Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Un modèle 3D Culture hormone-sensibles de la glande mammaire humaine épithélium

8.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/53098

⸱

7 février 2016

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Physiology and Pathobiology, Tufts University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un modèle de culture 3D de l’épithélium du sein humain qui convient à l’étude de l’action hormonale.

Résumé

Le processus de morphogenèse épithéliale mammaire est influencé par les hormones. L’étude de l’action hormonale sur l’épithélium mammaire à l’aide de cultures 2D se limite à la prolifération cellulaire et aux paramètres d’expression génique. Cependant, dans l’organisme, la morphogenèse mammaire se produit dans un environnement 3D. Les systèmes de culture 3D aident à combler le fossé entre la culture cellulaire monocouche (2D) et la complexité de l’organisme. Dans cet article, nous décrivons un modèle de culture 3D de l’épithélium du sein humain qui convient à l’étude de l’action hormonale. Il utilise la lignée de cellules épithéliales du sein humain sensible aux hormones, T47D, et le collagène de queue de rat de type 1 comme matrice. Ce modèle de culture 3D répond aux principales hormones mammotropes : l’œstradiol, les progestatifs et la prolactine. L’influence de ces hormones sur la morphogenèse épithéliale peut être observée après 1 ou 2 semaines de traitement selon le critère d’évaluation. Les cultures 3D peuvent être récoltées pour l’analyse de la morphogenèse épithéliale, de la prolifération cellulaire et de l’expression des gènes.

Introduction

Contrairement cultures 2D standard, culture cellulaire 3D modèles de substitution permettent l'étude du comportement des cellules épithéliales dans un contexte physiologiquement pertinente, l'un ressemble à un tissu. cultures 3D de la glande mammaire ont permis d'élucider de nombreux aspects du développement de la glande mammaire et la néoplasie. Cependant, la plupart des modèles de culture 3D actuellement ne conviennent pas pour étudier l'action des hormones parce que les lignées de cellules épithéliales humaines utilisées pour la tâche manquent de l'expression du récepteur d'hormone 6,7,9.

Nous décrivons ici un modèle de culture 3D de l'épithélium du sein humain qui est approprié pour étudier l'action de l'hormone 12. Ce modèle utilise la ligne disponible dans le commerce hormono-sensible humain epithelial du sein cellulaire T47D 3,11,13, qui ont été à l'origine dérivée d'une effusion pleurale provenant d'une patiente de 54 ans femelle avec un carcinome canalaire infiltrant du sein. Nous utilisons rat de type queue de collagène 1 comme matrice. Ce culte 3Dmodèle de ure est approprié pour l'étude de l'action des trois principales hormones mammotropic (estradiol, promégestone (un analogue de la progestérone), et de prolactine) sur les cellules épithéliales mammaires humaines. Hormone induit morphologie épithéliale peut être évaluée quantitativement au fil du temps par analyse morphométrique 12.

Une densité de semis appropriée permet à ces cultures 3D pour être conservés pendant 2 semaines. A cette époque, le développement de structures est suffisant pour une évaluation quantitative robuste de l'action des hormones sur la morphologie épithéliale. Les gels peuvent également être récoltées à des moments antérieurs pour la prolifération cellulaire et les analyses d'expression génique. En outre, ce modèle est adapté à tester les effets d'un traitement hormonal séquentiel; par exemple, après le traitement avec l'oestradiol pendant la première semaine et son remplacement par un autre hormone / combinaison d'hormones au cours de la semaine suivante. L'effet des composés oestrogéniques et anti-œstrogènes, tels que ICI 182,780, peut également être Stumortes en utilisant ce modèle de culture de 12 3D.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparation des réactifs

  1. Dissoudre le promégestone synthétique progestatif (R5020) et 17-β-estradiol (E2) dans l'éthanol pour faire 10 -3 M solutions mères. Dissoudre la prolactine dans l'eau déminéralisée distillée pour faire un / ml solution mère à 1 mg. Dissoudre l'anti-oestrogène ICI 182,780 dans le DMSO pour faire un M solution mère à 10 -2. Stocker ces solutions à -20 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
  2. dextran de charbon (CD) dépouillé sérum et moyennes CDFBS:
    1. Inactiver à la chaleur de sérum bovin fœtal (FBS) dans un bain d'eau à 57 ° C pendant 30 min.
      Remarque: Utilisez uniquement la verrerie lavée à l'acide pour le reste de ce protocole.
    2. Calculer la quantité de charbon de bois nécessaire. Utilisation de 10% plus de volume que la quantité de sérum pour compenser le déplacement provoqué par le charbon, peser 5% en poids / volume de charbon actif en poudre.
    3. Laver le charbon deux fois avec de l'eau désionisée froide distillée en utilisant le même volume que la quantité de sérum. Pour chaque lavage centrifuge à 50 x g pendant 2 min pour sédimenter le charbon de bois. Retirer l'eau entre les lavages. Ajouter 0,5% en poids / volume Dextran T-70 à la dernière charbon granulés. Re-suspendre avec distillée, eau déminéralisée et centrifuger à 100 g pendant 5 min. Aspirer l'eau.
    4. Ajouter le volume approprié de sérum au culot et remettre en suspension le culot de charbon dextran dans le sérum. Incuber, tout en roulant (6 RPM), à 37 ° C pendant 60 min. Centrifuger à 2000 g pendant 20 min. Si surnageant apparaît trouble, répéter centrifugation; Cependant, le sérum peut ne pas être tout à fait clair à ce moment, mais il sera effacé lors de la filtration.
    5. Filtrer à travers un filtre de 0,80 microns, puis à nouveau à travers un filtre de 0,45 microns pour éliminer plus grand de particules. Enfin, le filtre-stériliser avec un filtre de 0,20 micron. Magasin CDFBS dans des tubes de verre ou T-25 flacons de culture filtré à -20 ºC.
    6. Charcoal Dextran Stripped fœtal bovin contenant des médias (médias CDFBS): mélanger de 375 ml de phénol DMEM exempt de rouge et 125 ml de DMEM/ F-12. Retirer 37,5 ml et le remplacer par le même volume de sérum de veau fœtal charbon Dextran Stripped. Ajouter 10 6 U / ml de pénicilline et de la L-glutamine à une concentration finale de 2 mM. Le support obtenu est 75% de DMEM, 25% de DMEM / F-12, de 7,5% à charbon dextran dépouillée de FBS, 2 mM de L-glutamine, et 10 6 U / ml de pénicilline.
  3. Préparez 10X PBS, NaOH 1N et de l'eau déminéralisée distillée. Préparer un volume suffisant de chaque selon le volume de la solution de collagène est nécessaire. Stériliser toutes les solutions de filtrage. Stocker le 10x PBS et de l'eau déminéralisée distillée stérile à 4 ° C pendant jusqu'à 1 mois. Ne pas conserver la solution de NaOH 1N.
  4. Préparer la solution de collagène à 1 mg / ml de concentration finale selon le protocole de "procédure de gélification suppléant de collagène I, queue de rat" fourni par le fabricant. Chaque gel est constitué de 1,5 ml d'une solution de collagène. Par exemple, préparer 18,5 ml (0,5 ml pour tenir compte des pertes au cours de pipetage) d'une solution de collagène pour préparer12 gels. Utiliser la solution de collagène immédiatement ou tenir sur de la glace jusqu'à 2-3 heures.
  5. Carmine Alum colorant:
    1. Mélanger 1 g Carmine et 2,5 g de sulfate d'aluminium de potassium dans 500 ml d'eau distillée. Faire bouillir tout en agitant pendant 20 min. Regardez attentivement pour éviter de déborder. Ajuster le volume final de retour à 500 ml d'eau distillée supplémentaire.
    2. Ajouter un cristal de thymol de l'activité antimicrobienne et couvrir la bouteille avec du papier d'aluminium pour le protéger de la lumière. Filtrer à travers un filtre en papier de qualité laboratoire avant chaque utilisation. Réutiliser la solution de carmin pour un maximum de trois mois. Magasin à la température ambiante, à l'abri de la lumière.
  6. solution de collagénase: dissoudre la collagénase dans du milieu DMEM / F12 à une concentration de 0,125% p / v. Ne rangez pas cette solution.

2. 3D culture de cellules T47D dans Queue Rat collagène de type 1 et Gels Traitement hormonal

Remarque: garder pipettes sérologiques stériles et des embouts de pipette à 4 ° C.

  1. Prepare une suspension à cellule unique et d'effectuer une numération cellulaire. des cultures de cellules de Split T47D avant qu'ils atteignent 70% de confluence. Centrifuger le volume qui contient la quantité de cellules nécessaires. Considérer que l'un de gel devrait contenir environ 75.000 T47D cellules.
  2. En utilisant une pipette à froid, remettre en suspension le culot cellulaire dans le volume approprié de collagène. Considérons que chaque gel est constitué de 1,5 ml de collagène. Mélanger les cellules et le collagène avec précaution pour éviter l'introduction de bulles.
  3. Pour éviter l'effet de l'électricité statique sur la distribution de cellules, brosser la frontières, haut et en bas de la plaque de 12 puits avec une brosse antistatique réducteur après déballer la plaque. Pour éviter l'accumulation de charge statique lors du contact avec la surface de travail de la hotte, placer cette plaque sur le dessus d'une autre plaque de 12 puits (plaque vierge) qui a également été brossé avec le brush.Gently statique de réduction, versez 1,5 ml du mélange dans chaque puits de la plaque de 12 puits.
  4. Placer la plaque dans une étuve à 37 ° C pendant 30 min. Retirer ee plaque de l'incubateur et le replacer dans la hotte.
  5. En utilisant une pointe stérile p200, détacher soigneusement le gel dans un mouvement circulaire de la frontière du puits. Le gel doit également se détacher du fond du puits.
  6. Diluer hormones dans les médias CDFBS à être ajoutés aux puits. R5020 et utiliser E2 à une concentration finale de 10 -10 M et de la prolactine à une 10 -7 M à une concentration finale. Comme contrôle, utiliser les médias CDFBS sans hormones ajoutées, mais qui contient encore le plus grand volume de DMSO égale aux stocks d'hormones utilisées. Veiller à ce que chaque puits contient 1,5 ml de milieu. Placer les cultures 3D à l'intérieur de 37 ° C, 5% CO 2, 100% Taux d'humidité de la culture tissulaire de l'incubateur. Maintenir les cultures pour 1 ou 2 semaines, en changeant les médias tous les 2 jours.

3. Traitement Gel pour toute Mounts

  1. Retirer les milieux de culture et d'ajouter 1,5 ml de PBS à chaque puits.
  2. Transférer le gel à une diapositive. Couper le gel en deux à l'aide d'une courbelame chirurgicale d. Continuer le traitement avec une moitié et sauver l'autre moitié pour l'analyse histologique.
  3. Transférer le gel de la moitié de toute la montagne à une diapositive. Laissez gel sec pendant 5 min, puis transférer la diapositive à un bocal de Coplin contenant 10% de formol.
    Remarque: toutes les incubations doivent être effectués à la température ambiante.
  4. Fixer des gels dans un bocal de Coplin sur un agitateur O / N.
  5. Laver les lames deux fois avec PBS pendant 10 min chacun sur shaker. Transfert glisse à 70% EtOH; incuber pendant 1 heure sur un agitateur. diapositives de transfert aux Carmine Alum O / N.
  6. Le lendemain, déshydrater diapositives sur un agitateur à 70% de EtOH, EtOH à 95% et 100% EtOH pendant 1 heure chacune d'elles. Transfert glisse au xylène deux fois pendant 1 heure chacun et continuer à shaker. Utilisez milieu de montage à base de toluène de monter les gels et 1,5 mm Lamelles épaisses.
  7. Examiner montures entières sous une lumière ordinaire (microscope ou stéréoscope). Pour une analyse plus détaillée de la forme et de la lumière en utilisant la microscopie confocale et de visualiser Carmine colorant avec HeNe 633 nm laser.

4. Traitement Gel pour le traitement de l'analyse histologique

  1. Transférer la moitié restante du gel dans un flacon en verre de 20 ml contenant 10% de formol et de fixer sur un agitateur O / N.
  2. Lavez gels deux fois avec PBS pendant 10 min chacun sur shaker. La place des gels dans des cassettes de traitement pour inclusion dans la paraffine.
  3. gels de transfert à 70% EtOH, incuber pendant 1 h et suivent avec 95% EtOH pendant 1 heure, changent à nouveau de 95% EtOH pendant 1 heure, 100% EtOH pendant 1 heure, et se transforment en frais EtOH à 100% pendant 1 heure. À ce stade, les gels peuvent être stockés dans EtOH à 100% O / N à la température ambiante ou incubées avec du xylène pendant 1 heure, puis à nouveau dans le xylène frais pendant 1 heure.
  4. cassettes de transfert de paraffine pendant 1 heure à 60 ° C dans un incubateur à vide, répéter avec de la paraffine frais deux fois plus.
  5. Remplir les moules en plastique avec de la paraffine propre. Ouvrez la cassette, enlever le gel et le placer dans le moule contenant la paraffine plastique. Remplir avec de la paraffine et ajoutez haut de cassette contenant l'étiquette sur le dessus et laisser bloc cool.
  6. Retirez le plastic moule et la section du bloc en utilisant un microtome. Obtenez 5 um sections d'épaisseur pour coloration HE et immunocytochimie.

5. extraction de cellules à partir de cellules à partir de gels en utilisant un traitement collagénase

  1. Retirer le gel du puits et le transférer à une boîte de Pétri contenant du PBS. brièvement de gel rinçage.
  2. Transférer le gel dans un tube de 15 ml contenant 2 ml de 0,125% de collagénase. Introduire à la pipette de haut en bas 4-5 fois pour briser le gel en petits morceaux.
  3. Incuber à 37 ° C pendant 25 min (jusqu'à ce que le gel se soit dissous et les cellules sont en suspension)
  4. Ajouter 2 ml de sérum supplémenté le milieu de culture. Recueillir les cellules par centrifugation (1000 x g, 5 min), surnageant rejet, remettre en suspension les cellules et à compter.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La figure 1 résume la procédure pour la préparation des cultures 3D hormono-sensibles. structures epitheliales sont observés dans les montures de gels entiers cultivés pendant 2 semaines en présence de E2 seul ou en combinaison avec d'autres hormones. Des cellules ou des groupes de 2-3 cellules simples sont présents seulement lorsque aucun hormones sont ajoutées au milieu de culture (milieu CDFBS) (figure 2). Cette condition sert de contrôle négatif.

Les...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Nous décrivons ici un modèle de culture 3D hormono-sensible pour tester l’action des hormones sur l’épithélium mammaire. La réponse aux hormones peut être évaluée aux niveaux 12 de la morphologie tissulaire, de la prolifération cellulaire et de l’expression des gènes. L’une des limites de cette technique est que la visualisation pendant la période de culture est limitée à la microscopie optique, car les cultures sont cultivées dans une plaque inférieure en plastique. Le système de culture 3D a pu être adapté a...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous apprécions grandement les contributions éditoriales par Cheryl Schaeberle. Cette recherche a été soutenue par des subventions Avon # 02-2009-093 et ​​02-2011-095 et NIEHS / NIH ES 08314 à AMS. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les positions officielles de l'Institut national des sciences de la santé de l'environnement ou de la National Institutes of Health.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques de culture tissulaire à 12 puits (Falcon)Fisher Scientific08-772-29
Tubes coniques en polystyrène de 15 ml FisherScientific14-959-49D
Charbon actifSigmaC-5510
Carmin AlumSigmaC1022-100G
Collagénase, Type 3WorthingtonS0C11784
Microscope confocalZeissLSM510Équipé d’un laser HeNe 633nm
Dextran T-70Abersham/Pharmacia17-0280-01
DMEM/F-12, HEPES, sans rouge de phénol.Life Technologies11339-021Milieux sans rouge de phénol à usage hormonal
DMEM, faible teneur en glucose, pyruvate, sans glutamine, sans rouge de phénolLife Technologies11054-020Milieux sans rouge de phénol à usage hormonal
17-&beta ;-EstradiolEMD Millipore3301Dissous dans de l’éthanol
ÉthanolKoptecV1001
Sérum de veau fœtalHycloneSH30070.03Pour une utilisation avec des hormones, doit être dépourvu de charbon de bois.
Filtres (115 ml)Nalgene380-0080, 245-0045, 120-00200,88, 0,45, 0,20 micron, respectivement  ;
Formol, 10 %Fisher ScientificSF93-20
L-Glutamine (200 mM)Life Technologies25030-081
ICI 182,780 (fulvestrant)Sigma AldrichI4409-25MGdissous dans
microtome DMSO  ;LeicaRM2155
Supports d’enrobage tissulaireMcCormick Scientific39502004
PénicillineSigma7794-10MUDissous dans 10 ml d’eau distillée déminéralisée
PermountFisher ScientificSP15-500
Phosphate Saline tamponnée pH 7,4Sigma AldrichP3813-10PAK
ProlactineSigma AldrichL4021-50UGDissous dans de l’eau distillée désionisée
PromegestonePerkin ElmerNLP004005MGDissous dans
l’éthanol Collagène de queue de rat  ;Corning  ;354236Les lots peuvent contenir des concentrations variables, notez en conséquence
ScalpelMiltex4311
Semi-closed Benchtop Tissue ProcessorLeicaTP1020
Sodium HydroxideSigma AldrichS5881Prepare 1N NaOH stock
StaticMaster Brosse antistatique  ;AmstatC3500
Stripette Pipettes sérologiques  ;Corning  ;4101
Fioles T-25 Corning  ;
Cassettes de tissusFisher Scientific15-200-403E
Flacons Wheaton, verre, 20 mlFisher Scientific03-341-25D  ;
Xylène  ;VWR95057-822
un de 430168

Références

  1. Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325(2014).
  2. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
  3. Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
  4. Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
  5. Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
  6. Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
  7. Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
  8. Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
  9. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
  10. Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
  11. Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
  12. Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
  13. Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

Modèle de culture 3Dcellules hormono-sensiblesépithélium mammairecellules T47Dcollagène de queue de rattraitement à l'estradioltraitement aux progestinestraitement à la prolactinemorphogenèse épithélialeprolifération cellulaire
Un modèle 3D Culture hormone-sensibles de la glande mammaire humaine épithélium
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.