Etudier la fonction des protéines et le rôle de Altered Expression des protéines par les interférences des anticorps et des reconstructions tridimensionnelles

Résumé

Le contrôle de l’expression des protéines est non seulement essentiel à chaque organisme vivant, mais constitue également une stratégie importante pour étudier les fonctions des protéines dans des modèles cellulaires. Le protocole présenté montre l’application de l’interférence des anticorps dans les cellules de mammifères, y compris les neurones primaires de l’hippocampe, et démontre l’utilisation de reconstructions tridimensionnelles dans l’étude de la fonction des protéines.

Résumé

Une gestion rigoureuse de l'expression protéique est non seulement essentiel pour tout organisme vivant, mais aussi une stratégie importante pour étudier les fonctions des protéines dans des modèles cellulaires. Par conséquent, la recherche récente a inventé des outils différents pour cibler l'expression de protéines dans des lignées de cellules de mammifère ou même des modèles animaux, y compris l'ARN et l'interférence d'anticorps. Alors que la première stratégie a recueilli beaucoup d'attention au cours des deux dernières décennies, les peptides médiatrices une translocation de cargaisons d'anticorps à travers les membranes cellulaires et dans les cellules, obtenues beaucoup moins d'intérêt. Dans cette publication, nous fournissons un protocole détaillé comment utiliser un vecteur peptidique nommé Chariot à cellules rénales embryonnaires humaines, ainsi que dans les neurones hippocampiques primaires de réaliser des expériences d'interférence d'anticorps et illustrent en outre l'application des reconstructions tridimensionnelles dans l'analyse de la fonction des protéines. Nos résultats suggèrent que Chariot est, sans doute en raison de son signal de localisation nucléaire, particularly bien adapté à des protéines cibles résidant dans le soma et le noyau. Remarquablement, lors de l'application Chariot à des cultures hippocampiques primaires, le réactif est avéré être étonnamment bien accepté par les neurones dissociés.

Introduction

Un contrôle strict de l'expression des protéines est essentiel pour tous les organismes vivants pour commander son propre développement ainsi que de réagir à des signaux environnementaux. Par conséquent, une multitude de mécanismes a été inventé au cours de l'évolution pour réguler avec précision le niveau de chaque protéine codée par l'application d'expression. 20.000 gènes existants dans une cellule eucaryote à un moment donné de sa vie. Prenant place à différents stades de la production de protéines, des mécanismes de régulation vont de la gestion de la structure de la chromatine, la transcription et l'ARN manipulation à la direction des modifications post-traductionnelles des protéines, du transport et de la dégradation.

Il est donc pas surprenant que des dysfonctionnements dans le sous-jacent mécanismes moléculaires et les niveaux d'expression de protéines modifiées ont été associées à diverses maladies comme le cancer ou une déficience intellectuelle. En effet, en regardant la complexité exceptionnelle de développement neuronal et la fonction cérébrale chez les mammifères, la sensitivité de ces systèmes sophistiqués à des altérations de l'expression de la protéine se manifeste dans plusieurs déficits intellectuels bien connus, y compris la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson (AD et PD), ainsi que des troubles du spectre autistique (TSA) comme le syndrome du X fragile (FXS). Cette dernière maladie est caractérisée par une mauvaise expression d'une large variété de protéines, qui est due à la perte de la régulation de la traduction d' une seule protéine, FMRP (Fragile X Protéines arriération mentale) ^1-4. En outre, des réarrangements chromosomiques affectant la charge variable liée à l' X protéine A (VCXA), une protéine, qui gère la stabilité de l' ARNm et la traduction en modifiant l' ARNm de coiffage ^5, ont récemment été associée à des déficits intellectuels, alors que des mutations ponctuelles ne sont pas identifiés chez les patients ayant une déficience cognitive dès maintenant ^{6, 7,} ce qui suggère que les déficiences mentales observées proviennent de l' expression VCXA altérée et l' expression dérégulée de son prote cibleins. Conformément à ces résultats, une étude enquête pour déterminer si de novo du nombre de copies des variations de gènes sont associés à ASD a établi que les nouveaux duplications de gènes et les suppressions sont un facteur de risque important pour les TSA ^8, soutenant ainsi l'idée que les niveaux d'expression de protéines élevés ou diminués peuvent causer déficits intellectuels.

De manière remarquable, la recherche récente a fourni une preuve supplémentaire que le niveau d'une protéine donnée d'expression est réglée avec précision pour empêcher son agrégation en raison des quantités élevées de protéines presque sans marges de sécurité ^9. Il a donc été proposé que même de faibles augmentations sont suffisantes pour induire des maladies telles que la MA et MP ^9. Bien que la variété des mécanismes moléculaires contribuant à la maîtrise de l' expression des protéines suggère un système de régulation complexe à la lumière de ces résultats, une étude sur le niveau de plus de 5000 gènes de mammifères ¹⁰ d'expression a démontré quela nature a préféré un système plus parcimonieuse: L'abondance cellulaire des protéines a été montré pour être principalement réglementé au niveau de la traduction ^10, illustrant ainsi que la gestion de la disponibilité de l' ARN sert principalement à affiner l' expression des protéines.

L'étude de la dose de protéines d'intérêt (POI) est donc non seulement important pour la compréhension des fonctions endogènes d'une protéine, mais aussi à l'enquête de nombreuses maladies et le développement de thérapies. Ainsi, les dernières décennies ont vu l'avance de plusieurs stratégies en utilisant l'interférence ARN pour manipuler le dosage de POI. Bien que l' interférence ARN est largement utilisé pour étudier la fonction des protéines et est même appliquée dans les essais cliniques pour traiter les maladies cancéreuses ou oculaires ainsi que de poursuivre les traitements antiviraux chez les patients ^11-13, certaines difficultés peuvent surgir qui pourrait rendre la stratégie impossible. Par exemple, la séquence d'amorçage, qui entraîne l'effet de choc par homologie est comparaeffets à court, donc la promotion hors-cible ble. Depuis des séquences hautement efficaces sont rares et doivent être trouvées parmi des milliers d'options (revue dans ^14), l' identification de la bonne séquence peut prendre beaucoup de temps et coûteux, mais les résultats peuvent encore être décevants.

Une autre stratégie consiste à cibler directement le POI par des anticorps. Ici, nous illustrons l'utilisation du Chariot de support protéique (fabriqué par Active Motif) pour réduire la disponibilité des protéines cellulaires, et l'emploi des reconstructions en trois dimensions pour étudier la fonction de la protéine suivante knock-down.

Le motif actif de Charlot, elle - même un peptide de 2,8 kDa, on utilise des peptides de navette, des protéines et des anticorps à travers les membranes des cellules de mammifères ^15. Les associés de peptides avec POIs en formant de manière non covalente couplé complexes macromoléculaires utilisant des interactions hydrophobes, après quoi les complexes Chariot-POI sont internalisés dans les cellules dans un endosome-indmanière ependent. Surtout, Charlot a été indiqué ni affecter la localisation intracellulaire des protéines de la navette, ni d'exercer des effets cytotoxiques ou pour affecter l'activité biologique de la cargaison ^15.

Protocole

1. Solutions mères

1. Remettre en suspension la poudre de motif actif lyophilisé dans H ₂ O stérile jusqu'à une concentration finale de 2 ug / ul. Appuyez soigneusement pour mélanger.
2. Préparer les petites aliquotes (par exemple, 12 ul chacune, 2 ul sont nécessaires par réaction) et les stocker à -20 ° C.

2. Préparation de cellules

1. Semence des cellules de mammifères telles que des cellules HEK293 ou des neurones primaires sur un milieu de croissance plaque à 24 puits dans 500 ul y compris les antibiotiques.
   REMARQUE: Lorsque vous utilisez les neurones, ensemencer les cellules à faible densité et utiliser uniquement les deux rangées du milieu de la plaque de 24 puits. Chaque puits aura donc une contrepartie vide pour abriter le milieu pendant l'incubation (étape 4.2). Lors de la manipulation des neurones, assurez-vous toujours que les cellules ne sont pas conservés à l'extérieur de l'incubateur pendant plus de quelques minutes.
2. Cultiver les cellules dans des conditions appropriées (humidifiés, 5% de CO ₂ et 37 ° C) jusqu'à ce que les cellules sont appli. 50%confluent.
   REMARQUE: Lorsque vous utilisez les neurones, la culture des cellules jusqu'à ce que le stade de développement souhaité est atteint et changer app. 25 à 50% du milieu deux fois par semaine. Medium: milieu Neurobasal (contenant 1x B27, 5 mM de L-glutamine et 1x Pénicilline et streptomycine; comparer avec ref 16).

3. Chariot complexe Formation

1. Par réaction, on dilue 0,1-2 ug du point d'intérêt ou de l'anticorps correspondant, ainsi que la protéine de contrôle ou d'un anticorps témoin, respectivement, dans 50 ul de PBS.
   NOTE: La technique fonctionne également avec des complexes macromoléculaires comprenant des anticorps primaires et secondaires pré-lié (cp 'Résultats représentatives, de la figure 1.). Mélanger et de spin.
2. Pour chaque échantillon, diluer 2 pl Chariot solution mère dans 50 pi de PBS en utilisant des tubes séparés afin d'éviter l'auto-association de Chariot. Mélanger et de spin.
3. Transférer le POI ou de l'anticorps (étape 3.1) diluée à la dilution Chariot par pipetteting. Mélanger et de spin.
4. Incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante (complexes Chariot-POI formeront).

4. Transfection de cellules

1. Diluer les complexes Chariot (étape 3.4) dans 100 ul de milieu de croissance préchauffé (37 ° C, sans additifs). Retirer le milieu et laver les cellules une fois à l'aide de pré-chauffé 1x PBS.
   REMARQUE: Lorsque vous utilisez les neurones, ne jetez pas le moyen, il sera réutilisé. Gardez-le à 37 ° C. Pour le lavage, utiliser du PBS contenant mM _MgCl2 et _CaCl2 0,5.
   Suggestion: maintenir le milieu dans les puits vides pendant l'incubation de la plaque (étape 4.5).
2. Appliquer la solution complexe Chariot (étape 4.1) aux cellules et basculer les cellules doucement pour assurer une distribution uniforme de la solution. Cultiver les cellules dans des conditions standard (étape 2.2) pendant 1 heure. Ajouter du sérum à une concentration finale de 10%. Lors de l'utilisation des neurones, ajouter le milieu de l'étape 4.1. Cultiver les cellules pendant 1 à 2 heures de plus.
   Noter lala durée d'incubation optimale dépend de la taille et les propriétés de la cargaison et il peut être nécessaire d'ajuster de manière empirique. Les suggestions suivantes peuvent servir de guide: Pour les peptides, 1 h est généralement suffisante, pour les protéines sont recommandées 1-2 h, pour les anticorps 2 heures, et pour la transfection de neurones avec des anticorps 4 h.
3. cellules de processus d'analyse, comme d'habitude. S'il vous plaît noter: la technique est compatible avec des expériences en utilisant des protocoles de fixation ainsi que l'imagerie en direct.

5. Imaging

1. L'utilisation d'un microscope à balayage laser, prenez z-piles de cellules et / ou des compartiments cellulaires d'intérêt à l'aide d'environ 0,25-0,5 um de distance. La distance de la couche dépend de la taille de la structure à reconstruire et doit être déterminée individuellement.

6. Reconstruction

1. Dans les étapes suivantes, utilisez le fond Echap pour basculer entre Sélectionner et Navigate, Cntr pour sélectionner plusieurs objets en cliquant on eux et touche shift pour couper des objets (cp. étape 6.10).
2. Ouvrez le LSM-fichier dans Imaris.
3. Utilisation du réglage de l'affichage pour chaque canal, contraster l'image jusqu'à ce que les structures les plus brillants atteignent la saturation. S'il vous plaît noter que cet ajustement ne sera pas influer sur la construction de la surface, il ne sert à aider l'expérimentateur dans seuillage l'image.
4. Cliquez sur l'icône Ajouter de nouvelles surfaces. Un assistant ouvrira.
5. Sélectionnez: Segment seulement une région d'intérêt. Passez à l'étape suivante.
6. Ajustez les marges de la boîte de sélection pour adapter votre objet d'intérêt. S'il vous plaît garder à l'esprit que l'image a 3 dimensions et que la sélection doit être ajusté au plan z ainsi. Si la forme rectangulaire de la boîte de sélection ne doit pas correspondre à l'objet d'intérêt correctement, mettez l'objet et / ou agrandir la boîte jusqu'à ce que toutes les structures nécessaires sont intégrées. objets indésirables peuvent être enlevés plus tard (cp. étape 6.10). Procéder.
7. Sélectionnez le ch appropriéannel. Le détail Surface Level ou le diamètre de la sphère devraient être fixés pour correspondre aux structures en cours de reconstruction. En fonction des caractéristiques du signal, soit l'intensité absolue ou le contraste local peuvent être utilisés. En général, le contraste local fonctionne mieux pour les signaux diffus. Dans tous les cas, les paramètres doivent être réglés séparément pour chaque signal ou une structure d'intérêt, respectivement.
8. Utilisation de l'outil Thresholding, reconstruire la structure d'intérêt.
9. Terminez la reconstruction en cliquant sur le fond de la flèche verte.
10. Réglez l'autre objet en utilisant l'outil crayon pour couper et enlever les surfaces selon les besoins. Il est seulement possible de couper dans le sens nord-sud, donc, inclinez l'image afin de couper l'objet désiré.
11. Obtenir des mesures de volume, surface et intensités pour chaque surface par Statistique sélection, statistiques détaillées et moyennes valeurs.
12. (Étape optionnelle) Pour observer les statistiques de couleur (cp. Figure 2E et F), sélectionnez l'onglet de couleur de la surface correspondante et marquer " La statistique Coded ' au lieu de' base '. Plusieurs options seront affichées.

Résultats

Dans les paragraphes suivants, des résultats exemplaires illustrant un effet de choc fonctionnel d'un POI (Simiate, pour plus de détails s'il vous plaît voir ^{16, 17)} en utilisant le réactif de Chariot et l' interférence d'anticorps sont présentés. Les résultats démontrent que l'expression réduite de Simiate altère l'activité de la transcription, et, d'une manière dépendante de la dose, induit l'apoptose, aboutissant à des taux supérieurs à 99% de mortalité si des quantités d'anticorps pl...

Discussion

Ici, nous présentons un protocole visant à étudier l'importance des niveaux d'expression de la protéine dans le contrôle des fonctions cellulaires d'une manière dose entraînée. Le protocole décrit permet une manipulation fine de l'expression des protéines dans divers types de cellules de mammifères, y compris les neurones hippocampiques, facilitant ainsi des études détaillées de la fonction des protéines au niveau cellulaire.

Bien que l' interférence ARN représente une st...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chariot	Active Motif	30025	magasin à -20 ° ; C
Neurobasal medium	Life technologies	21103-049	échauffer jusqu’à 37 ° ; C avant d’utiliser
1x les technologies B27	Life	17504044	se conservent à -20 ° ; C
L-glutamine	Life technologies	25030-149	se conserve à -20 ° ; C
Pénicilline et Streptomycine	Life technologies	15140-122	se vendent à -20 ° ; Logiciel C
Imaris	Bitplane	n.a.Microscope	coûteux, mais inégalé
	Zeiss	n.a.