Article de méthode

Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches In Vitro Modèle du mur Airway

DOI :

10.3791/52986

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31 juillet 2015

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1Division of Drug Delivery and Tissue Engineering, University of Nottingham, 2Laboratory of Biophysics and Surface Analysis, School of Pharmacy, University of Nottingham, 3Division of Immunology and Allergy, School of Molecular Medical Sciences, University of Nottingham, 4Division of Respiratory Medicine, School of Clinical Sciences, University of Nottingham, 5NIHR Respiratory Biomedical Research Unit, University of Leicester, 6School of Sport, Exercise, and Health Sciences, Loughborough University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les progrès des technologies des biomatériaux permettent le développement de constructions tridimensionnelles de type multicellulaire. Nous avons développé des protocoles d’électrofilage pour produire trois échafaudages individuels afin de cultiver les principales cellules structurelles des voies respiratoires afin de fournir un modèle 3D in vitro de la paroi bronchiole des voies respiratoires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’électrofilage est une méthode hautement adaptable produisant des échafaudages fibreux poreux en 3D qui peuvent être exploités en culture cellulaire in vitro. Les modifications des paramètres intrinsèques du processus permettent un haut degré de contrôle sur les caractéristiques de l’échafaudage, notamment le diamètre, l’alignement et la porosité des fibres. En développant des échafaudages de dimensions et de topographies similaires à celles des matrices extracellulaires (MEC) spécifiques aux organes ou aux tissus, il est possible de créer des micro-environnements représentatifs de ceux auxquels les cellules sont exposées in situ. La paroi bronchiole des voies respiratoires, composée de trois micro-environnements principaux, a été sélectionnée comme tissu modèle. En utilisant l’ECM des voies respiratoires décellularisées comme guide, nous avons électrofilé le polymère non dégradable, le polyéthylène téréphtalate (PET), selon trois protocoles différents pour produire trois échafaudages électrofilés individuels optimisés pour la culture de cellules épithéliales, de fibroblastes ou de muscles lisses. À l’aide d’un système de bioréacteur disponible dans le commerce, nous avons co-cultivé de manière stable les trois types de cellules pour fournir un modèle in vitro de la paroi des voies respiratoires sur une longue période.

Ce modèle met en évidence le potentiel de l’utilisation de ces méthodes dans des études diagnostiques in vitro portant sur d’importants mécanismes de diaphonie intercellulaire ou évaluant de nouvelles cibles pharmaceutiques, en fournissant une plate-forme pertinente pour permettre la culture de cellules adultes entièrement différenciées dans des environnements 3D spécifiques aux tissus.

Introduction

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Le domaine de la médecine régénératrice et du génie tissulaire progresse rapidement, avec des percées dans la trachée et les reins régénération deux dernières réalisations notables. Les biomatériaux développés dans l'ingénierie tissulaire sont de plus en plus accessible, avec des possibilités de transfert de ces protocoles à des laboratoires moins spécialisés. Un domaine amorcée à bénéficier en augmentant l'utilisation de biomatériaux est de diagnostic in vitro.

Des études in vitro sont une plate-forme importante pour enquêter sur les voies de signalisation intracellulaires dans types de cellules simples, et ont contribué à délimiter les mécanismes sous-jacents de nombreux pathophysiologies de la maladie. Ces études reposent généralement sur un type de cellule unique en culture en monocouche sur plastique de culture de tissus (TCP); un (2D) de surface à deux dimensions beaucoup moins rigide et élastique poreux que les cellules (3D) de l'environnement en trois dimensions sont exposés à l'intérieur d'un tissu ou un organe. Des modèles animaux ont été traditionnellement employed pour confirmer les effets constatés in vitro aussi se traduire pour les tissus ensemble, et peut également être utilisé comme plate-forme pré-cliniques pour étudier les maladies humaines. Toutefois, les différences inter-espèces minent cette dépendance sur des modèles animaux dans notre compréhension des maladies humaines -. Par exemple, beaucoup de compréhension de l'asthme de la maladie du poumon est basée sur un modèle de souris malgré les différences inhérentes entre la condition humaine et ce modèle dont peu de preuves de l'infiltration des mastocytes du bon faisceau musculaire des voies respiratoires, ou la capacité de développement de la maladie spontanée au sein de l'animal modéliser 3,4. Il ya aussi des considérations éthiques relatives à l'utilisation de modèles animaux, avec la norme «3R» de «remplacement, raffinement, et la réduction" de l'expérimentation animale est encouragé au Royaume-Uni et d'autres pays.

Une alternative intéressante serait la récapitulation de tissus humains in vitro structure de créations pour enquêter sur la nature coopérative entre les types de cellules humaines adultes dans une seule unité. Les cellules existent dans des formes multi-cellulaires dans le tissu 3D, chacun dans un micro-environnement unique. La culture de cellules sur TCP permet seulement la culture de monocouches de cellules, incapables de reproduire cet environnement ou fournir la capacité de la culture à cellules multiples. Biomatériaux avancement fournit l'occasion de développer les deux plates-formes naturelles et synthétiques 3D pour la culture cellulaire. ECM décellularisé peut être utilisé pour la culture cellulaire 3D lorsque recellularized avec d'autres types cellulaires, notamment les cellules souches 1, cependant de tels protocoles peut être complexe et prendre du temps, de la disponibilité limitée de tissu et en grande partie d'origine non humaine. Autres protocoles permettent plus de contrôle sur les environnements cellulaires créées comme par nano-impression, le dépôt de l'ECM, les technologies de la feuille de cellule ou électrofilature. Électrofilage crée tapis poreux 3D non-tissé de fibres avec des diamètres allant de nanomètres à micromètre, replicating dimensions ECM naturelles. Échafaudages électrofilées sont de plus en plus utilisées comme plates-formes 3D de culture de cellules -. Manipulation des paramètres Électrofilage permet un contrôle plus complexe caractéristiques d'échafaudage tels que la taille des pores, le diamètre des fibres, de la topographie et de l'alignement, et la chimie de surface. On a montré que des altérations de ces paramètres à affecter directement l'adhésion cellulaire et de croissance, lorsque les cellules ont été cultivées de manière isolée.

Ces avantages ont été exploitées dans la présente étude pour permettre la mise en culture de plusieurs types de cellules comme une seule construction de tissu en 3D, en utilisant la bronchiole des voies aériennes en tant que structure de tissu 3D du modèle. La paroi des bronchioles se compose de trois régions principales (Figure 1). La muqueuse est où les cellules épithéliales des voies respiratoires sont assis à l'interface air-liquide (ALI), fournissant une barrière importante à l'environnement extérieur. Ils se trouvent sur la membrane réticulaire sous-sol (RBM), un ECM étroitement compact constitué principalement de collagen IV, perlecans et laminines. La couche de sous-muqueuse se trouve directement au-dessous de la muqueuse, une région plus poreuse composée de plusieurs types de cellules, y compris les fibroblastes, les myofibroblastes et les leucocytes infiltrants dans des conditions pathologiques. Enfin faisceaux de muscle lisse des voies aériennes enveloppent de façon hélicoïdale, et sont constitués de feuilles alignées de muscle lisse des voies aériennes (EAM). Il est l'état de contraction relative du muscle lisse des voies aériennes qui contrôle le ton. L'emploi d'échafaudages électrofilées dans le système pulmonaire avait jusqu'à récemment été limitée à des fins de régénération; avec un remplacement de la trachée électrofilé transplanté avec succès. Alors que réussie, ces traitements sont limités en nombre, et se concentrent sur la trachée en raison de la nature relativement simple de la fonction du tissu. Exemples limité de modèles des voies aériennes utilisées pour le diagnostic in vitro existent, et sont principalement axées sur des mesures de contraction du muscle lisse,. Le non-toxique et aucunen-dégradable polyéthylène polymère téréphtalate (PET) a déjà été électrofilées, et a été employé dans la présente étude pour assurer échafaudages produits pourraient être stockés pendant de longues périodes sans dégrader (leur permettant d'être utilisés "off the shelf"), et également convenir pour la culture cellulaire stable sur des périodes de temps prolongées. Des études antérieures de notre groupe ont montré que l'utilisation de trois variantes d'un protocole d'électrofilage de base, trois individuels échafaudages PET électrofilées peuvent être produites pour fournir topographies optimales pour épithéliales en culture des voies respiratoires, des fibroblastes et des cellules musculaires lisses dans l'isolement 21,22 et la co-culture de voies les cellules epitheliales et fibroblastes 22. Le diamètre des fibres a été trouvé à affecter considérablement la fonctionnalité épithéliale 22, et l'alignement des fibres a permis la génération de feuilles alignées de muscle lisse 21. Ces études ont été réalisées indépendamment l'une de l'autre dans des conditions statiques. Dans la présente étude, ces différeéchafaudages nt, contenant des cellules humaines adultes complètement différenciées ont été co-cultivées pendant une semaine à l'ALI dans un bioréacteur disponible dans le commerce comme une section 3D de la paroi des voies aériennes, fournissant un physiologiquement pertinente dans le modèle in vitro pour étudier les réponses des voies aériennes inter-cellulaires. Bien que ce protocole est d'utiliser la bronchiole des voies aériennes en tant que système modèle, il pourrait être adapté en tant que plate-forme pour la co-culture 3D de la muqueuse des unités provenant d'autres organes.

Protocole

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ASM cellules primaires de personnes non asthmatiques ont été isolés à partir de biopsies bronchiques à l'hôpital Glenfield (Leicester, Royaume-Uni) comme décrit précédemment. La recherche a été approuvé par le Comité d'éthique de Leicestershire et les patients ont donné leur consentement écrit et éclairé.

1. Électrofilage PET scellants (Figure 2)

  1. Préparer une solution (10 ml) de boisson de qualité de la bouteille PET dans un 1: 1 dichlorométhane (DCMro) - acide trifluoroacétique (TFA) solution. PET concentrations de 8%, 30% et 10% en poids / volume (poids / volume) sont nécessaires pour nanofibres, microfibre et alignés échafaudages respectivement, puis remuer la solution O / N à la température ambiante pour le PET se dissoudre.
  2. Transférer la solution PET dans une seringue et attacher un 23-G (pour nanofibres) ou un 18-G (pour microfibre et alignés) aiguille à la seringue et placer la seringue dans une pompe seringue motorisé. Assurez-vous que la pointe de l'aiguille est tourné vers le bas.
  3. Placez le mandrel 15 cm de la pointe de l'aiguille, assurant l'aiguille est dirigée vers le centre du tambour.
  4. Fixez la fourniture d'électricité à la pointe de l'aiguille avec pinces crocodile et la terre le mandrin (via la prise de banane) à la terre. Allumer l'alimentation du mandrin et vitesse réglée à 60 tours par minute (l'équivalent d'environ 13,2 m · min -1) pour nanofibres et microfibre échafaudages. Régler la vitesse de 2000 tours par minute (équivalent à environ 440 m · min -1) pour échafaudages alignés.
  5. Régler la pompe à seringue à un débit de 0,5 ml de flux · h -1 pour nanofibres échafaudages aléatoires et alignés ou 2,0 ml · h -1 pour les échafaudages en microfibres. Laisser la pompe fonctionner jusqu'à ce que la solution est extrudée à partir de la pointe de l'aiguille afin d'évacuer l'air dans l'aiguille. Puis arrêter la pompe.
  6. Sur la pompe seringue, réglez le volume total de la solution d'être expulsé à 2 ml et démarrer la pompe.
  7. Set tension d'alimentation 14 kV, et l'interrupteur sur le supp de puissanceLy.
  8. Electrospin jusqu'à 2 ml de solution a été électrofilées (4 h pour les nanofibres et échafaudages alignés, 1 heure pour les échafaudages en microfibres).
  9. Couper l'échafaudage avec une lame le long de la largeur du mandrin. On obtient ainsi une feuille 2D d'échafaudage de la taille de la zone de surface du mandrin (dans ce cas, une feuille rectangulaire de 22 cm x 11 cm) qui peut être soigneusement détaché du mandrin). Stocker l'échafaud dans une feuille d'aluminium pour réduire la charge électrostatique).
    Remarque: échafaudages biphasiques sont produites par électrofilage séquentielle un échafaudage de nanofibres directement sur un échafaudage en microfibre.

2. Stérilisation des échafaudages avant utilisation en culture cellulaire

  1. De la feuille d'échafaudage, punch out disques d'échafaudages biphasique ou alignés en utilisant un stylo de biopsie de 0,8 mm de diamètre et de s'y tenir joint à l'aide d'aquarium colle non toxique.
  2. Stériliser à l'aide d'échafaudages irradiation ultraviolette pendant 30 minutes de chaque côté de l'échafaudage avant trempage dans une 20% Vol / vol solution d'antibiotique / antifongique (2x10 5 unités ml -1 pénicilline G, 2.000 mg ml -1 sulfate de streptomycine et 500 pg ml -1 amphotéricine B) O / N à 4 ° C.
  3. Laver échafaudages avec PBS trois fois, puis échafaudages de magasins dans des plaques de TCP ainsi dans PBS à 4 ° C jusqu'à utilisation.

3. Constituants cellulaires Culture Media

  1. Culture CALU3 cellules épithéliales dans les médias DMEM-F12 complété avec du sérum de 10% vol / vol de veau foetal (FCS), solution à 2 nM L-glutamine, 1% vol / vol antibiotiques / solution antimycosique (10.000 unités ml -1 pénicilline G, 100 mg ml -1 sulfate de streptomycine et 25 pg ml -1 amphotéricine B).
  2. Culture de fibroblastes MRC5 et de cellules dans des milieux ASM DMEM supplémenté avec du sérum de 10% vol / vol de veau foetal (FCS), une solution 2 nM de L-glutamine, 1% vol / vol antibiotique / antimycotique solution (10 000 unités ml-1 de pénicilline G, une00 mg ml -1 sulfate de streptomycine et 25 pg ml -1 amphotéricine B).
  3. Culture cellule épithéliale-fibroblastes-ASM co-cultures dans un DMEM-F12 70:30: mélange des médias DMEM.

4. Ensemencement des fibroblastes et cellules épithéliales sur biphasique Échafaudages

  1. Dans une plaque de culture de tissu, faire tremper les échafaudages dans les médias DMEM-complétées et incuber à 37 ° C pendant 1 heure avant l'ensemencement des cellules.
  2. Retirez les médias DMEM-complétés, placer la phase de microfibre de échafaudage apicale et de semences 1.5 x10 4 MRC5 cellules de fibroblastes dans 30 pi de milieu DMEM-complétées. Agiter la plaque sur un agitateur orbital pendant 2 heures, avant de quitter dans un incubateur à 37 ° C 5% de CO 2 dans l'air O / N.
  3. Tournez sur l'échafaud si la phase de nanofibres d'échafaudage face apicale, semences 3.0 x10 4 CALU3 cellules épithéliales dans 30 pi de DMEM-F12 supplémenté médias sur la phase de nanofibres de l'échafaud et incuber for 2 h à 37 ° C, 5% CO 2 dans l'air avant l'immersion dans l'échafaud 70:30 DMEM-F12: DMEM supplémenté médias O / N avant le transfert dans le bioréacteur.

5. Ensemencement des cellules de l'ASM sur le alignés Échafaudages

  1. Dans une plaque de culture de tissu, faire tremper les échafaudages dans les médias DMEM-complétées et incuber pendant 1 heure à 37 ° C avant d'ensemencer 2,5 x10 4 cellules dans 30 ul de milieu DMEM-complétées et incubation pendant 2 heures (37 ° C, 5% CO 2 dans l'air). Immerger échafaudage en retour de milieu DMEM supplémenté dans l'incubateur et laisser O / N avant la mise en place d'un tri-culture dans le bioréacteur.

6. Mise en place du Tri-culture en utilisant le système de bioréacteur (Figure 7)

  1. Placez l'échafaud joint biphasique dans la rainure à l'intérieur une chambre avec la phase épithéliale vers le haut dans la chambre.
  2. Placer l'échafaudage alignée sous l'échafaud biphasique (de sorte qu'il est adjacent à la microfiber phase de l'échafaudage biphasique) et verrouiller les deux chambres du bioréacteur ensemble.
  3. Assembler deux circuits d'écoulement de perfusion reliés à deux réservoirs moyen (milieu DMEM-F12-complétés dans le réservoir apical, DMEM-F12 / milieu DMEM-additionné dans le réservoir de base) et des supports de pompage autour des deux circuits à environ 0,1 ml / min en utilisant une pompe péristaltique (40 ml médias sont recyclés à travers chaque circuit). Chambre toutes les parties du système intérieur d'un incubateur à 37 ° C, 5% CO 2 dans l'air.
  4. Après une semaine, retirez le support de la chambre apicale, et de la culture les cellules épithéliales de l'ILA pour une semaine de plus avant l'analyse.

Résultats

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images de microscopie électronique à balayage des tissus des voies respiratoires décellularisée ou images immunohistologiques partir de biopsies des voies respiratoires identifiés caractéristiques souhaitables de l'ECM des voies aériennes nous voulions introduire dans électrofilées topographies d'échafaudage: matrice maternelle RBM se compose de fibres d'environ 153 nm ± 30,6 nm (moyenne ± n = 50 mesures ) de diamètre (figure 3A et 5A), tandis que la matrice entourant la GAR est plus de nature poreuse (figure 3C). Sections immunohistologiques par faisceaux musculaires lisses montrent ASM présente comme feuilles alignées de cellules 21 (figure 3E). Cette information a été utilisée pour guider les caractéristiques introduites dans les échafaudages électrofilées. Un mandrin en rotation était capable de tourner de façon stable à des vitesses élevées (> 2000 tr / 440 m · min -1) pour produire des échafaudages avec des fibres alignées. La rotation du mandrin lente (60 tours de 13,2 m · min -1) n'a pas affecté l'orientation des fibres, Mais échafaudages avec une épaisseur plus uniforme que lorsque électrofilature sur une plaque statique produite. En modifiant les paramètres de électrofilage (PET de concentration et de taux d'écoulement de la solution), il a été possible de créer des échafaudages fibres d'un diamètre de plusieurs micromètres ou centaines de nanomètres (paramètres d'électrofilage sont indiqués dans le Tableau 1).

électrofilées fibres ayant des diamètres de fibres équivalentes à des fibres naturelles RBM (150 nm) ont été produites en utilisant une solution de PET de 6%, mais à des concentrations aussi faibles en PET, les fibres de perles sont produites (figure 4A). Cela a été éliminé par augmentation de la concentration de la solution PET à 8%, ce qui produit des nanofibres uniformes possédant un diamètre moyen de 255 nm ± 2,4 nm (moyenne ± SEM) et la taille moyenne de pores de 1,43 pm ± 0,02 um (figures 4B, 5A et B). Pour electrospin nanofibres il était nécessaire de réduire la taille de l'aiguille de 18 G à 23 G, permettant des débits plus lents whilst maintenir une vitesse d'écoulement supérieur et de réduire le blocage de l'aiguille, un problème récurrent avec l'aiguille plus grande. Lorsque électrofilature microfibres, une augmentation de la solution PET à> 30% de PET conduire à un manque d'uniformité dans le diamètre des fibres (Figure 4F) en plus de multiples blocages à la pointe de l'aiguille en raison de la viscosité élevée de la solution. Tapis de microfibres uniformes possédant un diamètre de fibre moyen de 2,50 pm ± 0,02 um (moyenne ± SEM) et la taille moyenne de pores de 10,45 pm ± 0,13 um ont été produites lorsque électrofilage d'une solution de PET en poids / vol de 30% à un débit de 2 ml / h de débit -1 (figures 4F, 5A et B). Électrofilature séquentielle de l'échafaud de nanofibres directement sur ​​un échafaudage en microfibre (encore attaché au mandrin) a créé un échafaudage biphasique (Figure 3D). Les diamètres de fibres moyenne était de 280 nm ± 20 nm et 2,30 um ± 0,06 um pour les nanofibres et microfibre phases respectivement,comparable à dimensions de nanofibres et microfibre échafaudages individuels. En outre, l'épaisseur de l'échafaudage biphasique a été similaire à la somme des nanofibres et des échafaudages microfibres individuelles (Figure 5C). Grâce à l'augmentation de la vitesse du mandrin (2000 rpm / 440 m · min -1), hautement alignées nano- ou microfibres échafaudages ont été produites. La solution à 8% de PET en poids / vol n'a pas été optimale pour produire des nanofibres alignées et fibres produites possédant une morphologie en forme d'onde (figure 3F). Une augmentation à 10% de PET annulé cet effet, mais encore abouti à un diamètre de fibre réduite (216 nm ± 2,2 nm (moyenne ± SEM)) par rapport aux échafaudages de nanofibres alignées au hasard. alignement de la fibre a été calculée en déterminant la déviation de l'angle de chaque fibre à partir de l'angle de fibre moyenne. Dans échafaudages de nanofibres alignées 79% de fibres ont été alignées (± 10 ° angle moyen de la fibre) comparativement à 10,2% de fibres dans aligné au hasard scaff de nanofibresolds (Figure 5D).

Le nanofibres échafaudage de 8% a été utilisé pour récapituler le RBM sur lequel résident les cellules épithéliales, et a été utilisé pour soutenir la culture de cellules de CALU3 (une voie aérienne cellules épithéliales en ligne). Le poids / volume microfibre échafaudage de 30%, étant plus poreux dans la nature a été utilisé pour simuler la région de la sous-muqueuse, et a été cultivé avec des cellules MRC5 (fibroblastes une cellule des voies aériennes de ligne). Les 10% en poids / volume nanofibres alignées échafaudage fourni référencement topologique pour assurer l'alignement des cellules de l'ASM lors de la culture sur l'échafaud. Les trois types de cellules ont montré une augmentation de la viabilité lorsqu'ils sont cultivés sur leurs échafaudages individuelles sur une période de 2 semaines (figure 6A), et a exprimé des protéines spécifiques de type cellulaire après la période de culture de 2 semaines (figure 6B, 6C, et 6D). Une caractérisation plus poussée des interactions individuelles cellulaire échafaudage ont été signalés ailleurs 21. Le électrofilature séquentielle de l'échafaud de nanofibressur l'échafaudage en microfibres réalisé respectivement un échafaudage biphasique pour la co-culture des cellules épithéliales CALU3 et des cellules de fibroblastes MRC5 sur les nanofibres et microfibres phases. La culture des deux cellules dans des conditions statiques ensemble a été rapporté ailleurs 22. D'autres travaux de tenter d'ajouter d'autres couches de cellules ou de prolonger le temps de culture biphasique delà de 2 semaines sous conditions statiques avérées infructueuses (données non présentées). Pour un modèle de culture à trois couches sur une longue période, on a utilisé un bioréacteur d'écoulement de perfusion. Le CALU3 et cellules MRC5 ont été ensemencées sur l'échafaudage biphasique, et les cellules ensemencées sur un ASM échafaud alignés, et les deux ont été cultivées séparément pendant 2 jours. Les deux échafaudages ont ensuite été achetées ensemble pour former un modèle à trois couches de la paroi des voies aériennes à l'intérieur du bioréacteur (Figure 7). Les deux chambres ont été perfusé avec les médias pendant 7 jours avant la chambre de l'épithélium apical avait ses médias enlevés, et les cellules épithéliales ont été cultivées à laALI pendant 7 jours. Les échafaudages ont été fixés et soit sectionnés et colorés, ou échafaudages entiers ont été immunocolorées pour les marqueurs spécifiques des cellules. Les articles à travers la culture tri-couche ont montré des noyaux de cellules distribuées à travers les trois couches de la co-culture (Figure 8B). Lorsque les cellules ont été immunocolorées pour des marqueurs spécifiques des cellules, les cellules épithéliales remplis de la phase de nanofibres apical comme une cellule-couche confluente et colorées positives pour la cytokératine (Figure 8C), la phase de microfibres, les fibroblastes colorées positives pour S100A4 (figure 8D), et sur les 10% de cellules échafaudage ASM alignés colorées positif pour SM22α (Figure 8E), indiquant une bonne survie de chaque type de cellule dans le modèle 3D de la paroi des voies aériennes.

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Figure 1. Le bronchiole des voies aériennes. Biopsie bronchique à partir d'une gravevoies aériennes asthmatiques montre l'épithélium sur la membrane réticulaire du sous-sol (RBM), avec la région de sous-muqueuse sous-jacente remplie avec des cellules mésenchymateuses, et les faisceaux de muscle lisse entourant peuplées avec des cellules de muscle lisse coloration des muscles lisses alpha-actine (brun). La barre d'échelle indique 200 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Un schéma de l'appareil d'électrofilage. Une seringue contenant la / solution de solvant du polymère (avec aiguille attachée) est placé sur une pompe à seringue en regard du mandrin. Un potentiel électrique est établi entre les fibres et le mandrin d'aiguille provoquant être éjectées à partir de la pointe d'aiguille et déposées sur le mandrin rotatif. Comme passe la fibre à travers l'atmosphère,l'évaporation du solvant provoquant le dépôt de fibres de polymère sur le mandrin. cliquez ici pour S'il vous plaît voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Comparaison des échafaudages électrofilées à l'ECM des voies respiratoires natif. Des images de microscope électronique à balayage de la membrane décellularisée du sous-sol (A), des voies respiratoires décellularisée bronchiole section (C) et une coupe histologique d'un bon faisceau musculaire des voies respiratoires (colorées à l'hématoxyline et de l'éosine, échelle bar 40 pm) (E) par rapport à nanofibres (B) biphasique (D) et (F) alignés échafaudages en PET. S'il vous plaît cliquer ici pour voirune version plus grande de cette figure.

Tableau 1. Paramètres utilisés pour électrofilature la microfibre, nanofibres et alignés échafaudages individuellement et pour l'échafaud biphasique.

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Figure 4. Modification des concentrations PET affecte les caractéristiques des fibres. Les images de microscopie électronique à balayage d'échafaudages électrofilées filées à partir de 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% et 35% (EG) (poids / volume) des solutions de PET . Également montré échafaudages sont alignés produites à partir de 8% (D) et 30% des solutions de PET (H) poids / VOL. AD imagée à 5000 x grossissement, EH imagé au 1,000X grossissement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.

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Figure 5. Propriétés de électrofilées échafaudages en PET. Courbes (A) de distribution montrant la distribution de diamètre des fibres de la membrane réticulaire sous-sol matrice extracellulaire (ECM RBM), alignés au hasard nano- et micro-fibres échafaudages, et l'échafaud de nanofibres alignées. (B) histogramme montrant la distribution relative de la taille des pores dans nano- et micro-fibres échafaudages. (C) de l'épaisseur moyenne des nanofibres, des échafaudages, microfibre biphasiques et alignés (moyenne ± écart-type, n = 6). (D) histogramme montrant l'écart par rapport à l'orientation des fibres moyenne dans les échafaudages de nanofibres aléatoires ou alignés analyse des fibres d'échafaudage a été réalisée en utilisant le logiciel ImageJ. Plouer cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6. La culture des types cellulaires individuels sur les échafaudages individuels. (A) des résultats d'analyse alamarBlue cellule de viabilité de cellules ASM sur échafaudages alignés, les cellules CALU3 sur des échafaudages de nanofibres et des cellules MRC5 sur des échafaudages en microfibres (moyenne ± SEM, n = 3 20). images de microscopie électronique à balayage de la nanofibre, microfibre et des échafaudages de fibres alignées (B, C et D respectivement) et des images immunofluorescence de cellules CALU3 colorées pour la E-cadhérine (rouge), MRC5 colorées pour vinculine (rouge) et les cellules ASM colorées pour SM22α (rouge) sur toute leur échafaud spécialisé (E, F et G respectivement). Hoechst a été utilisé pour colorer les noyaux (bleu), barre d'échelle indique 40 &# 181;. M S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 7. Système de perfusion pour les tri-couche modèle de paroi des voies aériennes. (A) Photographie de récipient bioréacteur relié à la pompe péristaltique et les réservoirs de médias 2x. (B) Schéma des échafaudages tri-couches. (C) Schéma des deux circuits de bioréacteurs lorsque le modèle de voies est maintenu à l'interface air-liquide. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 8. Complete 3D modèle de paroi des voies aériennes. (A) la biopsie bronchique de la paroi des voies aériennes avec la couche de muqueuse surlignés en rouge, la région de la sous-muqueuse surligné en vert, et le faisceau de muscle lisse souligné en or. (B) Section à travers la paroi des voies respiratoires tri-couches constitué d'échafaudages biphasique et alignés peuplées avec épithéliales, fibroblastes et les cellules musculaires lisses fixes après 2 semaines de co-culture. Les noyaux cellulaires ont été colorées avec du DAPI (bleu) avec échafaudage réflectance (gris) en même temps imagé. Les échafaudages ont également été fixés et immunocolorées pour les marqueurs spécifiques des cellules après 2 semaines, avec des cellules de CALU3 colorées pour cytokératine (vert) (C), les cellules MRC5 colorées pour S100A4 (vert) (D), et les cellules musculaires lisses colorées pour SM22α (rouge) ( E). La barre d'échelle indique 200 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Tableau 1.

Discussion

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La capacité de electrospin fibres polymères ayant des propriétés structurales comparables à ECM naturel a conduit à de nombreux polymères naturels ou synthétiques, ou des mélanges de polymères étant électrofilé à recréer ces environnements,. La manipulation des paramètres du processus (y compris le choix de polymère, la concentration de polymère, solvant, la distance de la pointe de l'aiguille et de la température) peuvent toutes les caractéristiques influence d'échafaudage; certains paramètres peuvent cependant avoir un plus grand impact sur ​​les propriétés d'échafaudage que d'autres 25,. Lors de la modification diamètre des fibres PET, on a trouvé des paramètres clés de la concentration du polymère utilisé, la vitesse à laquelle la solution de polymère était électrofilé, et le diamètre de l'aiguille. Lorsque électrofilature fibres alignées les paramètres clés sont la méthode de collecte utilisé (un mandrin en rotation), et la vitesse à laquelle les de mandrin tourne. Grâce à la réduction de la vitesse de mandrin à 60 tours par minute, nous avons trouvé les échafaudages alignés au hasard produits ont montré une plus grande échafaudage uniconformité par rapport à électrofilature sur une plaque de collecteur plat.

Les caractéristiques des tissus des voies respiratoires décellularisée ont été analysés pour donner des conseils pour les différentes topographies d'échafaudage développés pour la culture de chaque type de cellule des voies aériennes. nanofibres de électrofilées sont un échafaudage attrayante à reproduire les structures de la membrane basale en raison de la petite taille des pores, mais porosité globale élevée qui permet une diffusion accrue de métabolite tout en restreignant le mouvement cellulaire. 9 tout en optimisant les paramètres de électrofilage, une gamme de concentrations en PET et les débits ont été testés. Les fibres les plus minces ont été obtenus en utilisant une solution en poids / volume de PET de 6%, déjà utilisée par d'autres groupes. Cependant, les niveaux élevés de perles, et un manque d'uniformité des problèmes constants. Les tentatives initiales pour enlever le bourrelet comprenaient l'addition d'un tensioactif cationique, le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), à la solution pour abaisser la tension de surface, et de tester diverses sourcesde PET. L'ajout de tensioactif réduit la quantité de perles, mais pas entièrement. Après avoir essayé un certain nombre de sources commerciales de granulés de PET, boisson de qualité alimentaire bouteille PET a été utilisé, en découpant des bouteilles de boisson et la dissolution de ceux-ci dans le DCM: solution de solvant TFA. L'utilisation de ce que la source PET a donné lieu à une augmentation de l'uniformité de la fibre et une réduction des perles de fibres. En augmentant la concentration de la solution légèrement à 8% en poids / volume et en réduisant le diamètre de l'aiguille (18G à 23G), nous avons produit constamment des nanofibres sans défaut avec un diamètre de fibre d'environ 250 nm. Échafaudages de nanofibres électrofilées peuvent être très électrostatique lors de la collecte du mandrin faisant la manutention manuelle des échafaudages difficiles. Cela a été améliorée par le stockage des échafaudages dans une feuille d'aluminium après le filage et le trempage dans 70% IMS avant utilisation. Cela semble pour aider à dissiper la charge électrostatique résiduelle sur l'échafaud du processus d'électrofilage.

Pour fournir topographies similaire aux micro-environnements particuliers rencontrés par les trois principaux types de cellules des voies respiratoires au sein de la paroi des voies aériennes, un protocole d'électrofilage de base a été conçu pour produire trois échafaudages uniques pour ces types de cellules: par électrofilage une solution à faible concentration en PET lentement, nanofibres alignées au hasard ont été générées, sur lequel les cellules épithéliales ont été ensemencées (mimant la GAR). Par électrofilage d'une solution de concentration plus élevé PET à un rythme plus rapide, des microfibres alignées au hasard ont été générées (production d'un échafaudage poreux plus), dans lequel des fibroblastes ont été ensemencés (mimant immédiatement la zone de sous-muqueuse sous la GAR). Par électrofilage d'une solution à faible concentration de PET sur un mandrin en rotation à grande vitesse des nanofibres alignées ont été produites, sur laquelle les cellules musculaires lisses orientées dans la direction des fibres, la production de feuilles de cellules alignées.

L'augmentation des diamètres des fibres conduisent à une augmentation de la taille des pores, ce qui permet une plus grande penetratio cellulairen en échafaudages et ainsi aider à créer un véritable environnement 3D,. échafaudages en microfibres ont été utilisées pour la culture de fibroblastes dans l'étude pour s'assurer que les cellules résidaient sur plusieurs plans au sein de l'échafaudage. En augmentant la concentration de PET à 30% en poids / volume, de fibres de PET ayant un diamètre moyen de 2,5 um ont été produites. Fibres de plus de diamètre (≈ 4 pm) ont été produites en utilisant une solution à 35% de PET en poids / vol, mais l'épaisseur de l'uniformité échafaudage a été perdu, et une plus grande variabilité entre les fibres individuelles était apparente. Pores à l'échafaud en microfibre étaient plus de 7 fois supérieures à celles mesurées dans les échafaudages de nanofibres (10,45 vs 1,43 um um respectivement), mais toujours statique ensemencement des cellules fournies pénétration cellulaire limitée. Cela a été amélioré de façon dynamique en ensemençant les cellules en utilisant un agitateur orbital, un procédé révélé efficace précédemment.

Échafaudages de nanofibres hautement alignées ont été créés par électrofilage 10%poids / solution de PET de vol sur le mandrin tournant à 2000 rpm (≈ 440 m · min -1). La concentration PET a augmenté de 8% pour éviter une morphologie en forme d'onde irrégulière que les fibres exposées à des concentrations inférieures. Malgré l'augmentation de la concentration, en alignant les fibres réduit le diamètre moyen de la fibre (216 nm contre 255 nm, aligné contre aléatoire). La grande vitesse de l'étirage des fibres avant qu'elles ont séché mandrin est susceptible de provoquer cet effet. L'alignement des fibres influencé l'alignement des cellules ASM, et a aussi d'autres effets physiologiques sur les cellules de l'ASM qui ont été caractérisées ailleurs 21.

La principale limitation de ce protocole est l'incapacité de cellules vivantes d'image sur / dans les échafaudages faisant adhérence cellulaire ou la différenciation initiale sur une période de temps prolongée impossible de déterminer sans sacrifier échantillons. Cela signifie plus d'optimisation survient après la période de culture, à savoir, fixertion des échantillons et en mesurant ensuite si la culture cellulaire a été un succès après pas au cours de la culture cellulaire. L'observation d'un changement de couleur dans les échafaudages incubés dans alamarBlue (bleu à rose) indique cellules sont présentes et viable, mais est pas idéal. Électrofilage plusieurs polymères transparents, tels que la gélatine pourraient aider à visualiser les cellules sur les échafaudages. L'électrofilage d'un échafaudage à l'intérieur de nanofibrous notre modèle a permis à la réplication de la GAR des voies respiratoires, de manière similaire constituée de nanofibres denses sur lequel résident les cellules épithéliales. Il a été montré précédemment que les cellules de structure ne peut pas migrer à travers l'échafaudage de nanofibres 22, bien que des cellules immunes sont capables de (données non présentées). Bien avantageux pour la culture de types de cellules spécifiques sur une surface 3D (tels que cellules epitheliales et endotheliales), cette prévention de la migration des cellules de structure à travers les nanofibres peuvent être nuisibles pour la culture d'autres types de cellules. Comme le muscle lisse est incapable de migrer à travers ee nanofibres alignées échafaud on assemble la coculture de trois couches avec le muscle lisse et des couches de fibroblastes face de l'autre (par opposition à l'échafaud alignés séparant les deux types de cellules). Bien que cela permet aux cellules d'être en apposition proche, l'étude actuelle ne peut pas déterminer si un type de cellule (que ce soit le muscle lisse ou de fibroblastes) dépasserait la totalité de la couche au cours d'une période de culture plus longue. En dépit de ces limitations, un modèle tri-couche viable de la paroi des voies aériennes a été développé qui fournit une plate-forme alternative pour étudier les interactions entre ces multiples types cellulaires. Une étude à trois couches similaire a récemment été publiée où les fibroblastes ont été incorporées dans un hydrogel de collagène I cylindrique avec muscle lisse ensemencées sur la surface externe et les cellules epitheliales à l'intérieur de la surface luminale 17. La stabilité mécanique des échafaudages électrofilées développés ici permettrait tubulaire semblable construit à former, et reste un courant recrch but au sein de notre groupe. Alors que l'étude a porté sur les voies respiratoires, plusieurs organes au sein de la part du corps cette unité structurelle de la muqueuse de base, et en modifiant les locataires mis en évidence dans cette étude, les plates-formes similaires pourraient être développés pour les tissus contenant une unité de la membrane basale, y compris les vaisseaux sanguins, la vessie et la cornée, où collagène modèles multi-couches à base ont été employées.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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La recherche qui a abouti à ces résultats AirPROM a reçu un financement de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 270194.Ces travaux ont également été financés par le Centre national pour le remplacement, le raffinement et la réduction des animaux en recherche (NC3Rs), et le Centre de formation doctorale (DTC) en médecine régénérative du Centre d’ingénierie et de recherche physique (EPSRC), Royaume-Uni

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bouteilles en polyéthylène téréphtalate (PET)Lucozade (GSK)N/ASource de PET pour l’électrofilage. Couper en petits morceaux et peser si nécessaire
Dichlorométhane (DCM)Solvant pour PET
Acide trifluoroacétique (TFA)Sigmapour PET
Mandrin rotatifConstruit en interneUtilisé pour collecter les fibres électrofilées. En tournant à différentes vitesses, les fibres peuvent être alignées ou orientées de manière aléatoire
Pompe à seringueAppareilutilisé dans le processus d’électrofilage
DMEM-F12GibcoMilieu de culture pour cellules CALU3
DMEMGibcoMilieu de culture pour cellules HASM
MEMGibcoMilieu de culture pour cellules MRC5
Antibiotique/ antimycosique solutionGibcoMedia supplement
FCSGibcoMedia supplement
Mélangeur orbital (Orbital shake 503)Stuart ScientificPour l’ensemencement dynamique de cellules sur des échafaudages en microfibres
Pompe péristaltique  ;Watson MarlowPour fournir un flux de fluide à travers le bioréacteur
3DKubeKiyatecBioréacteur pour la culture cellulaire 3D
Solvant Harvard

Références

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