Les techniques traditionnelles de fixation de la tête ont utilisé des cadres métalliques fixés sur le crâne comme interface pour les appareils de fixation de la tête. Ce protocole fait la démonstration d’une technique de fixation de la tête sans cadre, basée sur le moulage en résine acrylique, pour les tâches comportementales chez les rongeurs.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Acrylique mouler à base Chef Fixation Technique chez les rongeurs
Dans cet article
Résumé
Résumé
La fixation de la tête est une technique d’immobilisation de la tête d’un animal en fixant un poteau de tête sur le crâne pour un serrage rigide. La fixation traditionnelle de la tête nécessite la fixation chirurgicale de cadres métalliques sur le crâne. Les cadres fixés sont ensuite fixés à une plate-forme fixe, ce qui entraîne l’immobilisation de la tête. Cependant, les cadres métalliques pour la fixation de la tête ont été techniquement difficiles à concevoir et à mettre en œuvre dans un environnement de laboratoire général. Dans cette étude, nous proposons une nouvelle méthode de fixation de la tête. À l’aide d’une barre de fixation de la tête sur mesure, le support de tête est construit lors de la chirurgie d’implantation. Après l’application de résine acrylique pour la fixation d’implants tels que des électrodes et une canule sur le crâne, des résines supplémentaires appliquées par-dessus cela pour construire un moule correspondant à l’orifice de la barre de fixation. Le monteur de tête moulé sert de rails de guidage, les enquêteurs fixent commodément la tête de l’animal en insérant le monteur de tête dans le port de la barre de fixation. Cette méthode pourrait être facilement applicable si une chirurgie d’implantation utilisant des acryliques dentaires est nécessaire et pourrait être utile pour les laboratoires qui ne peuvent pas facilement fabriquer des tenons de tête métalliques usinés CNC.
Introduction
Tête fixation ou de la tête de retenue est une technique d'immobiliser la tête de l'animal par la fixation d'une plaque ou cadre sur le crâne de serrage rigide. La technique a été adopté pour la stimulation sensorielle précise, détection comportementale avec ou sans l'enregistrement de neurones chez les animaux éveillés et 1-3 pour l'étiquetage juxtacellulaire pendant le cycle veille-sommeil 4. Il est également utilisé pour l'imagerie cérébrale in vivo 5,6. Maintenant technique tête de fixation est un outil couramment utilisé dans les neurosciences et la recherche comportementale.
Fondamentalement, la fixation de la tête traditionnelle nécessite la fixation chirurgicale de Metal Head-postes sur le dessus du crâne 6-8. Les pièces jointes sont ensuite serrées à une plate-forme fixe, entraînant l'immobilisation de la tête. La recherche neurophysiologique chez les animaux éveillés tels que neuronal et / ou enregistrement optique, le cerveau intervention de circuits, l'imagerie cérébrale est accompagné par la chirurgie d'implantation en utilisant acryliques dentaires. Donc,il semble une tâche simple à mettre en œuvre la fixation de la tête dans les laboratoires quand il est expérimentalement nécessaire. Les cadres doivent être conçus pour être légers et assez petit pour ne pas déranger le comportement naturel de l'animal dans leurs cages à domicile. Il fournit également la rigidité mécanique lors du serrage de la plate-forme stationnaire. Il a en outre biocompatibilité selon fins expérimentales. Par conséquent, il est techniquement difficile de concevoir et fabriquer ces tête-postes dans les équipements de laboratoire en général.
Dans cette étude, une méthode tête de fixation roman est décrit, offrant une rigidité mécanique par serrage pratique sans utiliser Metal Head-postes. En utilisant la méthode, la tête de fixation pourrait être fait dans les conditions générales de laboratoire, où la chirurgie d'implantation est généralement effectuée chez les rongeurs pour l'étude du cerveau. Les tête-poteaux métalliques sont remplacés par ciment acrylique moulé en résine partiellement par une barre tête fixation faite sur mesure et le processus de moulage est fait pendant IMPLANchirurgie de mise. La barre de fixation offre une grande compatibilité spatiale avec d'autres implants, comme les sondes d'enregistrement de neurones, des électrodes de stimulation. En outre, il simplifie les étapes consistant à serrer la tête de l'animal sur la plate-forme de fixation en enlevant vissage. Nous avons utilisé cette méthode dans l'étude comportementale précédente et nous avons conclu que cette méthode est facile à mettre en œuvre et pratique dans l'expérimentation pratique 9.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Déclaration d'éthique:
Cette expérience a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Kyungpook National University, et a été réalisé conformément aux guides pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Institut national de la Santé, 1996). Après l'expérience, les animaux ont été sacrifiés sous dioxyde de carbone de l'euthanasie.
1. Conception du Barreau du chef-fixation pour rats
Remarque: Cette étape est un guide général pour une conception de barre de fixation. Toute modification de la dimension et de matériel est possible en fonction des animaux ou des implants. Concevoir un bar-tête de fixation à l'aide de logiciels de CAO est recommandé, mais pas nécessaire.
- Utilisez un logiciel de CAO pour concevoir une barre de fixation.
- Concevoir une barre de fixation de forme rectangulaire (123 x 35 x 6 mm) (figure 1A). Faire une entaille rectangulaire (16 x 20 mm; le port) dans le milieu de la barre de fixation. Ajouter des pentes ou des indentations which servir comme un rail de guidage sur les frontières du port (figure 1A-un, figure 1B -arrows).
REMARQUE: Assurez-vous que la zone du port couvre le rectangle approximative du crâne de rat sur le cerveau pour permettre des accès verticaux en utilisant un manipulateur stéréotaxique à la plupart des zones du cerveau à travers une craniotomie. - Attacher des plaques (50 x 20 x 6 mm) avec deux trous d'ancrage allongées des deux côtés de la barre de fixation. Assurez-vous que ces trous passent vis de 6 mm de diamètre (figure 1A-d). Faire un trou d'un diamètre de 3 mm en face du port pour un crochet de verrouillage (figure 1A-b).
- Faire une boîte ayant un plancher (135 × 305 mm) et des parois latérales (305 × 76 mm). Percer deux trous 6 mm de diamètre comme illustré sur la figure 1A (encadré). Ajouter murs de soutènement sur la barre de fixation (figure 1A-e).
- Concevoir une barre de fixation de forme rectangulaire (123 x 35 x 6 mm) (figure 1A). Faire une entaille rectangulaire (16 x 20 mm; le port) dans le milieu de la barre de fixation. Ajouter des pentes ou des indentations which servir comme un rail de guidage sur les frontières du port (figure 1A-un, figure 1B -arrows).
- Fabrication de la barre conçu et boîte et assembler chacun d'entre eux utilisant cyanoacrylateillustré à la figure 1A (en médaillon). Assemblez la barre sur la boîte à l'aide de vis de 6 mm de diamètre. Appliquer la pente en ajustant la position de la vis de la barre de fixation ergonomique de la tête (figure 1A-encadré).
NOTE: Pour les souris, la dimension de la barre de fixation est de 60 × 20 × 4 mm (constitué de deux couches de 2 mm panneaux acryliques épais). Le port est carré de 8 mm de largeur (supérieur) et 9 x 10 mm (en bas), comme illustré à la figure 1C. Plaques d'ancrage ont la même taille de rats. Les parois de la plaque de boîte et secondaires sont de 100 x 72 mm et 100 x 50 mm, respectivement.
2. Chef Mounter construction pendant une chirurgie d'implantation
ATTENTION: Soyez prudent lorsque vous traiter avec de la résine acrylique dentaire. Le liquide peut provoquer une irritation de la peau. Mettez un masque et des gants. Travailler dans un endroit bien ventilé.
- Préparation avant la chirurgie
- Envelopper la frontière du port de la barre de fixation à l'aide APle film araffin pour empêcher l'adhérence de la résine acrylique appliquée à la barre (voir Figure 1B et figure 2A). Manteau de la frontière du port recouverte par le film de paraffine avec une fine couche de résine acrylique.
- Utilisez instruments chirurgicaux stérilisés. Désinfectez soigneusement cadre stéréotaxique et ses environs avec de l'alcool éthylique à 70%.
- Effectuer la chirurgie d'implantation stéréotaxique
- Anesthésier un animal par injection intraperitoneale d'un mélange de cocktail (2 ml / kg) 10 ml de kétamine (50 mg / ml), le chlorhydrate de xylazine (1,5 ml 23,32 mg / ml) et 2,5 ml de solution saline. Assurez-vous que l'animal totalement anesthésié et ne répond pas à la queue et des orteils pincées. Injecter mélange cocktail de 1 ml / kg pendant la chirurgie si nécessaire.
- Fixer l'animal à l'appareil de stéréotaxie. Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant la chirurgie. Rasage et nettoyer le cuir chevelu avec 70% d'éthanol. Donnez injection sous-cutanée de 2% de lidocaïne et inciser le scale long de la ligne médiane lp du crâne. Complètement gratter le périoste. Rincez avec une solution saline à plusieurs reprises.
- Assurez forage bavure trou près de la jante du crâne. Vis d'implant 4-5 tours (jusqu'à 1 mm de profondeur) de la surface du crâne pour éviter une rupture de la dure-mère. Assurez-vous pas de fuite de LCR et le sang sur la surface du crâne après avoir vis implantation. Rincez avec une solution saline et sécher la surface du crâne à l'aide d'air bouffée, en particulier autour des vis.
- Manteau surface du crâne avec une fine couche de "adhésif dentaire (Super-Bond C & B)". Ne pas couvrir entièrement la surface du crâne, y compris l'bregma électrode supplémentaire si l'implantation est prévue. Utilisez le bregma pour le marquage coordonnées craniotomie. Électrodes et / ou microdrive implant et le fixer sur le crâne par application de résine acrylique autour d'elle.
- Appliquer la résine acrylique supplémentaire sur le dessus du ciment dentaire. Utilisez la quantité appropriée de résine acrylique à laisser un espace de remplissage de départ suffisant entre bar revêtu d'une résined résine de montage initial lorsque les vis fixateur et / ou des électrodes (Figure 2A).
- Place Bar-tête de fixation de 5 mm ou plus au-dessus de la surface du crâne et d'aligner son centre (figure 2A -Gauche).
- Appliquer la résine acrylique dans l'écart entre la base du crâne et résines montage initial. (Figure 2A -Center). Attendez jusqu'à ce que la résine devenir dur.
- Retirer oreille-bar et tirez le monteur moulé sur le port de barre de fixation. (Figure 2A -Droit). Appliquer une résine acrylique avec précaution supplémentaire autour des rails de bord du dispositif de montage moulé si nécessaire.
- Rincer la surface de la plaie du cuir chevelu avec une solution saline stérile. Injecter un antibiotique (enrofloxacine, 5 mg / kg sc) et un (le tartrate de butorphanol, 2 mg / kg sc) immédiatement après la chirurgie analgésique. Maison de l'animal individuellement dans une seule cage.
3. habituer les animaux au chef-fixation
Remarque: Cette étape describes horaires d'habituation empiriquement fondées sur des évaluations réussies des auteurs. Pour un aperçu de la procédure d'accoutumance pour la tête-fixation, voir le travail de 11 de 10 Schwartz ou Guo.
- Donnez période de récupération suffisante (une semaine ou plus) pour les animaux. Le Jour 1, manipuler les animaux fréquemment sur de courtes sessions divisées.
- Le lendemain (Jour 2), d'exposer l'animal à l'environnement de fixation (boîte). Ne pas insérer leur monteur de la tête dans le port de la barre de fixation. Laissez les animaux pour vous habituer à l'environnement. Solidement saisir le monteur de la tête en utilisant la main pour de 1 à 2 secondes et le relâcher immédiatement. Répétez à court terme par la fixation de la main-appui à plusieurs reprises.
- Le Jour 3, habituer les animaux à la tête de fixation.
- Apportez les animaux des cages à domicile et de les régler dans la boîte de diriger la tête vers le port de la barre de fixation. Prenez le monteur de la tête et l'insérer dans le port de la barre de fixation.
- Liez le monteur (animal detête) au crochet de verrouillage de la barre de fixation à l'aide d'une bande de caoutchouc. Support pour 5 min.
REMARQUE: Ne touchez pas le tronc ou de la queue de l'animal après la fixation, ce qui conduit l'animal à grincer et de la lutte de plus en plus le stress de l'animal. Lorsque l'animal continue luttant plus de 1 min, libérer et essayer plus tard. De cette étape, les animaux montrent urine et les fèces excrétion chaque fois exposée à la tête de fixation, mais cela devient progressivement réduite habituation produit. - Récupérer la bande de caoutchouc de verrouillage et éjecter le monteur sur le port. Mettez les animaux dos à la cage de la maison et de fournir un morceau de céréales ou une graine de tournesol dans la cage de la maison comme une récompense. Le prochain procès commence dans 30 minutes. Répétez 3.4.1 à 3.4.4 cinq ou plus en une journée.
- Le Jour 4 à 7, exposer l'animal à la tête de fixation comme décrit dans le protocole 3.4. Augmenter progressivement la durée de la tête de fixation (10 min, 20 min, 30 min et 50 min en habituation produit).
NOTE: Si les animaux ne fontt charge la récompense alimentaire, il peut être un signe d'un niveau élevé de stress. Ne pas augmenter le temps de fixation. Si les animaux révèlent des manquements répétés aux prises comportement, habituer eux pour une période plus longue. - Vérifiez le poids du corps de l'animal par jour. Considérez accoutumance échoue lorsque le poids corporel diminue. Procéder à des tâches comportementales avec la tête de fixation après accoutumance succès.
REMARQUE: Succès accoutumance facilite la formation comportementale ultérieure (Figure 3E et F).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Cette méthode tête de fixation est applicable à la fois aux rats et les souris. Nombre de huit rats ont reçu une implantation bilatérale des électrodes de stimulation dans le faisceau médial du télencéphale. Pour quatre d'entre eux, des électrodes de mesure de tungstène (fils de Microdrives) ont été implantées en outre dans la zone de la patte avant M1 (figure 2C). Pour les souris (n = 2), quatre électrodes en fil d'acier inoxydable ont été implantés dans les zones corticales frontales / occipit...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Ce protocole démontre une méthode simple et pratique de fixation de la tête à l’aide des matériaux disponibles. Pour une fixation de la tête physiquement réussie, les premières étapes critiques de l’opération sont de rincer et de sécher clairement la surface du crâne avant d’appliquer le ciment de résine adhésif dentaire. Deuxièmement, cette méthode n’utilise pas de vis implantées sous les muscles temporaux et ne dépend que des vis sur le crâne, leur implantation perpendiculaire contre la surface du bord du crâne est cru...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été soutenue par le Programme de recherche en sciences fondamentales par l’intermédiaire du NRF financé par le ministère de l’Éducation, de la Science et de la Technologie (2010-0022362) et (2012R1A2A2A2A02046812).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Résine acrylique dentaire | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | pour fabriquer un monteur moulé |
| Film de paraffine | Bemis | Parafilm | pour empêcher l’adhérence de la résine acrylique à la barre |
| Adhésif dentaire | Sun Medical | Super-Bond C& B | pour coller entre la résine acrylique et le crâne |
| Plexglass ou autre plaque | pour fabriquer une barre de fixation et une plate-forme de boîte | ||
| Cyanoacrylate | pour coller des plaques acryliques |
Références
- Mayrhofer, J. M., et al. Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats. J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).
- Ollerenshaw, D. R., et al. Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway. J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).
- Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats. J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).
- Lutcke, H., et al. Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice. Front Neural Circuits. 4, 9(2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Kimura, R., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. A novel method of head fixation for the study of rodent facial function. Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).
- Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice. PLoS ONE. 9, (2014).
- Osborne, J. E., Dudman, J. T. RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PLoS One. 9, e89007(2014).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
