Article de méthode

Stimulation du nerf vague comme un outil pour induire la plasticité dans les voies pertinentes pour l'extinction d'apprentissage

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DOI :

10.3791/53032

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21 août 2015

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1School of Behavioral and Brain Sciences, The University of Texas at Dallas

Dans cet article

Résumé

Stimulation du nerf vague (VNS) a émergé comme un outil pour induire la plasticité synaptique ciblée dans le cerveau antérieur de modifier une gamme de comportements. Ce protocole décrit comment mettre en œuvre VNS pour faciliter la consolidation de la mémoire la peur de l'extinction.

Résumé

Extinction décrit le processus d’atténuation des réponses comportementales aux stimuli neutres lorsqu’ils ne fournissent plus le renforcement qui a maintenu le comportement. Il existe une correspondance étroite entre la peur et l’anxiété humaine, et par conséquent, les études sur l’apprentissage de l’extinction pourraient donner un aperçu de la nature biologique des troubles liés à l’anxiété tels que le trouble de stress post-traumatique, et elles pourraient aider à développer des stratégies pour les traiter. La recherche préclinique vise à faciliter l’apprentissage de l’extinction et à induire une plasticité ciblée dans les circuits d’extinction pour consolider la mémoire nouvellement formée. La stimulation du nerf vague (VNS) est une approche puissante qui fournit une libération temporelle et spécifique au circuit de neurotransmetteurs, entraînant une modulation des réseaux neuronaux engagés dans une tâche en cours. Le VNS améliore la consolidation de la mémoire chez le rat et l’homme, et l’appariement du VNS avec l’exposition à des signaux conditionnés améliore la consolidation de l’apprentissage de l’extinction chez le rat. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la préparation des pièces sur mesure et les procédures chirurgicales requises pour le VNS chez le rat. En utilisant ce protocole, nous montrons comment la VNS peut faciliter l’extinction des réponses de peur conditionnée dans une tâche de conditionnement de la peur auditive. De plus, nous fournissons des preuves que VNS module la plasticité synaptique dans la voie entre le cortex préfrontal médial infralimbique (IL) et le complexe basolatéral de l’amygdale (BLA), qui est impliqué dans l’expression et la modulation de la mémoire d’extinction.

Introduction

Classique conditionnement de la peur fournit un modèle animal largement utilisé pour étudier la base biologique des troubles anxieux. Au cours de conditionnement de la peur, un stimulus aversif (le stimulus inconditionné, États-Unis, par exemple, un choc électrique) est présenté en conjonction avec un stimulus neutre, comme un ton et / ou un contexte (le stimulus conditionné; CS). Au cours de conditionnement de la peur, les associations entre le CS et les États-Unis sont formés. Finalement, la présentation de la CS seul déclenche une réaction de peur (la réponse conditionnée; CR). Dans la crainte d'extinction, le CS est présenté à plusieurs reprises en l'absence des États-Unis, provoquant la CR à diminuer progressivement 1. Ainsi, l'extinction de la peur conditionnée est un processus actif dans lequel les réponses comportementales aux stimuli effrayants neutres sont atténués quand ils prédisent plus les résultats d'aversion. Extinction des réponses conditionnées nécessite la consolidation de nouveaux souvenirs qui sont en concurrence avec les associations savantes. Une caractéristique de troubles anxieux est impaextinction ired 2-4. Ainsi, l'extinction de la peur conditionnée dans des modèles animaux sert de paradigme important à la fois pour l'apprentissage d'inhibition et un modèle de comportement pour le traitement de troubles de l'anxiété humains 5,6.

Parce qu'il ya correspondance étroite entre la peur et l'anxiété humaine, on pense que ces études peuvent donner un aperçu de la nature biologique des troubles liés à l'anxiété tels que le trouble de stress post-traumatique et aideront à élaborer des stratégies pour les traiter. Un objectif important de la recherche préclinique est de faciliter l'apprentissage de l'extinction et à induire la plasticité ciblée dans les circuits d'extinction de consolider l'apprentissage de l'extinction. Stimulation du nerf vague (VNS) est une approche minimalement invasive neuroprosthetic qui pourrait être utilisé pour fournir modulation temporelle et spécifique circuit serré de zones du cerveau et des synapses engagés dans une tâche permanente. Une série d'études récentes du groupe de Michael Kilgard à l'Université du Texas à Dallas ontmontré que VNS appariement avec des stimuli sensoriels ou moteurs discrets (par exemple, une tonalité ou un levier de traction) est très efficace dans la promotion de la plasticité corticale pour traiter les acouphènes 7, ou pour surmonter des déficits moteurs après un AVC 8-10. En outre, non contingent VNS qui se produit au sein d'une fenêtre de temps court après l'apprentissage favorise similaire plasticité corticale et améliore consolidation de la mémoire chez les rats et les humains 11-13.

Considérant le rôle du nerf vague dans la voie parasympathique, il est pas surprenant qu'il pourrait participer à la modulation des souvenirs et la plasticité synaptique. Hautement événements émotionnels ont tendance à produire des souvenirs forts que des mémoires non-émotionnels. Cela est probablement dû à l'influence des hormones du stress sur la consolidation de la mémoire. Posttraining administration de l'adrénaline hormone de stress améliore consolidation de la mémoire chez les animaux humains et non-humains, mais l'adrénaline ne traverse pas la barrière hémato-barrière 14, 15 . Par conséquent, la libération d'adrénaline induite par le stress doit influer sur le cerveau indirectement à améliorer la consolidation de la mémoire. Solides preuves médicales révèlent que le nerf vague peut être le lien entre l'adrénaline en circulation et le cerveau. Miyashita et Williams 16 ont trouvé que l'administration systémique d'adrénaline augmenté nerf vague tir, et a augmenté les niveaux de noradrénaline dans l'amygdale 17. L'administration systémique d'adrénaline ne renforce pas la consolidation de la mémoire lorsque les récepteurs β-adrénergiques sont bloqués dans l'amygdale 18 suggérant que le nerf vague joue un rôle dans la voie qui tourne expériences suscitant émotionnellement en mémoire à long terme.

Ainsi, le jumelage avec la formation VNS a le potentiel d'améliorer les changements du cerveau qui soutiennent consolidation de la mémoire et de l'exposition à des indices conditionnés en l'absence de renfort améliore la consolidation de l'apprentissage d'extinction chez les rats 19,20. Nous décrivons ici l'utilisation d'un VNSoutil pour promouvoir sa plasticité corticale et de faciliter l'extinction d'une réponse de la peur conditionnée.

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Protocole

Toutes les procédures décrites dans le présent protocole sont effectués en conformité avec le Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, et ils ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université du Texas à Dallas.

1. Construction de VNS Poignets

  1. Créer un outil de forage par scier l'extrémité pointue d'une aiguille 22 G ½.
  2. Lancez maintenant la fin brutale de l'aiguille 22 G ½ sur un fichier de métal à plusieurs reprises pour l'aplatir. Tenez l'aiguille à un angle de 45 degrés vers le fichier et lancez plusieurs fois sur le fichier tout en le tournant. Cela entraînera le métal pour devenir plus mince et furl vers l'intérieur. ATTENTION: Insérer la pointe du scalpel dans l'extrémité de l'aiguille de coupe et tourner avec une certaine force vers le bas pour déployer le métal.
  3. Utilisez des jumelles loupes pour les étapes restantes de la section 1.
  4. Avec un scalpel (10 ou 15 lames) coupé 4 mm segments de tuyau.
  5. Placez un segment de 4 mm sur uneforet petite ou un autre outil de forme similaire. Ceci est de tenir le tuyau en place alors qu'il est manipulé.
  6. Percez 4 trous dans le tube (figure 1A). Les trous doivent prendre les quatre points de 2 mm par 2 mm carré et doivent être propres et sans aspérités.
    REMARQUE: L'outil de forage doit être réaffûtée (étape 1.2) tous les 2 ou 3 trous. Difficulté de cette étape est presque certainement due à un outil de forage qui ne sont pas assez tranchant.
  7. Avec le tube encore sur le trépan de forage, en utilisant un scalpel pour couper le tube de la longueur entre les trous de telle sorte que deux trous se retrouvent sur ​​chaque côté de la coupe (figure 1B).
  8. En utilisant une aiguille à coudre et du fil de suture, passer à travers les trous de suture pour créer le gréement pour le placement ultime de le brassard autour du nerf vague. Commencez avec l'aiguille à l'intérieur du brassard et le passer à travers un des trous, puis revenir en arrière à travers le trou à côté de l'extérieur (figure 1C). Attachez le THREAd ensemble ~ 2 cm de la matière plastique de sorte que le tube et le fil font un triangle. Autoriser ~ 8 cm de fil après le noeud et les garnitures. Répéter le processus pour les trous sur le côté opposé de la coupe. Le tube est maintenant prêt à être câblé.
  9. Préparer fils pour poignets.
    1. Couper le fil d'iridium de platine dans 70 mm segments.
    2. Utilisation de la plus belle pointe de la torche de bijoux, de créer une flamme forte avec le centre bleu qui est aussi raffiné que possible et l'utiliser pour dépouiller ~ 1 cm du revêtement en plastique du fil. Appliquer le centre bleue de la flamme à l'extrémité dénudée du fil pour créer une petite boule. Appliquer le centre bleue de la flamme à plusieurs points de la partie dénudée de fusionner les sept brins ensemble. Le fil de ces taches apparaîtra à plier.
    3. À l'autre bout du fil, appliquer le centre bleue de la flamme à la fin pour créer une petite boule. Réduire décapage le plastique sur cette fin.
  10. Câbler le brassard (figure 1D).
    NOTE: Steps dans la section 1.10 doit se faire sous jumelles de grossissement.
    1. Tape la manchette en utilisant les fils de sorte qu'il est orienté avec la coupe se déplaçant horizontalement. Tirez sur les fils serrés de telle sorte que le brassard est tiré ouverte puis bande vers le bas les fils.
    2. Saisissez l'extrémité de la boule du côté dénudée du fil préparé avec # 5 forceps et pousser dans le trou en bas à droite. Tirer la pince hors du trou, en laissant l'extrémité du fil au milieu de la manchette.
    3. Re-saisir l'extrémité boule du fil dénudé (maintenant au milieu de la coiffe) et le pousser à travers le trou en haut à droite. Tirez la pince hors du trou, laissant le fil traversé complètement le brassard et lâche sur le côté haut de la manchette.
    4. Re-saisir l'extrémité boule du fil dénudé (maintenant à l'extérieur le brassard sur la face supérieure) et le pousser à travers le trou en haut à droite de l'intérieur. Continuer à le faire jusqu'à ce que le fil est bien en place: test en tirant sur l'extrémité opposée du fil.
      NOTE:Au cours de ce processus, il est essentiel de différencier les parties dénudées / isolés du fil. Le fil qui est finalement placé dans le 'creux' de la coiffe doit être dépouillé, mais tout ci-dessous les trous inférieurs (en dehors de la manchette sur l'extrémité inférieure) doit être isolé. Cela garantit la livraison de courant uniquement au nerf vague.
    5. Saisissez l'extrémité de la boule du côté isolé et le pousser dans le trou en bas à droite de l'intérieur de la coiffe, une boucle autour d'une fois.
    6. Répéter les étapes 1.10.2 - 1.10.5 sur le côté gauche de la manchette de telle sorte que deux fils finissent fixée à la tubulure, l'un sur le côté droit et l'autre sur le côté gauche.
    7. Placez une épinglette en or dans le bras de la main avec le trou vers le haut. Remplissez le trou avec flux.
    8. Souder l'extrémité du fil isolé (maintenant attaché à la manchette) dans la broche.
    9. Permettre à la soudure de refroidir, puis à nouveau l'état fondu. Ceci assure une bonne liaison entre l'extrémité du fil et l'inside de la broche. Appliquer plus de soudure si nécessaire. Répétez l'opération pour deuxième fil.
    10. Avec les fils courir vers la droite, marquez le haut de la manchette avec un marqueur permanent. Aussi marquer l'épingle d'or attaché à la tête dessus.

2. Construction de coiffe pour VNS site d'entrée

  1. Découpez 30 mm segments de 26 fils de cuivre AWG. Bande d'une petite portion à chaque extrémité.
  2. Coupez l'extrémité étroite hors épingles d'or en vrac et souder l'extrémité dénudée du fil à la fin de l'épingle d'or de coupe. Créez deux composés fils / broches pour chaque site d'entrée souhaitée. Placez un connecteur dans les mains secourables et souder l'extrémité du fil d'un composé fils / broches au chacune des deux dents fluxé du connecteur (figure 2G).
  3. Mark l'un des fils avec Sharpie. Pendant la chirurgie, positionner l'implant avec le fil rostrale marquée au fil banalisée.

3. Chirurgie VNS

  1. Créer des outils de verre personnalisé pour la manipulation des vagus nerf pendant la chirurgie.
    1. Utilisez le verre borosilicate pour tirer une micropipette de sorte qu'il a une pointe à long effilé. Si aucun pipette extracteur est disponible, briser le verre pour créer un bord plus.
    2. Maintenez l'extrémité non conique de la pipette avec un tissu épais (pour éviter les brûlures) et appuyez sur l'extrémité conique / brisé en une surface lisse résistant au feu tout en appliquant la flamme bleue de la torche de bijoux à l'extrémité effilée. Le verre se plie comme il est enfoncé dans la surface. Appliquer flamme jusqu'à un crochet ou formes de forme J.
  2. Procédures chirurgicales VNS
    1. Rassemblez et stériliser tous les outils. Préparer une zone chirurgicale sanitaire, chauffée.
    2. Anesthésier des animaux avec de la kétamine / xylazine (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Évaluer la profondeur du plan anesthésique en surveillant les vocalisations de l'animal et le retrait réflexes en réponse aux pieds et / ou la queue pincement.
    3. Rasez le haut de la tête et sur le côté gauche du cou de l'animal. Protégez les yeux de l'animal avec un creuseurhuile al ou pommade oculaire. Appliquer la solution d'iode de nettoyage avec de la gaze et l'alcool avec de la gaze dans les zones rasées. Répéter une fois.
    4. Injecter 0,05 ml marcaïne voie sous-cutanée sur le sommet de la tête et permettre au bolus de se disperser tout en plaçant l'animal dans l'appareil stéréotaxique.
    5. Utiliser un scalpel pour faire une incision dans la peau sur le crâne afin d'exposer à la fois lambda et bregma. Préparer un chemin pour le brassard à l'aide de forceps émoussé à tunnel sous-cutanée sur le site d'incision sur le côté gauche en avant de l'oreille vers le côté gauche du cou.
    6. Tirez sur le site de l'incision ouverte avec des pinces hémostatiques. En utilisant des cotons-tiges, appliquer le peroxyde d'hydrogène au crâne exposées afin d'enlever tout tissu restant.
    7. Avec un scalpel, percer deux trous de démarrage peu profondes dans le crâne pour placer des vis d'ancrage. Elles doivent être placées suffisamment éloignés pour laisser place à l'implant, mais pas trop près du tissu environnant. Évitez de placer les vis directement sur la ligne médiane.
      1. Avec vigueurps et un tournevis, en voiture une vis à os dans les deux trous. Les vis doivent être serrées dans les trous, avec les bouchons 2 - 3 mm au-dessus de la surface du crâne pour laisser place à l'acrylique à remplir sous et autour des vis.
    8. Remplir l'espace sous, autour et entre les vis avec une petite quantité d'acide acrylique, en évitant le tissu environnant. Ensuite, placer une plus grande quantité d'acide acrylique dans le milieu du crâne entre les deux vis.
    9. Prenez l'implant de sorte que le conducteur marqué est orienté rostrale au fil banalisée et placez rapidement l'implant dans l'acrylique, en prenant soin de ne pas obtenir acrylique dans les épingles d'or, la zone de fermoir, ou le site d'entrée sur le dessus. Une fois positionné permet de mettre en ~ 5 min jusqu'à ce que sec. Ceci peut également être fait à l'aide du bras de support pour le stéréotaxique. Remplissez les fissures ou les écarts entre l'implant et le crâne avec un mélange faible de la viscosité de l'acrylique. Laisser sécher.
    10. Utilisez des jumelles loupes pour les étapes restantes de la section 3.2.
    11. Retirer ee animale de l'instrument stéréotaxique. Placez l'animal sur son côté droit, tourner légèrement vers la position ventrale.
    12. Faire une petite incision d'environ sur la veine jugulaire gauche. L'os de la mâchoire et la clavicule devraient être à peu près à égale distance de l'endroit de l'incision. Elargir l'incision en utilisant dissection jusqu'à ce que la couche musculaire est atteint. Les sterno, sterno et omo-hyoïdien muscles doivent être visibles. Utilisez rétracteurs musculaires pour garder le site ouvert.
    13. Continuer dissection émoussée le long des sillons naturelles entre les muscles. Cherchez la pulsation de l'artère carotide. Rubrique à travers le muscle vers la pulsation va révéler l'artère carotide. Tirez sur les muscles du dos avec l'enrouleur de muscle. La gaine contenant l'artère carotide contient également le nerf vague. Émousser soigneusement disséquer la gaine avec les ciseaux.
    14. Identifier le nerf vague. Il est le plus grand nerf dans la gaine de la carotide et est généralement à côté gauche de l'artère de l'animalmais peut être trouvé sur un côté. Basculer vers les outils de verre personnalisés et séparer le nerf vague de l'artère carotide. Le nerf doit être exempt de tout autre tissu pendant au moins 5 mm.
    15. De l'incision sur la tête, en utilisant les fils sur le côté de la manchette en face des pistes, tirez la manchette à travers le tunnel sous-cutanée déjà fait avec une pince ou de petites pinces hémostatiques. Le pousser à travers le tissu au niveau du site d'incision dans le cou.
    16. Soulevez doucement le nerf à l'aide des outils de verre et de repousser les discussions sur le côté de la manchette en face des pistes sous le nerf. Tirez sur les fils tout au long, en prenant soin de ne pas frotter contre le nerf. Le brassard doit être immédiatement adjacente au nerf.
    17. Assurez-vous que le brassard est orienté avec le 'top' côté marqué supérieure. Déposez le nerf dans le milieu de la manchette. Le nerf devrait maintenant se trouver sur les deux fils dans l'auge de la manchette (figure 2B). Nouez les fils ensemble pour fermer le brassard.
    18. Sur la coiffe, branchez les broches attachés à la manchette dans les broches dorées sur le site d'entrée de stimulation. Brancher la broche portant la broche en or fixée à la dent la plus antérieure sur le site d'entrée de simulation.
    19. Pour vérifier que le brassard correctement stimule le nerf vague, effectuer un arrêt de la respiration test en reliant le stimulateur sur le site d'entrée de stimulation sur la coiffe et le fonctionnement stimulation (0,2 mA, 60 Hz, jusqu'à 10 sec). La respiration doit brièvement arrêter et fréquence cardiaque doit déposer, vérifiant le fonctionnement brassard.
    20. Fixez les broches sur le site d'entrée de stimulation avec de l'acrylique. Couvrir les fils et vérifiez que les broches et les fils exposés ne conduisent pas à des courts-circuits. Utilisez acrylique pour aplanir les bosses ou pour combler les lacunes. Laisser sécher.
    21. Suture fermé deux sites d'incision. Injecter 0,05 ml marcaïne voie sous-cutanée à proximité du site d'incision du cou. Appliquer une pommade antibiotique pour incision sites. Eventuellement, laisser un connecteur mâle en place sur le site d'entrée de stimulationéviter tout dommage ou obstruction pendant le processus de guérison.
    22. Traiter avec des antibiotiques et suivre les soins post-opératoires standard, y compris l'analgésie appropriée. Animaux Retour à l'établissement de logements animal après ils retrouver leur mobilité. 5 jours pour la récupération. Pour assurer la longévité maximale et la fonction de la coiffe, les animaux domestiques séparément pour le reste de l'expérience.
      REMARQUE: Des rats Sham-VNS subissent la même opération, mais le circuit est conçu pour court au niveau de la coiffe (par exemple, une coiffe est implanté et le nerf vague est séparé de l'artère carotide, mais aucune électrode manchon est placé autour de la nerveuse).

4. auditif conditionnement de la peur

NOTE: Ce protocole de conditionnement de la peur est plus intense que la plupart des 21 parce que le but de ces expériences est d'améliorer l'extinction. Avec une légère conditionnement de la peur qui est facilement éteint, un effet de sol peut occulter cette amélioration.

  1. Animaux maison sur un 12 hr cycle lumière / obscurité avec accès ad libitum à la nourriture et de l'eau. Manipuler les animaux quotidienne lors de la récupération de la chirurgie.
  2. Mettre en place le dispositif de conditionnement et d'essai, constitué par une boîte opérant logé dans une chambre sonore atténué (figure 2C). La boîte comporte des parois opérant en plastique transparent, 20 x 20 x 20 cm et a un plancher grillagé en acier inoxydable qui est raccordé à un générateur de choc à la patte. Utilisez une maison-lumière blanche pour éclairer la chambre pour l'enregistrement vidéo. Utilisez un kHz 9, 85 dB SPL ton que le stimulus conditionné.
  3. le comportement d'enregistrement en utilisant un appareil photo numérique situé à l'intérieur de la chambre, au-dessus de la boîte opérant. Voir et surveiller la session sur un ordinateur situé à l'extérieur de la salle de comportement. Enregistrer des vidéos pour une analyse ultérieure.
  4. Essuyez chambres avec 70% d'éthanol avant et après chaque session d'éliminer les signaux olfactifs.
  5. Peur-conditionner les rats pendant 2 jours (figure 3A). Vérifiez que les rats ne sont pas enheureusement peur de le ton en présentant 5 tons (9 kHz, 85 dB, 30 sec) sur le premier jour. Veiller à ce que les niveaux de congélation sont négligeables.
    1. Suivez les présentations initiales de tonalité avec 8 ton footshock (1 sec, 0,5 mA) appariements sur chacun des 2 jours consécutifs. Répétez les appariements ton footshock nouveau sur la deuxième journée. Variez les inter-stimulus-intervalle (ISI) entre 2 et 4 minutes, en moyenne 3 min pour chaque procès. Aléatoire le point où le choc se produit pendant le ton.
  6. Le troisième jour, tester la force de l'association ton / choc. Jouer à 4 tons avec un ISI de 3, 4, ou 5 min (4 min de moyenne) en l'absence de footshocks et enregistrer le comportement de congélation des animaux pendant les présentations de tonalité et pendant les inter-relance-intervalles que les mesures de la réponse de peur conditionnée (CFR).
  7. Le jour 4, commencer la formation d'extinction avec VNS ou Sham VNS.
    1. Branchez les rats dans le stimulateur en insérant les connecteurs mâles de la stimulatoR dans le site d'entrée de stimulation. La place des animaux dans la chambre (figure 2A, 2C). Réglez le stimulateur à 0,4 mA, 500 ps largeur d'impulsion à 30 Hz. Ensemble stimulation à une durée totale de 30,15 secondes, à partir de 150 ms avant le début de la tonalité. Jouer animaux 4 tons (comme dans l'étape 4.6) et apparier chaque présentation de ton avec VNS ou Sham VNS.
  8. Périodiquement tester l'intégrité électrique du brassard et entrée site à l'aide d'un oscilloscope.
    1. Brancher l'animal en tant que normale et diviser le signal de sortie du stimulateur à l'oscilloscope.
    2. Définissez la plage sur l'oscilloscope -20 V à +20 V et exécuter stimulation. La forme d'onde de la stimulation de 30 Hz doit être visible sur l'oscilloscope. Stimulations de plus de 10 V en taille indiquent haute impédance et un brassard mauvais fonctionnement ou la connexion au site d'entrée de stimulation.
  9. Pour tester l'effet de VNS sur la formation d'extinction exécuté un second test de CFR (comme dans l'étape 4.6)le jour 5. Enregistrez le temps passé à la congélation pendant les présentations de tonalité et de comparer à la congélation de référence enregistrée lors du premier test de CFR (étape 4.6).
  10. Analyser les vidéos en utilisant un observateur indépendant qui est aveugle aux conditions de traitement. Mesurer le temps passé gel pendant les présentations de tonalité à l'aide d'un chronomètre. La congélation est défini comme l'immobilité complète, au cours de laquelle le rat présente une respiration rapide, la tête baissée, et la propagation pattes 22. Analyse du comportement de congélation peut être divisé en deux phases: lors de la présentation de ton et pendant l'intervalle inter-stimulus.

5. En Vivo enregistrements de Evoked terrain Potentiels

Remarque: Cette étape est facultative. Potentiels de champ évoqués (PEF) sont enregistrées 24 heures après que des tests de remise en état ​​(Jour 5) chez les rats anesthésiés isoflurane montés dans un appareil stéréotaxique, à la suite des procédures standard 23,24.

  1. Rassemblez et stériliser tous les outils.
  2. Induire une anesthésie avec de l'isoflurane (5% dans 100% d'oxygène, débit 1l / min) dans une chambre de plastique transparent. Évaluer la profondeur du plan anesthésique en surveillant les vocalisations de l'animal et le retrait réflexes en réponse aux pieds et / ou la queue pincement. Utilisez de l'huile minérale ou de la pommade oculaire afin de protéger les yeux.
  3. Injecter 0,05 ml marcaïne voie sous-cutanée sur le sommet de la tête et laisser le bol de se disperser. Utiliser un scalpel et hémostatiques pour enlever la coiffe du crâne. Utilisez aussi peu de force que possible pour éviter d'obscurcir bregma.
  4. Placer l'animal dans l'instrument stéréotaxique. Utiliser un scalpel pour élargir l'incision pour exposer la fois lambda et bregma. Maintenir plan anesthésie avec de l'isoflurane (3% à 100% d'oxygène, le débit de 1 L / min) par l'intermédiaire d'un cône de nez.
  5. Percez des trous dans le crâne au-dessus du cortex préfrontal infralimbic (IL) et l'amygdale basolatérale (BLA). Abaisser un microélectrodes de verre (KCl 2M; 1-2 MOhms résistance) dans le BLA (D / V: 7.2, A / P: 2,7, M / L: 4,9 de bregma) et un stimulatélectrode ion dans la région de la IL cortex préfrontal médian (D / V: 4,6, A / P: 3,0, M / L: 0,7 de bregma) (figure 4A).
  6. Stimuler l'IL évoquer PEF dans le BLA. Les données indiquées sur la figure 4 a été acquis avec les paramètres suivants: une impulsion de stimulation de 0,3 msec, en utilisant une intensité de stimulation qui correspond à 40% de l'intensité de courant minimum qui évoque une réponse de champ maximale (sur la base d'une courbe d'entrée-sortie déterminé avant collecte de données de base), livré toutes les 15 secondes.
  7. Recueillir des données de base pour un minimum de 10 - 15 min avant de provoquer la plasticité synaptique.
    REMARQUE: Le protocole utilisé pour évoquer la plasticité synaptique variera selon les exigences des expériences et doivent être soigneusement sélectionnés par chaque expérimentateur. Les données sur la figure 4C montre les changements du PEF suivant 3 rafales de 100 impulsions à 50 Hz (2 sec), avec 20 sec intervalles inter-burst à l'intensité de courant minimum qui évoquentD la réponse maximale du champ.
  8. Mesurer l'amplitude de l'EFP comme la différence entre la moyenne d'une fenêtre msec 5 avant l'artefact de stimulation et de la moyenne d'une fenêtre de 5 ms environ 20 à 25 ms après l'artefact de stimulation, ce qui correspond au pic négatif du potentiel de champ. Normaliser les données de référence et de définir la moyenne de 10 min de base de 100%. Utilisez les amplitudes EFP moyennes d'une autre période de 10 minutes après la plasticité induction (par exemple, 40 - 50 min après l'induction) pour évaluer les changements à long terme dans EFP amplitude.
  9. Après la fin de l'enregistrement décapite l'animal anesthésié et extraire le cerveau. Préparer le tissu pour vérification histologique du placement des électrodes.

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Résultats

Cet article donne des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant VNS apprentissage en combinaison avec d'extinction à réduire l'expression de la réaction de peur conditionnée chez le rat. Pour les jours 1 et 2 (auditif conditionnement de la peur), les rats ont été formés sur une tâche peur de conditionnement auditif dans lequel footshocks ont été jumelés avec un ton. Le Jour 3 (Pré Traitement Test), les tons ont été présentés en l'absence de footshocks pour mesurer les niveaux de congélation...

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Discussion

Nous présentons ici un protocole qui est utilisé pour faciliter l'extinction de la peur conditionnée au cours d'une seule séance d'exposition à des indices conditionné 19 et de moduler la plasticité dans la voie entre le cortex infralimbic et l'amygdale basolatérale qui peuvent servir de médiateur extinction apprentissage 20. Une étape cruciale pour le succès de ce protocole est la bonne livraison de VNS pendant la formation de l'extinction. Par conséquent, une attention particu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents ou de conflits.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par l’Institut national de la santé mentale MH 086960-01A1 (Christa K. McIntyre).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alcool
AtropineFisherA0132-5G
BétadineHenry Schein69066950
Peroxyde d’hydrogène  ;CVS209478
KétamineHenry Schein  ;1129300
MarcaineHenry Schein6312615
Huile minéraleCVS152355
NeosporinCVS629451
OxygenHome Depot304179
PennicillinFisherPENNA-10MU
PropaneHome Depot304182
XylazineHenry Schein4019308
Tools
Jewelery TorchSmith Equipment23-1001D
Aiguille à coudreWalgreens441831
#5 Forceps (2)Fine Science Tools11254-20
Fer à souderHome Depot  ;
AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit imprimé Boom Stéréo Microscope + 144 LEDAmScopeSM-4TX-144A
Helping HandsA-M Systems  ;726200
Porte-lame de scalpelOutils de science fine10003-12
Lime en métalHome Depot6601
RègleHome Deopt202035324
Hémostats incurvés  ;Outils de science fine130009-12
Ciseaux finsOutils de science fine14058-09
Spatulede science
Petit tournevisHome Depot646507
Fixateur magnétique Système de rétractionOutils de science fine18200-04, 18200-01, 18200-05
Coussin chauffantWalgreens30294
TondeusesWalgreens277966
SharpieAgrafes125328
Pince à anneauOutils scientifiques fins11103-09
Outils en verre micropipette personnalisés (forme en J et droits) - Verre borosilicatéInstrumentSutter B150-110-10
Pince AdsonOutils scientifiques fins11006-12
Brassards
TubeBraintree Scientific IncMRE-065
Platine Iridium FilMedwire10IR9/49T
Broches en orMill-Max1001-0-15-15-30-27-04-0
Fil de sutureHenry Schein100-5797
22 G aiguillesFisher  ;14-815-525
Ruban de papierFisher  ;03-411-602
SoudureHome Depot327793
Flux  ;Home Depot300142
Lame de scalpel, 10 ou 15Stoelting52173-10
Tube de laboratoire silastique .51 mm ID x .94 mm ODFisher  ;508-002
Pièces de connecteur d’embouts (mâle)Omnetics Connector CorporationA25001-004
Pièces d’embouts
Teets Dental Acrylic, Liquid and PowderA-M Systems525000, 526000
1016882   ;
Vis à os chirurgicaux
Stoelting+CB33 :C6151457
Lames de scalpel, 10 ou 15Stoelting52173-10
Seringues de 1 mlFisher14-826-261
Aiguilles de 22 gFisher  ;14-815-525
Aiguilles de 27 gFisher14-826-48
Gaze Fisher 2 » x 222-362-178
ÉcouvillonsFisher19-120-472
Coussinets pour chiotsPetCo1310747
Kim LingettesFisher06-666-A
Réglage de la chambre et du comportement  ;
Armoire de base avant en métal Husky (30WX19DX34H)Home Depot100607961
Barrière silencieuse et timide ; Matériau d’insonorisation HD (feuille) (PSA)soundproofcow.com10203041
Panneau en mousse acoustique alvéoléesoundproofcow.comStimulateur d’impulsions isolé 10432400
modèle 2100A-M Systems720000
Appareil photo numérique - Logitech Webcam C210LogitechB003LVZO88
MatLabMathworks.com
Sinomètre 10 MHz Oscilloscope monocanalSinomètreCQ5010C
OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap LightOXYLEDB00GD8OKY0
5k ohm potentiomètreAlpha ElectronicsB00CTWDHIO
Extech 407730 Sonomètre numérique 40 à 130 décibelsExtech InstrumentsB000EWY67W
DSCK-C Dual Output, brouillé shockerKinder Scientific Co
203525863 Outils fine (femelle)Omnetics Connector Corporation A24001-004 Agrafes en fil de cuivre solide de calibre 26  »

Références

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