Observation du Mouvement ciliaire des cellules épithéliales plexus choroïde Ex Vivo

Résumé

Dans cette étude, une technique détaillée de microscopie optique a été optimisée pour l’observation et l’analyse en temps réel du mouvement des cils CPEC ex vivo, ainsi qu’une méthode de microscopie électronique pour l’analyse ultrastructurale.

Résumé

Le plexus choroïde est situé dans la paroi ventriculaire du cerveau, dont la fonction principale est censée être la production de liquide céphalo-rachidien. Les cellules épithéliales du plexus choroïde (CPEC) recouvrant la surface du tissu du plexus choroïde hébergent plusieurs cils uniques, mais la plupart des fonctions de ces cils restent à étudier. Pour découvrir la fonction des cils CPEC en particulier en ce qui concerne leur motilité, un système d’observation ex vivo a été mis au point pour surveiller la motilité ciliaire pendant les périodes embryonnaire, périnatale et postnatale. Le plexus choroïde a été disséqué dans le ventricule cérébral et observé à l’aide d’un microscope à contraste vidéo équipé d’une optique de contraste interférentiel différentiel. Dans ces conditions, une méthode simple et quantitative a été développée pour analyser les profils mobiles des cils CPEC pendant plusieurs heures ex vivo. Ensuite, les changements morphologiques des cils au cours du développement ont été observés par microscopie électronique à balayage pour élucider la relation entre la maturité morphologique des cils et la motilité. Fait intéressant, cette méthode pourrait délimiter les changements dans le nombre et la longueur des cils, qui ont culminé au jour postnatal (P) 2, tandis que la fréquence des battements a atteint un maximum à P10, suivi d’un arrêt brutal à P14. Ces techniques permettront d’élucider les fonctions des cils dans divers tissus. Bien que des techniques similaires aient été publiées dans un précédent rapport¹, la présente étude se concentre sur des techniques détaillées pour observer la motilité et la morphologie des cils CPEC ex vivo.

Introduction

Les cils sont des projections ressemblant à des cheveux à la surface de la plupart des cellules de vertébrés, qui ont attiré l’attention des chercheurs médicaux en raison d’une classe de maladies appelées ciliopathies ^2-4. Malgré l’expression omniprésente de l’organite, une grande variété de fonctions ciliaires ont été rapportées, y compris la motilité et la biodétection. Par exemple, les cils mobiles à la surface de la muco-épithélium transportent le mucus⁵ et les débris épithéliaux vers la sortie des tractus, prévenant ainsi les maladies en dégageant la surface des épithéliums. De plus, au cours des premières périodes de développement et des stades embryonnaires, les cils régulent la prolifération des cellules souches⁶ et sont impliqués dans la détermination de l’asymétrie gauche-droite du corps du vertébré⁷.

Les cellules épithéliales du plexus choroïde (CPEC) sont des dérivés des cellules neuroépithéliales qui recouvrent la surface du tissu du plexus choroïde dans le cerveau, qui jouent un rôle important dans le maintien de l’homéostasie de l’environnement intracrânien par la production de liquide céphalo-rachidien (LCR). Il a déjà été démontré que les CPEC ont plusieurs cils non mobiles qui régulent la production de LCR par le biais de récepteurs couplés aux protéines G qui sont spécifiquement concentrés sur les cils⁸. Bien que ces cils aient été considérés comme des cils quiescents non mobiles, il a été découvert que certains cils CPEC présentent une motilité transitoire au cours de la période néonatale¹. Cette découverte était très importante car elle a révélé que les cils dits non mobiles ne sont pas nécessairement immobiles dès le début du développement et pourraient présenter une motilité transitoire pendant des fenêtres de temps spécifiques, peut-être en réponse à des exigences et des fonctions physiologiques spécifiques⁹. Pour décrire précisément la nature motile des cils CPEC, il est nécessaire de développer un système d’observation ex vivo qui englobe l’analyse des profils cinétiques propres aux cils CPEC.

En ce qui concerne la motilité, bien que plusieurs rapports techniques aient décrit des observations des cils mobiles de l’épithélium trachéal^5,10, des flagelles unicellulaires mobiles¹¹, des cils mobiles dits^{conventionnels 12} et des cils ganglionnaires¹³, les méthodes analytiques détaillées applicables à des structures relativement ondulées telles que le plexus choroïde n’ont pas été bien documentées jusqu’à présent. De plus, une résolution temporelle élevée est nécessaire pour analyser le mouvement ciliaire des CPEC, dans lesquels des caméras à grande vitesse coûteuses sont indispensables. Pour contourner cette nécessité et simplifier la surveillance de la motilité ciliaire de divers types de cellules, une caméra à faible coût et à grande vitesse a été introduite, et une méthode facilement accessible et pratique pour enregistrer la motilité des cils mobiles, en particulier pour décrire la vitesse et le modèle de mouvement de chaque cil, a été développée¹. De plus, le logiciel original d’analyse d’images « TI Workbench » a été utilisé ici pour faciliter l’analyse détaillée de la motilité. Collectivement, cette méthode fournit une nouvelle stratégie concise pour analyser le mouvement ciliaire avec la microscopie électronique à balayage corrélative (MEB), qui peut être adoptée dans un large éventail de recherches sur le cilium.

Protocole

Les protocoles et l'utilisation des animaux de laboratoire ont été approuvés par les soins des animaux et de l'utilisation des comités institutionnels de l'Université de Yamanashi et de l'Université de Waseda. soins aux animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles.

1. Préparation CPEC

1. Préparer des appareils et des matériaux suivants: un microscope stéréo, de préférence capable de transmettre l'illumination du fond; une paire de pinces horloger (Dumont N ° 3 ou n ° 4), la flamme stérilisé, des ciseaux d'exploitation droites, flamme stérilisé; deux plats 10 cm en plastique stériles contenant 20 ml glacée moyen Leibovitz L-15; Plats à fond de verre de 35 mm contenant 2 ml RT Leibovitz milieu L-15; un bêcher de 100 ml contenant 70% d'éthanol; souriceaux nouveau-nés.
2. Immerger brièvement une souris néonatale dans 70% d'éthanol et euthanasier rapidement par décapitation en utilisant les ciseaux d'exploitation.
3. Placez la tête immédiatement Leibovitz milieu L-15 glacée dans le stérile à 10 cm dish.
4. Retirer la peau des calvaria utilisant la paire de forceps horloger, ouvrir le crâne pour exposer le cerveau, et puis couper les nerfs crâniens pour isoler l'ensemble du cerveau.
5. Transférer le cerveau à un nouveau plat contenant Leibovitz milieu L-15 glacée et observer au microscope stéréo, faire en sorte que le cerveau est complètement immergé dans le milieu.
6. Réglez la face dorsale du cerveau vers le haut, et d'orienter le cerveau de sorte que les bulbes olfactifs résident à la position trois heures (pour les droitiers). Maintenez le cerveau en douceur avec la pince à la main gauche.
7. En utilisant les pinces à dissection fines (Dumont N ° 3 ou # 4) dans la main droite, couper le corps calleux et sous le parenchyme reliant les hémisphères cérébraux, le long de la fissure longitudinale du cerveau.
8. Poussez doucement les hémisphères cérébraux loin aux côtés latéraux et d'exposer la fissure transversale cérébrale.
9. Séparer les hémisphères par pincement sur the parenchyme entre l'hémisphère et le thalamus.
10. Tirez doucement sur le plexus choroïde ventriculaires latérales qui est attaché à la face latérale de l'hippocampe par le affixa lamina.
11. Transférer les plexus choroïde isolés au plat à fond de verre de 35 mm contenant du milieu frais Leibovitz L-15, et superposer un poids (liste des matières) doucement pour maintenir le tissu en place.

2. imagerie en direct de CPEC Cilia

1. Confirmez ultraviolet bon (UV) et le filtre (s) déduit (IR) de coupe pour bloquer la lumière inférieure à 400 nm et plus de 700 nm, et que la densité neutre (ND) filtres (25% et 6%) sont insérés dans le trajet de la lumière du microscope inversé.
2. Régler la netteté de l'objectif plus ou moins à l'oeil, et ensuite ajuster le condenseur afin que le centre et le foyer pour se conformer à l'éclairage de Köhler. Insérer un contraste interférentiel différentiel approprié (DIC) prisme, un élément DIC, ainsi que des éléments de l'analyseur et le polariseur dans le lichemin lutte pour se conformer à l'optique DIC.
3. Régler le contraste de vue par la position du prisme DIC sorte que la structure de la surface du tissu est plus reconnaissable. Si tous les cils des cellules cibles sont mobiles, une vision claire des cils mobiles ne peut pas être obtenue par l'œil en raison de leur mouvement.
4. Modifiez le chemin de lumière à la caméra vidéo, et de supprimer les filtres ND pour augmenter la puissance lumineuse.
5. Utilisez l'appareil photo en mode de mise au point de régler le champ de vision et de concentration. Au cours de mise au point, dans lequel les images vidéo sont affichées en temps réel sur l'écran, une vue claire des cils mobiles ne sont pas disponibles.
6. Utilisez l'appareil photo à 200 Hz avec un temps d'exposition de 0,1 ms pour la période souhaitée (secondes à quelques minutes). Après l'acquisition de la pile de l'image, des images uniques seront afficher structures ciliaires claires. Si bords ciliaires sont floues, d'augmenter le taux de trame ou utiliser un temps d'exposition plus courte.
7. Enregistrer le mouvement de CPEC cils au sein 25-60 minutes après l'euthanasie en LeibovitzMilieu L-15.

3. Analyse du mouvement ciliaire

1. Suivre manuellement battant motifs de chaque cil sur le moniteur de l'ordinateur. Marquer les positions de pointe ciliaire dans chaque image avec le pointeur de la souris, qui sont assemblés pour obtenir des informations trajectoire de chaque cil. Soit analyser les informations trajectoire en utilisant le même logiciel ou l'exportation vers d'autres applications plus générales pour une analyse plus approfondie. L'efficacité de cette étape d'analyse est décrite dans la discussion.
2. Classer les trajectoires en deux modes de mouvement, de va-et-vient ou de rotation, par oeil.
3. Calculer la fréquence ciliaire de battage (CBF) en utilisant la formule suivante: [CBF = (nombre d'images par seconde) / (nombre moyen d'images pour un seul battement)] ^14, qui peut être obtenu à partir d'un schéma pointe ciliaire de mouvement (Figure 3 ). Répéter ce calcul pour de multiples cycles de battement ciliaire, parce que d'autres cils sur la même cellule peut interférer avec le mouvement de chaque cilium, ce qui entraîne l'irrégularité.
4. Pour analyser l'uniformité angulaire du battement ciliaire axes dans une seule cellule, définir le θ de l'angle de battement pour chaque trajectoire (Figure 4). Pour trajectoires de va-et-vient, adapter les postes de la pointe des cils à une ligne droite, et de définir l'angle θ que la ligne fait avec axe x. Pour trajectoires de rotation, adapter les postes à une ellipse, et de définir l'angle θ que l'axe majeur de l'ellipse fait avec axe x. Détails de la ferrure sont décrits dans la section des résultats représentatifs.
5. Pour une description quantitative de chaque trajectoire, calculer généralisée rapport d'aspect AR. En bref, la trajectoire de rotation - θ et AR définir comme étant le rapport entre la largeur de la distribution le long de x - y et -axes (figure 4B). Les détails sont affichés dans la section des résultats représentatifs, et l'interprétation, L'importance et la limitation du paramètre sont décrites dans la discussion.

4. Préparation d'échantillons pour MEB

Remarque: SEM est une méthode importante pour évaluer l'état des cils sur CPEC d'une manière globale. Pour préparer des échantillons pour SEM, une procédure standard précédemment rapporté ¹⁵ est employé avec de légères modifications.

1. Avant la dissection du tissu du cerveau, préparer le fixateur dans un flacon en verre de 5 ml avec un bouchon en polyéthylène. Le fixateur est constitué de 2% de paraformaldehyde, 2,5% de glutaraldéhyde (moitié de la solution de ¹⁶ Karnovsky) dans 0,1 M de tampon phosphate, pH 7,4.
2. Disséquer les tissus du cerveau, comme décrit dans l'étape 1.
3. Rincer brièvement le tissu isolé avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) dans un nouveau plat, puis fixer le tissu dans le fixateur dans le flacon de verre pendant 1 heure à température ambiante. Utilisez pipettes de transfert unique et manipuler les spécimens gently. Après rinçage dans HBSS, le tissu devient collant.
   1. Pour transférer les échantillons dans la solution de fixateur, lentement expulser une petite quantité de solution contenant le tissu de la pipette de transfert en gouttelettes et ajouter au fixateur.
4. Après fixation, jeter le fixateur et rincer le tissu avec tampon phosphate trois fois.
5. Plonger le tissu dans une solution de saccharose à 10% pour se laver les aldéhydes restants. Pour assurer l'élimination complète des aldéhydes, plonger les échantillons dans la solution pendant 10 min, puis répéter deux fois avec des produits frais 10% de saccharose. Cette étape est importante pour parvenir à post-fixation correcte dans les étapes suivantes.
6. Plonger le tissu dans une solution de 1% de tétroxyde d'osmium dans un tampon phosphate pendant 30 min, puis placer sur la glace pour la post-fixation. Juger du degré de osmification par la couleur de l'échantillon: quand aldéhydes sont complètement enlevés, l'échantillon est noir.
7. Laver les échantillons de tissus postdéterminés abondamment avec double distilléed l'eau plusieurs fois.
8. Déshydrater les échantillons par immersion dans des concentrations échelonnées d'éthanol, généralement 65%, 75%, 85%, 95%, 99% et 100%, pendant 10 minutes chaque. Obtenir de l'éthanol anhydre en plaçant des tamis moléculaires dans 99,5% d'éthanol à partir d'une bouteille nouvellement acheté. Répétez avec déshydratation de l'éthanol anhydre à trois reprises.
9. Placer les échantillons déshydratés dans de l'acétate d'isoamyle, un réactif de substitution pour un séchage au point critique, pendant 10 min. Répéter deux fois cette étape. Ce réactif évapore rapidement et l'échantillon peut devenir sèche, provoquant la destruction par la tension de surface. Par conséquent, ne pas sécher l'échantillon complètement.
10. Après le dernier échange de l'acétate d'isoamyle, enlever la plupart du solvant, immédiatement envelopper le flacon en verre ouvert avec du papier d'aluminium et placez le flacon sur glace sèche. En utilisant une aiguille ou une pince fine, faire plusieurs trous dans la feuille de recouvrement de l'embouchure de la fiole, de telle sorte que le dioxyde de carbone liquide coule facilement dans la fiole dans le sécheur à point critique. Passez à l'étape suivanteaussi vite que possible.
11. Dans cette étape, minimiser le report de l'acétate d'isoamyle dans la chambre de la sécheuse, mais ne laissez pas l'échantillon sécher complètement avant séchage au point critique. En outre, ne pas laisser l'échantillon sur de la glace sèche pour une inutilement beaucoup de temps pour éviter la formation de givre sur le flacon.
12. Transférer les flacons de verre papillote contenant les échantillons de tissus dans le sèche-linge au point critique qui assure la structure de la surface du tissu reste intact tandis que l'eau contenue dans l'élimination du tissu. Des informations détaillées sur le fonctionnement du sèche point critique peut être obtenu à partir des instructions du fabricant.
13. Manipulez les échantillons soigneusement à l'aide d'un cure-dent pour minimiser les dommages mécaniques. Les échantillons de tissus séchées résultantes sont fragiles. Montez les échantillons sur les moignons métalliques et manteau avec de l'or-palladium en utilisant une pulvérisation d'ions.

5. observation par MEB

1. Observez par SEM et enregistrer des images avec un appareil photo numériqueéquipé d'un microscope électronique à balayage.
2. Transférer des données d'image numériques à un ordinateur pour analyse.

Résultats

Vue d'ensemble du flux de production est représenté sur la Figure 1, y compris les images des dispositifs.

Observations de mouvement direct de CPEC

Film 1 montre un film de CPEC isolés à partir d'une souris périnatale et Movie 2 montre une vue agrandie des images dans le film 1. Il convient de noter que des conseils individuels ciliaires sont moins claires dans les images fixes par rapport à ceux...

Discussion

Perspectives de cette méthode

Bien que la technique décrite ici ne prévoit pas une analyse plus détaillée des cils que les méthodes déjà publiées, la signification de cette technique réside dans la simplicité du système et l'efficacité des coûts, qui peut être facilement appliquée au dépistage tout type de motilité ciliaire ex vivo. En particulier, TI Workbench fournit une interface simple et conviviale qui permet aux chercheurs d'observer et d'analyser la motilité cilia...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs requis
pour l’imagerie de cellules vivantes
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
pour préparation MEB
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
La solution saline équilibrée de Hank’s	Life Technologies	14170112
le paraformaldéhyde  ;	Merck	1040051000
glutaraldéhyde  ;	Nacalai tesque	17003-05
acétate d’isoamyle	Nacalai tesque	02710-95
Tamis moléculaires 4A 1/8  ;	Wako Chemicals	130-08655	pour la préparation de tampon phosphate d’éthanol anhydre
salin (PBS)	Tampon phosphate Sigma-Aldrich	D1408
, 0,1 M			Pour faire 100 ml, mélanger 19,0 ml de 0,1  ; M NaH2PO4 et 81,0 ml de 0,1 ; M Na2HPO4
>monosodique phosphate (dihydraté)	Nacalai tesque	31718-15
phosphate disodique (anhydre)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
tétroxyde d’osmium	Nisshin EM	300
glace
[en-tête]
Outils et matériaux pour la dissection
pour l’imagerie en direct et la préparation MEB
stéréomicroscope	Olympus	SZX7
essuie-tout
&Phi ; Plat
cm Bécher
Ciseaux de commande droits	Sansyo	S-2B
Pince d’horloger	Dumont	N° DU-3 ou -4, INOX
pour l’imagerie de cellules vivantes
plat à fond en verre	Matsunami Glass	D110300
pour la préparation MEB
flacon en verre
de 5 ml avec bouchon en polyéthylène	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
pipette de transfert	Samco Scientific	SM251-1S	pour transfert d’échantillon
cure-dent			pour transfert d’échantillon
pulvérisation ionique avec or-palladium	Hitachi	Sécheur point critique E-1030
	Hitachi	HCP-2
[en-tête]
Equipements et matériaux microscopiques
pour l’imagerie de cellules vivantes
microscope inversé	Olympus	IX81
100 W Boîtier et alimentation	Olympus	U-ULH et BH2-RFL-T3
100 W lampe au mercure	Ushio	USH103D
condenseur DIC, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
obturateur électrique	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 et VMM-D1	obturateur manuel peuvent être utilisés.
Filtre passe-bande (400-700  ; nm, et phi ; 45  ; mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
Filtre ND (&Phi ; 45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combinaison de filtres ND 25 % et 6 % sont utilisés
objectif objectif (immersion dans l’eau) avec élément DIC	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 avec caméra vidéo haute vitesse IX-DPAO40
	Allied Vision Technologies	GE680	≥ ; Fréquence d’images de 200 Hz et temps d’exposition de 1 ms,
logiciel d’acquisition / analyse	d’images logiciel interne	TI Workbench	capable d’acquérir à des fréquences d’images élevées.
PC pour le contrôle / l’analyse de la caméra	Apple	Mac Pro
table d’isolation des vibrations	Meiritsu Seiki	AD0806
poids pour tissus	Warner Instruments	kits d’ancrage de tranche	Il peut être fabriqué avec une maille de nylon collée à une forme en U écrasée &Phi ; 0,5  ; mm fil de platine.
de protection (poids alternatif pour le tissu)	Matsunami	sur commande	Un verre de protection peut être utilisé comme poids de tissu.
pour MEBmicroscope
inversé	Olympus	IX81
microscope électronique à balayage	JEOL	JSM-6510