Etudier la fonction des protéines et le rôle de Altered Expression des protéines par les interférences des anticorps et des reconstructions tridimensionnelles

Résumé

Le contrôle de l’expression des protéines est non seulement essentiel à chaque organisme vivant, mais constitue également une stratégie importante pour étudier les fonctions des protéines dans des modèles cellulaires. Le protocole présenté montre l’application de l’interférence des anticorps dans les cellules de mammifères, y compris les neurones primaires de l’hippocampe, et démontre l’utilisation de reconstructions tridimensionnelles dans l’étude de la fonction des protéines.

Résumé

Une gestion rigoureuse de l'expression protéique est non seulement essentiel pour tout organisme vivant, mais aussi une stratégie importante pour étudier les fonctions des protéines dans des modèles cellulaires. Par conséquent, la recherche récente a inventé des outils différents pour cibler l'expression de protéines dans des lignées de cellules de mammifère ou même des modèles animaux, y compris l'ARN et l'interférence d'anticorps. Alors que la première stratégie a recueilli beaucoup d'attention au cours des deux dernières décennies, les peptides médiatrices une translocation de cargaisons d'anticorps à travers les membranes cellulaires et dans les cellules, obtenues beaucoup moins d'intérêt. Dans cette publication, nous fournissons un protocole détaillé comment utiliser un vecteur peptidique nommé Chariot à cellules rénales embryonnaires humaines, ainsi que dans les neurones hippocampiques primaires de réaliser des expériences d'interférence d'anticorps et illustrent en outre l'application des reconstructions tridimensionnelles dans l'analyse de la fonction des protéines. Nos résultats suggèrent que Chariot est, sans doute en raison de son signal de localisation nucléaire, particularly bien adapté à des protéines cibles résidant dans le soma et le noyau. Remarquablement, lors de l'application Chariot à des cultures hippocampiques primaires, le réactif est avéré être étonnamment bien accepté par les neurones dissociés.

Introduction

Un contrôle strict de l'expression des protéines est essentiel pour tous les organismes vivants pour commander son propre développement ainsi que de réagir à des signaux environnementaux. Par conséquent, une multitude de mécanismes a été inventé au cours de l'évolution pour réguler avec précision le niveau de chaque protéine codée par l'application d'expression. 20.000 gènes existants dans une cellule eucaryote à un moment donné de sa vie. Prenant place à différents stades de la production de protéines, des mécanismes de régulation vont de la gestion de la structure de la chromatine, la transcription et l'ARN manipulation à la direction des modifi....

Protocole

1. Solutions mères

1. Remettre en suspension la poudre de motif actif lyophilisé dans H ₂ O stérile jusqu'à une concentration finale de 2 ug / ul. Appuyez soigneusement pour mélanger.
2. Préparer les petites aliquotes (par exemple, 12 ul chacune, 2 ul sont nécessaires par réaction) et les stocker à -20 ° C.

2. Préparation de cellules

1. Semence des cellules de mammifères telles que des cellules HEK293 ou des neurones primaires sur un milieu de croissance plaque à 24 puits dans 500 ul y compris les antibiotiques.
   REMARQUE: Lorsque vous utilisez les neurones, ensemencer les cellule....

Résultats

Dans les paragraphes suivants, des résultats exemplaires illustrant un effet de choc fonctionnel d'un POI (Simiate, pour plus de détails s'il vous plaît voir ^{16, 17)} en utilisant le réactif de Chariot et l' interférence d'anticorps sont présentés. Les résultats démontrent que l'expression réduite de Simiate altère l'activité de la transcription, et, d'une manière dépendante de la dose, induit l'apoptose, aboutissant à des taux supérieurs à 99% de mortalité.......

Discussion

Ici, nous présentons un protocole visant à étudier l'importance des niveaux d'expression de la protéine dans le contrôle des fonctions cellulaires d'une manière dose entraînée. Le protocole décrit permet une manipulation fine de l'expression des protéines dans divers types de cellules de mammifères, y compris les neurones hippocampiques, facilitant ainsi des études détaillées de la fonction des protéines au niveau cellulaire.

Bien que l' interférence ARN représente une st.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chariot	Active Motif	30025	magasin à -20 ° ; C
Neurobasal medium	Life technologies	21103-049	échauffer jusqu’à 37 ° ; C avant d’utiliser
1x les technologies B27	Life	17504044	se conservent à -20 ° ; C
L-glutamine	Life technologies	25030-149	se conserve à -20 ° ; C
Pénicilline et Streptomycine	Life technologies	15140-122	se vendent à -20 ° ; Logiciel C
Imaris	Bitplane	n.a.Microscope	coûteux, mais inégalé
	Zeiss	n.a.

à balayage laser