Cardiac pression-volume Analyse boucle aide de la conductance cathéters chez la souris

Résumé

L’analyse de la boucle pression-volume cardiaque est le moyen le plus complet de mesurer la fonction cardiaque dans le cœur intact. Nous décrivons une technique pour effectuer et analyser des boucles de volume de pression cardiaque, à l’aide de cathéters à conductance.

Résumé

L’analyse de la boucle de pression cardiaque est la « référence absolue » dans l’évaluation des mesures dépendantes de la charge et indépendantes de la charge de la fonction systolique et diastolique ventriculaire. Les mesures de la contractilité ventriculaire et de la compliance sont obtenues par l’examen de la réponse cardiaque aux changements de postcharge et de précharge. Ces techniques ont été développées à l’origine il y a près de trois décennies pour mesurer la fonction cardiaque chez les grands mammifères et les humains. L’application de ces analyses à de petits mammifères, tels que les souris, a été réalisée grâce à l’optimisation des techniques microchirurgicales et à la création de cathéters de conductance. Les cathéters à conductance permettent d’estimer le pool sanguin en exploitant la relation entre la conductance électrique et le volume. Lorsqu’elles sont correctement exécutées, ces techniques permettent de tester la fonction cardiaque dans des modèles de souris mutantes génétiques ou dans des études de traitement médicamenteux. L’exactitude et la précision de ces études dépendent d’une attention particulière portée à l’étalonnage des instruments, à la réalisation systématique de mesures hémodynamiques et à l’analyse des données. Nous passerons en revue les méthodes de réalisation d’expériences de boucle pression-volume à l’aide d’un cathéter de conductance chez la souris.

Introduction

Cardiac analyse de la boucle pression-volume fournit des informations détaillées de la fonction cardiaque et sont l'étalon-or pour l'évaluation fonctionnelle ^1. Bien que les techniques d'imagerie telles que l'échographie ou l'IRM cardiaque fournissent des mesures fonctionnelles, ces mesures sont très dépendants des conditions de chargement. Mesures d'indépendant de la charge de la contractilité cardiaque et la relaxation exigent des mesures dynamiques de la pression ventriculaire et la relation de volume sur une plage de précharge et la postcharge. Cette compréhension de la relation pression-volume provient du travail de pionnier de Sagawa et ses collègues ^2,3. Ils ont démontré ex vivo coeurs canins perfusés que les dérivés mesures de contractilité de boucle pression-volume étaient indépendants des conditions de chargement ^4.

En application de ces analyses in vivo n'a été rendu possible par le développement de cathéters de conductance dans les années 1980. Ce progrès technique a permis Kass et collègues pour effectuer pression-volume analyse en boucle chez les humains ^5,6. La miniaturisation des cathéters et des améliorations dans les techniques chirurgicales conductance à la fin des années 1990, a fait ^sept analyse de la fonction cardiaque de rongeur possible, ce qui permet pour les études génétiques et pharmacologiques à effectuer. Cette avance a depuis conduit à l'utilisation généralisée de l'analyse de la boucle pression-volume et a suscité beaucoup de perspicacité dans la physiologie cardiaque des mammifères.

Un concept clé dans l'utilisation de cathéters de conductance et l'interprétation des données obtenues à partir de ce est la relation entre le volume et la conductance. La conductance est inversement proportionnelle à la tension, qui est mesurée en utilisant un cathéter avec des électrodes placées de manière proximale, habituellement placés au-dessous de la valve aortique, et distalement, au sommet LV ^8. Changements de la tension ou de la conductivité sont mesurés par les variations du courant qui en découlent proximale à l'électrode distale. Bien que la piscine de sang contribuents de manière significative à la conductance, la contribution de la paroi ventriculaire, appelée la conductance parallèle (V _p), de la conductance mesurée doit être soustraite pour obtenir des mesures de volume de LV absolus.

Les méthodes pour effectuer cette correction, appelé un étalonnage de solution saline, sont discutés dans le protocole ci-dessous. La relation mathématique entre la conductance et le volume, décrit par Baan et ses collègues, est que le volume = 1 / α; (ρ ^L 2) (GG _p), où α = champ uniforme facteur de correction, ρ = résistivité du sang, L = distance entre les électrodes, G = conductance G et _{p =} conductance non-sang ^neuf. Il faut noter que le champ uniforme facteur de correction en se rapproche de 1,0 souris en raison du faible volume de la chambre ^10. Couplé avec des transducteurs de pression, le cathéter à conductance fournit des données de pression et de volume simultanée en temps réel.

PRESSU cardiaquere volume analyse présente des avantages particuliers sur les autres mesures de la fonction cardiaque, car ils permettent la mesure de la fonction ventriculaire indépendante des conditions de charge et de la fréquence cardiaque. Indices spécifiques indépendants de la charge cardiaques de la contractilité comprennent: en fin de systole relation pression-volume (ESPVR), d P / d _t max relation de volume -end-diastolique, élastance maximale (E _max) et de la précharge du travail systolique recrutable (PRSW). Une mesure de la fonction diastolique indépendant de la charge est le rapport de volume de fin de diastole de pression (EDPVR) ^11. Le protocole décrit le déroulement de l'analyse cardiaque en boucle pression-volume, en utilisant à la fois une carotide et une approche apicale. Bien que la méthodologie pour effectuer ces études ont été décrites en détail précédemment ^8,11, nous passerons en revue les principales étapes pour obtenir des mesures de pression-volume précis, y compris à la fois la correction de solution saline et l'étalonnage de la cuvette, et de fournir une démonstration visuelle de Thesles procédures de e. Recherche sur des animaux effectués pour cette étude a été gérée selon des protocoles approuvés et aux règles de protection des animaux du comité soin et l'utilisation des animaux institutionnel de Duke University Medical Center.

Protocole

1. Préparation de la conductance cathéter et étalonnage de pression

1. Connecter conductance cathéter au module de cathéter hémodynamique. Calibrer électroniquement mesures de pression et de volume en enregistrant pression préréglée et le volume réglé sur le module de cathéter. Enregistrer un tracé de 0 mm Hg et 25 mm Hg (figure 1A) et attribuer des tensions aux deux tracés de pression (figure 1B et 1C). De même, enregistrer un tracé de volume de 5 RVU et 25 RVU (figure 1D) et attribuer des tensions aux deux tracés de volume (de 1e et 1f).
2. Confirmez l'étalonnage de pression électronique avec un calibrage manuel de pression, à l'aide d'un sphygmomanomètre à colonne de mercure. Monter le port tensiomètre brassard avec un robinet 3 voies. Remplir un système de valve hémostatique 3-port, souvent utilisé pour l'angioplastie coronarienne, avec de l'eau en utilisant la RT orifice latéral.
   1. Placez l'extrémité d'un cathéter de conductance dans la valve hémostatique rempli de fluide et fixer doucement l'esprithout vriller cathéter. Branchez la valve hémostatique à l'tensiomètre et gonfler à 200 mmHg et verrouiller robinet à 3 voies. Examiner si la pression mesurée correspond à la pression gonflé sur le tensiomètre.
3. Lieu cathéter dans une solution saline chauffée à 37 ° C qui est au niveau de la pression de champ opératoire et à mesurer. Réglez le contrôle de la pression jusqu'à ce que les pressions enregistrées est à zéro.

2. Anesthésie / intubation

1. Administrer la kétamine / xylazine (80-100 / 10 mg kg ^-1) comme une injection intrapéritonéale.
   Remarque: Les agents anesthésiques alternatifs peuvent être utilisés. Une liste complète des anesthésiques sont fournis dans les commentaires précédents de cette technique ^11,12. Anesthésie adéquate peut être confirmée par douce pincement de la queue.
2. Une fois anesthésié, de se raser le cou et la poitrine avec les tondeuses et place sur un coussin chauffant. Maintenir la température rectale de la souris à 36,5 à 37,5 ° C. La température du corps Lowse traduira par des taux cardiaques déprimés. Appliquer une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse
3. Faire une incision médiane dans le cou et de disséquer les muscles de la trachée pour exposer la trachée. Placer une sonde endotrachéale par la bouche, tout en visualisant la trachée pour assurer l'intubation, et se connecter à l'appareil respiratoire.
4. Maintenir la souris sur le ventilateur pendant la procédure. Les réglages du ventilateur réglée sur la base du poids de l'animal comme décrit précédemment ^11. Volume courant (ml) = 6,2 x (poids de l'animal en kilogrammes) et la fréquence respiratoire ^1.01 = 53,5 x (poids de l'animal en kilogrammes) ^-0.26.

3. Mise en place de la conductance cathéter dans la chambre LV

1. Approche de la carotide
   1. Pour assurer la stérilité, deux ensembles d'instruments chirurgicaux stériles sont utilisé- un pour incision cutanée initiale et un à opérer dans la thoracotomie. Les instruments doivent être décontaminés à l'aide d'un stérilisateur à sec entre les animaux au cours d'une session individuelle chirurgicale unee autoclave à la fin de chaque jour chirurgicale.
   2. Après la peau a été décontaminé avec trois cycles d'une chlorhexidine + alcool gommage de la peau (solution d'alcool / 70% de chlorhexidine 0,5%), faire une incision sur la carotide droite de la mandibule au sternum. Disséquer les tissus environnants pour exposer la carotide droite, et couper le nerf vague qui longe la carotide.
   3. Placez une suture de soie 6-0 stérile autour de l'extrémité distale (loin de la poitrine) de l'artère carotide, une cravate et sécurisé. Placer deux sutures supplémentaires sous l'extrémité proximale de l'artère carotide (plus près de la poitrine) pour le premier fil de suture, la suture attachant lâchement milieu. Tirez doucement sur la suture proximale et sécuriser en le serrant à la peau. Assurez-vous que l'artère carotide a été serré à la fois proximale et distale avant de poursuivre.
   4. Faire une petite incision dans l'artère carotide R., proximale à la première suture, et prolonger longitudinalement vers la poitrine.
   5. Insérer la pointe conductance de cathéter,préalablement trempées dans l'eau chaude salée pendant 30 min, dans le récipient par l'incision et fixer le cathéter en utilisant la suture milieu.
   6. Avancer doucement le cathéter dans le ventricule gauche à travers la carotide, tout en regardant la boucle pression-volume traçage pour assurer le placement correct.
      Note: L'installation optimale du cathéter devrait donner boucles pression-volume qui apparaissent rectangulaire (voir figure 2). Si aucune résistance au passage du cathéter est rencontrée, tirez doucement en arrière et avancer de nouveau avec une légère pression. Une légère rotation du cathéter peut aider avec le placement dans le ventricule gauche. Forcer le cathéter de conductance peut entraîner des complications ou des dommages au cathéter cardiovasculaires graves.
   7. Base de registre pression-volume boucles ~ 10 min après la pose de cathéter et la réalisation d'un état ​​d'équilibre (Figure 2).
2. Approche apicale
   1. Dans une souris anesthésiée et ventilé, faire une incision from le processus de xiphoïde et couper à travers la paroi thoracique latéralement jusqu'à ce que la membrane est visible.
   2. Couper si le diaphragme et visualiser l'apex du cœur.
   3. Insérer le cathéter de conductance dans l'apex du ventricule gauche à travers une aiguille blessure par arme blanche (en utilisant une aiguille de 25 à 30 G), jusqu'à ce que l'électrode proximale est juste à l'intérieur du ventricule.
   4. Base de registre pression-volume boucles ~ 10 min après la pose de cathéter et la réalisation d'un état d'équilibre.

4. variant Postcharge Utilisation transitoire Occlusion aortique

1. Pour effectuer une occlusion aortique transitoire, faire une petite incision horizontale dans la partie supérieure du thorax et de disséquer les tissus environnants pour exposer l'aorte transversale.
2. Placer une ligature de soie 6-0 sous l'aorte transverse. Après boucles pression-volume sont retournés à la ligne de base, serrer les deux extrémités de la suture avec une pince d'aiguille, doucement et lentement augmenter la suture sur 1-2 secondes, puis relâchez lentement la tension.
3. Répétez cette procédure jusqu'à trois enregistrements distincts optimales sont fabriqués à partir du même animal.
   Remarque: Optimal enregistrements doivent avoir au moins 5 volumes de pression cycles de boucle et une augmentation constante des pressions systoliques finaux au cours de l'application d'une tension sur le fil de suture (figure 3A et 3C).

5. variant précharge Utilisation transitoire veine cave inférieure Occlusion (IVC)

1. Pour effectuer transitoire veine cave inférieure occlusion, faire une incision horizontale en dessous de la pointe du sternum, sous le diaphragme pour exposer la VCI.
2. Placez une ligature 6-0 de soie sous le IVC. Après boucles pression-volume sont retournés à la ligne de base, serrer les deux extrémités de la suture avec une pince d'aiguille; doucement et lentement augmenter la suture sur 1-2 secondes, puis relâchez lentement la tension. IVC occlusion peut également être effectuée par l'application en douceur de la pression aide d'un coton-tige pointe.
3. Répétez cette procédure jusqu'à trois enregistrements distincts sont optimales made du même animal.
   Remarque: Optimal enregistrements doivent avoir au moins 5 volumes de pression cycles de boucle et une baisse constante des pressions ventriculaires gauche de fin de diastole lors de l'application de la tension sur le fil de suture (figure 4A et 4B).

6. Saline Calibration

1. A la fin de l'étude, une conductance parallèle (V _p) valeur peut être obtenir par injection d'un bolus de 10 pl d'une solution saline hypertonique (15%) dans l'animal à travers la veine jugulaire (figure 5A et 5B).
   Remarque: Ce bolus provoque une augmentation du volume apparent, sans modification de la pression. Ce changement apparent en volume est le résultat d'un changement dans le sang piscine conductance plutôt que due à une augmentation réelle du volume. Une baisse transitoire de la dP / _dt max peut être observé, comme une solution saline hypertonique a un effet inotrope négatif ^13. Le V _p calculé peut être entré dans le volume de pression logiciel d'analyse de boucle le longavec les paramètres d'étalonnage de la cuvette et à convertir les UVR en microlitres.

7. Cuvette Calibration

1. Pour effectuer un étalonnage de la cuvette, placer une cuvette avec des puits de diamètres connus fournis par le fabricant sur un coussin chauffant ou un bain d'eau chauffée à 37 ºC. Remplissez les 4-5 premiers trous avec sang héparine chaud frais de souris l'objet d'évaluations hémodynamiques.
   Remarque: une cuvette de calibrage permet une évaluation précise de pool sanguin du ventricule gauche en utilisant le sang de souris et permet la conversion de données de volume de UVR à microlitres.
2. Insérer le cathéter de la conductance dans le premier puits, jusqu'à ce que toutes les électrodes sont immergées. Déplacez doucement le cathéter dans le puits, ce qui va générer RVUs variable.
3. Enregistrez les modifications de conductance dans le volume du canal dans RVUs. Sélectionnez la plus haute RVU pour l'étalonnage.
   Remarque: Le volume des puits peut être calculée soit par 1) en utilisant l'équation pour le volume d'un cylindre, où le rayon est celui du puits de cuve et la longueur est basée sur la longueur entre les deux électrodes de détection interne ou 2) la vérification dans les instructions du fabricant. La sortie de la conductance peut être corrélée avec les volumes connus pour développer une équation d'étalonnage qui convertit les données à partir de ¹¹ microlitres dans UVR.

8. euthanasie

1. À la conclusion du protocole, les souris sont euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie.
2. Afin d'assurer la mort, les souris ayant subi une dislocation cervicale doivent subir une méthode secondaire de l'euthanasie. Nous utilisons exsanguination sous anesthésie, avec la récolte du tissu cardiaque pour l'expérimentation, ou thoracotomie bilatérale sous anesthésie.

9. Analyse des données en utilisant un volume de pression boucle logiciel d'analyse

1. Calculer V _p de calibrage Saline
   1. Sélectionnez pression et volumoi boucles obtenu lors de l'éjection de solution saline hypertonique (figure 5A et 5B)
   2. Exporter boucles de logiciel d'analyse de volume de pression. Choisissez l'option pour l'étalonnage de Saline (Figure 5C)
   3. Enregistrez la valeur V _{de p} calculée (Figure 5D).
      Remarque: La valeur _{de p} de V est calculée en identifiant l'intersection du volume 1) Fin-diastolique vs le volume en fin de systole de l'étalonnage de la solution saline et 2) la ligne de volume volume = Fin-Fin systolique-diastolique. L'intersection de ces lignes offre la V _p, qui est calculée par le logiciel d'analyse de boucle de volume de pression.
2. Entrez la conductance au volume (ERF) relation dans les options de canal de volume (figure 1F)
3. Mesurer Baseline pression-volume relation de boucle
   1. Sélectionnez 8-10 cycles cardiaques provenant des canaux de pression et de volume une fois l'état d'équilibre a été atteint (figure 2A) et l'exportation à l'analyse douceWare. Identifier 5-6 boucles fin d'expiration (figure 2B)
   2. Utilisez la valeur _{de p} de V pour corriger la conductance parallèle. Choisissez l'option "Steady State" et de générer un tableau récapitulatif hémodynamique (figure 2C)
4. Mesure pression-volume Relation de boucle lors de constriction aortique
   1. Sélectionnez 8-10 cycles cardiaques provenant des canaux de pression et de volume qui correspondent à une constriction aortique avant l'augmentation des pressions de fin de diastole (figure 3A) et l'exportation vers des logiciels d'analyse. Identifier 5-6 boucles fin d'expiration (figure 3C)
   2. Sélectionnez l'analyse "contractilité" (figure 3B), qui calcule le volume de pression Relation en fin de systole (ESPVR)
5. Mesure pression-volume Relation de boucle pendant IVC constriction
   1. Sélectionnez 8-10 cycles cardiaques provenant des canaux de pression et de volume qui correspondent à IVC constriction (Figure 4A) et l'exportation de logiciels d'analyse. Identifier 5-6 boucles fin d'expiration (figure 4B)
   2. Sélectionnez l'analyse "contractilité" (figure 3B), qui calculera travail systolique recrutable précharge (PRSW) (figure 4C), dp / dt maximale vs EDV (figure 4D), ainsi que la ESPVR et la relation pression-volume télédiastolique (Figure 4E)

Résultats

Analyse en boucle pression-volume peut être utilisée pour mesurer la fonction cardiaque chez des souris génétiquement modifiées ou des souris subissant ^14,15 études sur les médicaments ^16. Représentant boucles de volume de pression sont prévus à partir de travaux déjà publiés ¹⁶ étudier l'effet de la ß-Arrestin biaisé ligand AT1R, TRV120023. Pour tester si TRV120023 affecte la fonction cardiaque in vivo, une analyse en boucle pression-volume a été effectuée sur des souris de typ...

Discussion

Nous décrivons une méthode pour perfoming analyse de la boucle pression-volume en utilisant un cathéter de conductance chez la souris, de tirer des analyses complètes des deux contractilité cardiaque et de détente. Suga, Sagawa et collègues utilisées pression-volume boucles de définir les mesures de contractilité cardiaque, en particulier la pente de la ESPVR, ou l'élastance télésystolique (E _s), et E _max. Élastance, défini par le rapport de la pression de volume (P / V), varie sur la durée de ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AnaSed (xylazine)  ;	Lloyd Laboratories	NADA n° 139-236	Anesthésique
Ketaset (kétamine)	Pfizer	440842	Anesthésique
VIP3000	Matrx Medical Inc.		Appareil d’anesthésie
Ventilateur	Appareil Harvard Modèle	683	Équipement chirurgical
Kit de tubes Appareil	Harvard	72-1049	Équipement chirurgical
Couverture homéothermique  ;	Kaz Inc.	5628	Matériel chirurgical
Stéréomicroscope	Carl Zeiss Optical Inc.	Stemi 2000	Equipement Chirurgical
Illuminator	Cole&ndash ; Parmer	41720	Matériel chirurgical
Dumont n° 55 Dumostar Forceps  ;	Fine Science Tools Inc	11295-51	Instruments chirurgicaux
Pince Graefe, courbées  ;	Fine Science Tools Inc	11052-10	Instruments chirurgicaux
Moria MC31 pinces  ;	Fine Science Tools Inc	11370-31	Instruments chirurgicaux
Ciseaux Mayo  ;	Fine Science Tools Inc	14512-15	Instruments chirurgicaux
Ciseaux à iris  ;	Fine Science Tools Inc	14041-10	Instruments chirurgicaux
Porte-aiguille Halsey  ;	Fine Science Tools Inc	12501-13	Instruments chirurgicaux
Olsen&ndash ; Porte-aiguille Hegar  ;	Fine Science Tools Inc	12002-12	Instruments chirurgicaux
ciseaux à ressort	Fine Science Tools Inc	15610-08	Instruments chirurgicaux
alèses jetables	Kendall/Tyco Healthcare	1038	Fournitures
chirurgicales Éponges de gaze stériles, stériles  ;	Dukal	62208	Surgical Supplies
Applicateurs à embout de coton, stériles  ;	Solon	368	Surgical Supplies
Suture chirurgicale, soie, 6-0	DemeTECH	FT-639-1	Fournitures chirurgicales
1 cc Seringues à insuline  ;	Becton Dickenson	329412	Fournitures chirurgicales
Access 9 Valve d’hémostase	Merit Medical  ;	MAP111	Équipement hémodynamique
Tensiomètre	Baumanomètre	320	Équipement hémodynamique
Système photovoltaïque Millar MPVS-300/400 ou MPVS Ultra (comprend une cuvette d’étalonnage)	ADInstruments Inc		Équipement hémodynamique
1.4F Cathéter à conductance  ;	ADInstruments Inc	SPR-839	Équipement hémodynamique
PowerLab 4/30 avec Chart Pro	ADInstruments Inc.	ML866/P	Logiciel hémodynamique
tondeuse pour animaux	Wahl	8787-450A	Divers
Tubes intradermiques PE-10	Becton Dickenson	427401	Divers
Tubes intradermiques PE-50	Becton Dickenson	427411
Divers Assortiment d’aiguilles (calibre 18, 25 et 30 ; Thomas Scientific)			Divers
0,9 % (poids/vol) injection de chlorure de sodium, USP)	Hospira	NDC no. 0409-4888-50
Divers Ruban			Divers
Alconox (Alconox Inc.) pour le nettoyage des cathéters	ADInstruments Inc.		divers