Promega | E153A | Diluer 1:5 dans de l’eau stérile juste avant utilisation. |
| Solution de dosage de la luciférase | Promega | E1501 | Contient de la poudre de substrat de dosage de la luciférase (E151A) et du tampon de dosage de la luciférase (E152A) |
| Solution d’hématoxyline de Mayer ; | Sigma | MHS-32 | |
| PBS + 0,5 % BSA | Dissoudre 2,5 g BSA dans 500 ml de PBS, et filtrer stérilement à travers un filtre de 0,2 mm. | ||
| PBS + 1 % BSA | Dissoudre 1g BSA dans 100 ml de PBS, et filtrer stérilement à travers un filtre de 0,2 mm. | ||
| Dissoudre 12,5 g de BSA dans un mélange de 250 ml d’eau stérile de qualité HPLC et de 250 ml de PBSx10, et filtrer stérilement à travers un filtre de 0,2 mm. | |||
| PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA | Dissoudre 250 mg de BSA dans 50 ml de PBS stérile et ajouter 200 ml d’EDTA 0,5M pH 8,0, filtre stérile à travers un filtre de 0,2 mm. | ||
| Tampon FACS (PBS contenant 0,5 % de BSA, 2 mM d’EDTA et 0,02 % de NaN3) | Dissoudre 250 mg de BSA dans 50 ml de PBS stérile et ajouter 200 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0 et 500 ml de 2 % de NaN3, filtre stérile à travers un filtre de 0,2 mm. | ||
| Solution saline (0,9 % de NaCl) | Dissoudre 9 g de NaCl dans 1 000 ml de ddw, solution | ||
| NaCl à 0,2 % | Dissoudre 2 g de NaCl dans 1 000 ml de ddw, solution | ||
| NaCl à 1,6 % | Dissoudre 16 g de NaCl dans 1 000 ml de ddw, autoclave | ||
| 2 % d’azoture de | sodium Dissoudre 1 g d’azoture de sodium dans 50 ml de ddw stérile, conserver à 4oC. Hautement toxique. | ||
| de thioglycolate à 3 % | ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; Dissoudre 3 g de poudre de thioglycolate dans 100 ml de jj. ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; Faire bouillir jusqu’à ce que la solution devienne jaune et autoclave. | ||
| Solution de bleu de trypan (0,4 %) | Sigma | T8154 | Diluer 1:10 dans du PBS pour obtenir une solution à 0,04 %. |
| Trypsine solution B ; | Biological Industries, Beth HaEmek, Israël | 03-046-1 | |
| Zymosan A stérile 1 mg/ml Zymosan A | Resuspension 1 mg Zymosan A dans 1 ml de PBS stérile dans un tube Eppendorf. Agitez vigoureusement et incubez le tube à 37 oC pendant 30 min. Ne pas autoclave. Préparez la solution fraîchement avant de l’utiliser. | ||
| KITS | |||
| EasySep PE selection | kit STEMCELL Technologies | 18557 | |
| EasySep PE selection cocktail ; | STEMCELL Technologies | 18151 | |
| les nanoparticules magnétiques EasySep. | STEMCELL Technologies | 18150 | |
| Anti-Ly6G souris MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-332 | |
| EasySep Kit d’enrichissement en neutrophiles de souris | STEMCELL Technologies | 19762 | |
| EasySep Kit d’enrichissement en neutrophiles humains | STEMCELL Technologies | 19257 | |
| FITC BrdU | flow kit BD Pharmingen ; | ||
| MACS Kit d’isolement des neutrophiles | Miltenyi Biotec | 130-097-658 | |
| Kit de dosage de la phagocytose ; | Cayman Chemical Company ; | 500290 | |
| ANTICORPS | |||
| bloquant le FcR | Biolegend | 101302 | |
| Anticorps anti-Ly6G purifié contre le rat ; | BD Pharmingen ; | 551459 | Clone 1A8 |
| Anticorps anti-souris Ly6G de rat conjugué au PE ; | Biolegend | 127608 | Clone 1A8 |
| FITC-conjugué rat anti-souris Ly6G | BD Pharmingen ; | 551460 | Clone 1A8 |
| PerCP-Cy5.5 anti-souris Ly6G ; | TONBO Biosciences | 65-1276 | Clone 1A8 |
| violetFluor 450-conjugué rat anti-souris Ly6G ; | TONBO Biosciences | 75-1276 | Clone 1A8 |
| RAT conjugué FITC anti-souris CD11b | BD Pharmingen ; | 553310 | Clone M1/70 |
| anti-souris conjugué FITC Ly-6G et Ly-6C (GR-1) | BD Pharmingen ; | 553127 | Clone RB6-8C5 |
| RAT CONJUGUÉ PE ANTI-SOURIS CD45 | BD Pharmingen ; | 553081 | Clone 30-F11 |
| FITC-conjugué rat anti-souris F4/80 ; | Abcam | ab60343 | Clone BM8 |
| souris conjuguée FITC anti-humaine CD66b ; | Biolegend | 305103 | Clone G10F5 |
| Anticorps de contrôle des isotypes de rat purifié (IgG2a, k) ; | BD Pharmingen ; | 553927 Clone R35-95 | |
| LEAF hamster arménien purifié anti-souris Anticorps CD3e | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11 |
Références
- Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immun....
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Réimpressions et autorisations
