Article de méthode

Couche par couche dépôt de collagène dans les dispositifs microfluidiques pour Microbroyeur stabilisation

DOI :

10.3791/53078

⸱

29 septembre 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospitals for Children-Boston

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La création de microtissus fonctionnels dans les dispositifs microfluidiques nécessite la stabilisation des phénotypes cellulaires en adaptant les techniques traditionnelles de culture cellulaire aux dimensions spatiales limitées des microdispositifs. La modification du collagène permet le dépôt couche par couche d’assemblages de collagène ultraminces qui peuvent stabiliser les cellules primaires, telles que les hépatocytes, en tant que modèles de tissus microfluidiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bien que la microfluidique offre un contrôle exquis du microenvironnement cellulaire, la culture de cellules dans des dispositifs microfluidiques peut être challenging. 3D la culture de cellules dans des gels de collagène de type I aide à stabiliser la morphologie et la fonction cellulaires, ce qui est nécessaire pour créer des modèles de tissus microfluidiques dans des microdispositifs. Il est souvent difficile de traduire les techniques de culture 3D traditionnelles pour les plaques de culture tissulaire en dispositifs microfluidiques en raison des dimensions limitées des canaux. Dans cette méthode, nous décrivons une technique permettant de modifier le collagène natif de type I pour générer des solutions de collagène polycationique et polyanionique qui peuvent être utilisées avec le dépôt couche par couche pour créer des assemblages de collagène ultraminces au-dessus de cellules cultivées dans des dispositifs microfluidiques. Ces fines couches de collagène stabilisent la morphologie et la fonction cellulaires, comme le montrent l’utilisation d’hépatocytes primaires comme exemple de cellule, permettant la culture à long terme de microtissus dans des dispositifs microfluidiques.

Introduction

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Bien que la microfluidique permette un contrôle exquis du microenvironnement cellulaire, la culture de cellules, en particulier de cellules primaires, au sein de dispositifs microfluidiques peut être difficile. De nombreuses techniques de culture cellulaire traditionnelles ont été développées pour soutenir et stabiliser la fonction cellulaire lorsqu’elles sont cultivées dans des plaques de culture tissulaire, mais il est souvent difficile de transposer ces techniques en dispositifs microfluidiques.

Une de ces techniques est la culture de cellules sur ou en sandwich entre des gels de collagène comme modèle de l’environnement cellulaire physiologique 3D. 1 Le collagène de type I est l’une des protéines les plus fréquemment utilisées pour les applications de biomatériaux en raison de son omniprésence dans la matrice extracellulaire, de son abondance naturelle, de ses sites d’attachement cellulaires robustes et de sa biocompatibilité. 2 De nombreuses cellules bénéficient de la culture 3D avec du collagène, notamment les cellules cancéreuses3,45, les cellules endothéliales microvasculaires6 et les hépatocytes7, entre autres. Bien que l’utilisation de gels de collagène soit facile dans les formats ouverts, tels que les plaques de culture tissulaire, les dimensions limitées des canaux et la nature fermée des dispositifs microfluidiques rendent l’utilisation de liquides qui gélifient peu pratique sans bloquer l’ensemble du canal.

Pour surmonter ce problème, nous avons combiné la technique de dépôt couche par couche8 avec des modifications chimiques de solutions de collagène natif pour créer des assemblages de collagène ultraminces au-dessus de cellules cultivées dans des dispositifs microfluidiques. Ces couches peuvent stabiliser la morphologie cellulaire et fonctionner de la même manière que les gels de collagène et peuvent être déposées sur les cellules dans des dispositifs microfluidiques sans bloquer les canaux à matrice polymérisée. L’objectif de cette méthode est de modifier le collagène natif pour créer des solutions de collagène polycationique et polyanionique et de stabiliser les cellules en culture microfluidique en déposant de minces assemblages de matrice de collagène sur les cellules. Cette technique a été utilisée pour stabiliser la morphologie et la fonction des hépatocytes primaires dans des dispositifs microfluidiques. 9

Bien que le dépôt couche par couche ait déjà été signalé avec des polyélectrolytes naturels et synthétiques10 pour couvrir les hépatocytes en culture sur plaque11,12 et comme couche d’ensemencement pour les hépatocytes dans les dispositifs microfluidiques13,14, cette méthode décrit le dépôt d’une couche de collagène pur sur les hépatocytes, imitant les techniques de culture de collagène 3D. Dans ce protocole, nous utilisons des hépatocytes comme exemples de cellules qui peuvent être maintenues à l’aide de couches de collagène 3D. Les nombreux autres types de cellules qui bénéficient de la culture 3D du collagène peuvent également bénéficier de la culture après le dépôt couche par couche d’un assemblage de matrice de collagène ultramince.

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Protocole

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1. Préparation de la solution de collagène natif soluble

  1. Préparer ou acheter 200 mg de acidifiés, soluble, collagène de type I à partir de queues de rats à 1-3 mg / ml en utilisant des protocoles d'isolement classiques, tels que rapportés par Piez et al. 15
  2. L'échelle de la quantité de matière de départ par rapport au volume final souhaité de solutions de collagène modifiés. Environ 25 à 30 ml de faire méthyle et de 25 à 30 ml de solutions de collagène succinylés, chacun à 3 mg / ml, à partir de 200 mg de collagène natif soluble.

2. Collagène méthylation

  1. Diluer 100 mg de la, acidifié (pH 2-3) solution native de collagène à une concentration de 0,5 mg / ml avec de la glace de l'eau stérile froide et maintenir la solution sur de la glace pour empêcher la gélification.
  2. Ajuster le pH de la solution de collagène à 10/09 avec quelques gouttes de NaOH 1 N et on agite à température ambiante pendant 30 min. Observez le précipité de collagène, entraînant la solution à devenir trouble.
  3. Isoler le précipité de collagène solution à 3000 g pendant 25 min. Un précipité clair, gel doit être visible dans le fond des tubes. Aspirer et éliminer correctement le liquide surnageant.
  4. Remettre en suspension le précipité de collagène dans 200 ml de méthanol avec HCl 0,1 N et laisser la réaction de méthylation de se produire avec agitation à température ambiante pendant 4 jours. Le collagène ne se dissout pas, mais devrait se briser en très petits morceaux visibles qui feront la solution trouble.
  5. Après la méthylation, centrifugeuse la solution à 3000 g pendant 25 min pour sédimenter le collagène méthylé. Aspirer et éliminer le surnageant de méthanol acidifié.
  6. On dissout le collagène méthylé dans 25 ml de PBS stérile, ce qui donne une concentration d'environ 3 mg / ml, avec pipetage répété, et filtrer la solution à travers un tamis cellulaire de 60 pm. Ajuster le pH de la solution à 7,3 à 7,4 en utilisant 20 ul incréments de NaOH 1 N.
  7. Évaluer la Concentration de la solution en utilisant un collagène de rat commerciale kit ELISA ou kit de dosage hydroxyproline. Diluer la solution à 3 mg / ml avec du PBS stérile.
  8. Stériliser la solution de collagène méthylé en le transférant à une bouteille en verre avec un bouchon à vis, marcottage soigneusement 3 ml de chloroforme au fond de la bouteille, laissez la bouteille pour régler O / N à 4 ° C, puis de façon aseptique Retirez et rangez les couche supérieure, qui est le collagène méthylé.
  9. Conserver la solution à 4 ° C pour une utilisation dans un mois.

3. Le collagène Succinylation

  1. Diluer les 100 autres mg de la, acidifié (pH 2-3) solution native de collagène à une concentration de 0,5 mg / ml avec de la glace de l'eau stérile froide et maintenir la solution sur de la glace pour empêcher la gélification.
  2. Ajuster le pH de la solution de collagène à 10/09 avec quelques gouttes de NaOH 1 N et on agite à température ambiante pendant 30 min. Le collagène devrait précipiter, entraînant la solution à devenir trouble.
  3. Dissoudre 40 mg de Succinic anhydride (0,4 mg par mg de collagène) dans 10 ml d'acétone (20/01 ème volume de la solution de collagène). Lentement (environ 0,5 ml en incréments) ajouter à ce mélange la solution de collagène sous agitation tout en contrôlant en continu le pH. Maintenir le pH au-dessus de 9,0 par addition de 1 ou 2 gouttes de NaOH 1 N, le pH se rapproche comme 9,0.
  4. Poursuivre l'agitation à température ambiante pendant 120 min après l'addition de l'ensemble de l'anhydride succinique dans de l'acétone. Observez la solution à devenir clair que le collagène succinylé dissout. Contrôler régulièrement le pH pour qu'il reste au-dessus de 9,0.
  5. Ajuster le pH de la solution à 4,0 avec 20 ul de incréments de HCl 1 N. Observez la solution trouble à nouveau, comme le collagène succinylé précipite.
  6. Après la succinylation, centrifugeuse la solution à 3000 g pendant 25 min pour sédimenter le collagène succinylé. Aspirer et éliminer le surnageant acidifié avec l'anhydride succinique qui n'a pas réagi.
  7. Dissoudre le collagène succinylédans 25 ml de PBS stérile, ce qui donne une concentration d'environ 3 mg / ml, avec pipetage répété, et filtrer la solution à travers un tamis cellulaire de 60 pm. Ajuster le pH de la solution à 7,3 à 7,4 en utilisant 20 ul incréments de NaOH 1 N.
  8. Évaluer la concentration de la solution en utilisant un collagène rat commerciale kit ELISA ou kit de dosage hydroxyproline. Diluer la solution à 3 mg / ml avec du PBS stérile.
  9. Stériliser la solution de collagène succinylé en le transférant à une bouteille en verre avec un bouchon à vis, marcottage soigneusement 3 ml de chloroforme au fond de la bouteille, laissez la bouteille pour régler O / N à 4 ° C, puis de façon aseptique Retirez et rangez les couche supérieure, qui est le collagène succinylé.
  10. Conserver la solution à 4 ° C pour une utilisation dans un mois.

4. Vérification du collagène Modifications

  1. Préparer des échantillons de 1 ml de chacune des solutions natives, méthylés, et collagène succinylé et diluer à une concntration de 0,1 mg / ml avec de l'eau pure stérile pour le titrage des ions hydrogène. Diluer le tampon d'au moins 1000 fois par dialyse contre de l'eau à travers une coupure de 10 kDa membraneusing 3 changements de solution pendant au moins 4 heures chacune.
  2. Ajuster le pH des solutions à 7,3 avec de petites quantités de NaOH et HCl. Utilisation de pH 7,3 en tant que référence arbitraire, effectuer le titrage d'ions hydrogène sur chacun des échantillons, comme décrit par Tanford 16 pour créer des courbes de titration pour les solutions natives, méthylés, et collagène succinylé.
  3. Tracer la variation de pH par volume d'acide ajoutée par rapport au nombre de H + ions lié par molécule. Le pH élevé "amino" gamme devrait montrer un changement dans le collagène succinylé vers le point neutre (une perte de groupes amines), et le faible pH "carboxyle" gamme devrait montrer un décalage vers la gauche dans le collagène méthylé (une perte de groupes carboxyle ) et un déplacement vers la droite dans le collagène succinylé (un gain en groupe carboxyles), par rapport au collagène natif.
  4. Évaluer l'efficacité de la réaction de succinylation en déterminant le% de groupes amino dans le collagène natif remplacés par succinylation en utilisant l'acide 2,4,6-trinitrobenzène (TNBA) Méthode colorimétrique, suivant des protocoles standard 17,18.

5. fabrication de dispositifs microfluidiques et la cellule de semis

  1. Fabriquer des dispositifs microfluidiques en utilisant des procédés standard de 9. Utilisation réplique moulage de PDMS de SU-8 sur silicium maîtres définis par photolithographie microfluidiques pour créer des chambres de culture cellulaire avec 100 um de hauteur, 0,4-1,5 mm de large, et 1 à 10 mm de long des canaux pour la croissance cellulaire.
  2. Utilisez un nettoyeur à plasma pour oxyder les surfaces de l'appareil et une lame de verre, puis appuyez ensemble pour obligataire. Après stérilisation du dispositif par exposition à la lumière UV pendant au moins 30 min, remplir la chambre avec 50 ug / ml de fibronectine dans du PBS stérile et incuber à 37 ° C pendant 45 min.
  3. Initialiser le dispositif avec des cellules de rat, telles que les hépatocytes humains primaires ou qui nécessitent un gel de collagène pour la stabilisation du phénotype ou l'état de différenciation. Nous utilisons 20 pi d'hépatocytes primaires de rat fraîchement isolés 7,19 ou disponibles dans le commerce des hépatocytes humains primaires cryoconservés ensemencées à 14 × 10 6 cellules / ml par appareil.
  4. Laisser les cellules se fixer pendant 4-6 heures, puis lavent cellules seules et remplacent les milieux d'étalement avec les médias de la croissance. Incuber O / N pour assurer la pleine étalement cellulaire et de créer une monocouche confluente de cellules.

6. couche par couche de collagène Deposition

  1. Dans une hotte à flux laminaire de culture de tissu, préparer des volumes suffisants de solutions de collagène dénaturé et succinylées pour 10 applications de chaque solution par dispositif, ainsi que quelques ml de milieu. Conserver les solutions sur la glace. Nous utilisons 20 pi (10-15 fois le volume total du dispositif) de collagène par couche par appareil.
  2. Êtreégrenage avec le (polycationique) solution méthylé, suppléant rinçage des appareils avec 20 pi de méthyle et puis succinylée solutions de collagène, en attendant 1 min entre chaque application. Rincer le dispositif un total de 10 fois par la solution, ce qui devrait prendre environ 20 min. Travaillez rapidement pour minimiser la quantité de temps les cellules sont sans médias.
  3. Observez collagène accumuler lentement à l'entrée / sortie en fonction de sa taille. Si la résistance à l'écoulement fluide augmente, rincer l'appareil une ou deux fois avec les médias, et puis continuer stratification.
  4. Après l'application de toutes les couches, rincer l'appareil deux fois avec un milieu frais et de revenir à l'incubateur. Selon le type cellulaire, les changements morphologiques induits par la matrice extracellulaire, tels que renforcement de polarisation dans les hépatocytes, doivent être visibles au bout de quelques heures.
  5. Préparer dispositifs représentatifs des types de microscopie électronique à transmission en utilisant des procédés standard de 9 pour vérifier la présence d'une matrice de collagèneassemblage au-dessus des cellules cultivées.

7. Stabilisation de phénotype cellulaire et fonction

  1. L'image de la morphologie cellulaire, la viabilité et la polarité en utilisant des procédés standard pour le type de cellule. Pour les hépatocytes, recueillir des images de plus de 14 jours en utilisant la microscopie de phase, coloration, LIVE / DEAD pour la viabilité, et CMFDA colorant pour la polarisation apicale de démontrer les effets des dépôts de collagène.
  2. Pour la morphologie des cellules, rincer l'appareil à travers l'entrée à la pipette avec 20 pi de PBS pour rincer, injecter 20 pi de PBS, et l'image du dispositif utilisant microscope à contraste de phase.
  3. Pour la coloration, LIVE / DEAD, rincer l'appareil à travers l'entrée à la pipette avec 20 pi de PBS à rincer, injecter 20 pi de solution de coloration, LIVE / DEAD avec DAPI préparés en suivant les instructions du fabricant, incuber pendant 30 min à 37 ° C, rincer le Dispositif de nouveau avec 20 pi de PBS, et l'image du dispositif utilisant la microscopie à fluorescence.
  4. Pour la bile Canalicoloration Culi, rincer l'appareil à travers l'entrée à la pipette avec 20 pi de PBS pour rincer, injecter 20 pi de 2 solution de coloration uM CMFDA avec DAPI, préparées conformément aux instructions du fabricant, incuber pendant 30 min à 37 ° C, rincer l'appareil de nouveau avec 20 ul de PBS, et l'image de l'appareil en utilisant la microscopie de fluorescence.
  5. Recueillir les milieux épuisés et mesurer les produits métaboliques cellulaires à des points de temps appropriés pendant la durée de la culture afin de déterminer la fonction des cellules. Pour les hépatocytes, de mesurer la quantité d'albumine et de l'urée dans les milieux épuisés.
  6. Effectuer des analyses fonctionnelles de point final sur les cellules elles-mêmes, comme l'évaluation des niveaux d'enzymes d'activité, la coloration des anticorps, ou l'analyse de l'ARN. Pour les hépatocytes, induire et mesurer les activités enzymatiques du cytochrome P450 ou la phase II conjugaison enzyme glutathion-S-transférase.

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Résultats

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Le collagène natif peut être modifié en utilisant la méthylation et succinylation pour créer des solutions de collagène polycationiques et polyanioniques pour une utilisation dans le dépôt couche par couche. Succinylation modifie les groupes de collagène natif e-amino avec des groupes succinyle, et la méthylation modifie les groupes carboxyle du collagène natif avec un groupe méthyle (figure 1A). Ces modifications de la protéine de collagène chaînes latérales d'acides aminés modifier les courbes de titr...

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Discussion

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Ultraminces ensembles de collagène pur peuvent être déposés sur les cellules chargées ou des surfaces de matériaux à l'aide de dépôt couche par couche de collagènes modifiés. Les résultats de cette étude démontrent que la méthylation et succinylation de collagène natif créer des solutions de collagène polycationiques et polyanioniques (figure 1) qui peut être utilisé avec la technique couche par couche à déposer les assemblages de matrice de collagène ultra-minces sur des cellules (figure 2)...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health, y compris une subvention de consortium de systèmes microphysiologiques du National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), une bourse postdoctorale Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F32DK098905 pour WJM) et une bourse Pathway to Independence (DK095984 pour AB) de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
collagène de type I, queue de ratLife TechnologiesA1048301option pour collagène concentré de queue de rat
de type I, queue de ratSigma-AldrichC3867-1VLoption pour collagène de queue de rat concentré
de type I, queue de ratEMD Millipore08-115option pour collagène de queue de rat concentré
de type I, queue de ratR %D Systems3440-100-01option pour le collagène concentré de queue de rat
anhydride succiniqueSigma-Aldrich239690-50Gréactif de succinylation
méthanol anhydreSigma-Aldrich322415-100MLréactif de méthylation
hydroxyde de sodiumSigma-AldrichS5881-500Gréactif de précipitation du pH
acide chlorhydriqueSigma-Aldrich320331-500MLRéactif de précipitation de pH
collagène de rat de type I ELISAChondrex6013option pour détecter la teneur en collagène
kit de dosage de l’hydroxyprolineSigma-AldrichMAK008-1KToption pour la détection de la teneur en collagène
kit de dosage de l’hydroxyprolineQuickzyme BiosciencesQZBtotcol1option pour la détection de la teneur en collagène

Références

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Mots-clés

Layer by Layer AssemblyHepatocyte CultureCollagen ModificationMethylated CollagenSuccinated CollagenCell PolaritySecretory FunctionThin Collagen Layers

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