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Article de méthode

Ferromagnétique Bare Metal Stent pour endothéliale capture de cellules et de la conservation

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DOI :

10.3791/53100

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18 septembre 2015

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1Division of Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 3Department of Cardioangiology, ICRC, St. Anne's University Hospital, 4Mayo Clinic College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Nos objectifs étaient de concevoir, fabriquer et tester stents ferromagnétiques pour la capture des cellules endothéliales. Dix stents ont été testés pour la fracture et 10 autres stents ont été testés pour le magnétisme retenu. Enfin, 10 stents ont été testés in vitro et 8 autres stents ont été implantés dans 4 porcs pour montrer capture et la conservation cellule.

Résumé

Endothélialisation rapide des endoprothèses vasculaires est nécessaire pour réduire la thrombose de stent et d'éviter la thérapie anti-plaquettaire qui peut réduire le risque de saignement. La faisabilité de l'utilisation des forces magnétiques pour capturer et conserver les cellules endothéliales excroissance (COE) marqués avec des nanoparticules d'oxyde de fer super-paramagnétiques (SPION) a été montré précédemment. Mais cette technique nécessite la mise au point d'un stent mécaniquement fonctionnelle à partir d'un matériau magnétique et biocompatible suivi par in-vitro et in-vivo des tests pour prouver endothélialisation rapide. Nous avons développé un stent faiblement ferromagnétique acier inoxydable duplex 2205 en utilisant conception assistée par ordinateur (CAD) et sa conception a été affinée en utilisant une analyse par éléments finis (FEA). La conception finale du stent présenté une déformation principale sous la limite de rupture du matériau pendant le sertissage mécanique et d'expansion. Une centaine de stents ont été fabriqués et un sous-ensemble d'entre eux a été utilisé pour les essais mécaniques, retained mesures de champ magnétique, des études in vitro de capture de cellules, in vivo et des études d'implantation. Dix stents ont été testés pour déploiement pour vérifier si elles soutenue sertissage et l'expansion du cycle sans défaillance. 10 autres ont été magnétisés stents utilisant un aimant de néodyme forte et leur champ magnétique retenu a été mesurée. Les stents ont montré que le magnétisme retenu était suffisante pour capturer SPION marqué EOC dans nos études de in vitro. Capture et la conservation des COE SPION marqué a été vérifiée dans les grands modèles animaux par l'implantation d'une endoprothèse magnétisé et 1 non-aimanté stent de contrôle dans chacun des 4 porcs. Les artères ont été explantées stentées après 7 jours et analysés histologiquement. Les stents faiblement magnétiques développés dans cette étude étaient capables d'attirer et de retenir les cellules endothéliales Spion marqué qui peut favoriser la guérison rapide.

Introduction

Les patients auxquels on a implanté des endoprothèses vasculaires fabriquées à partir de matériaux thrombogènes tels que l’acier inoxydable, le cobalt-chrome et le platine-chrome – à la fois des endoprothèses métalliques nues (BMS) et des stents à élution de médicament (DES) – ont besoin d’un traitement antiplaquettaire pour prévenir la formation de thrombus. Les BMS guérissent rapidement, mais sont sujets à une resténose à un stade avancé en raison d’une cicatrisation incomplète. Le DES nécessite un traitement antiplaquettaire à long terme en raison d’une cicatrisation retardée. Le traitement antiplaquettaire administré pour éviter la thrombose à la suite d’une cicatrisation incomplète ou retardée entraîne un risque accru de saignement et peut ne pas convenir à certains patients1,2. Un stent idéal guérira complètement et rapidement, évitant ainsi un traitement antiplaquettaire à long terme et une resténose à un stade avancé. Cette guérison complète ne peut être obtenue que si le stent est rapidement recouvert d’une monocouche de cellules endothéliales après l’implantation. Il a été démontré que l’enrobage des stents avec des matériaux biocompatibles tels que l’or ou d’autres biopolymères améliore la résistance à la thrombo, mais aucune de ces techniques n’a permis d’obtenir une compatibilité sanguine idéale comme cela pourrait être possible en recouvrant avec des cellules endothéliales3,4.

Un stent peut être recouvert de cellules endothéliales après l’implantation en attirant les cellules progénitrices circulantes. Cette technique d’auto-ensemencement peut être réalisée en utilisant des ligands et des anticorps. Mais cette technique est limitée par le faible nombre de cellules progénitrices endothéliales circulantes. Une stratégie prometteuse consiste à délivrer des cellules directement dans l’endoprothèse immédiatement après l’implantation pendant une courte période d’occlusion du flux sanguin3,5. Cette stratégie nécessite une technique permettant de capturer rapidement les cellules et de les retenir sur le stent même après avoir rétabli le flux sanguin. Nous avons mis au point une technique dans laquelle un stent magnétique est utilisé pour attirer et retenir les cellules endothéliales marquées magnétiquement délivrées après l’implantation. Pour y parvenir, un BMS fonctionnel avec des propriétés magnétiques suffisantes pour capturer et retenir les cellules endothéliales marquées magnétiquement est nécessaire6.

Dans cet article, nous abordons les méthodes de conception, de fabrication et de test d’un stent en acier inoxydable 2205. Les stents ont été conçus à l’aide de la CAO et de l’analyse par éléments fins. Les endoprothèses fabriquées ont été magnétisées à l’aide d’un aimant en néodyme et le champ magnétique conservé a été mesuré à l’aide d’une sonde à microcapteur à magnétorésistance. Nous avons ensuite testé les stents pour la capture cellulaire marquée magnétiquement dans une boîte de culture lors de nos expériences in vitro. Enfin, les stents ont été testés in-vivo en implantant des stents magnétiques et non magnétiques chez 4 porcs et en analysant histologiquement les artères stentées.

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Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité d'utilisation institutionnel de protection des animaux et (IACUC) à la Clinique Mayo.

1. Conception et analyse d'un stent en acier inoxydable 2,205

  1. Conception d'un stent en métal nu en utilisant CAD
    1. Faites un cylindre creux extrudé en sélectionnant sur option 'extrudé patron / de base »avec l'épaisseur de paroi égale à l'épaisseur de l'entretoise stent.
    2. Concevoir un modèle de stent sur un plan d'esquisse différents tangent au cylindre extrudé. Faire de la largeur du motif plat en fonction de la circonférence du cylindre creux extrudé.
    3. Transférer la conception de modèle à plat sur le cylindre creux en utilisant la fonction de rembobinage.
    4. Enregistrez la pièce dans son format natif et aussi en format ACIS être exportés pour être FEA.
  2. Analyse par éléments finis pour les modèles de stent
    1. Importez la géométrie solide enregistrée au format ACIS dans le module de partie du logiciel de FEA pour d'autres analysest.
    2. Modèle 2 cylindres analytiques coaxiale au stent dans la partie modeleur du logiciel FEA. Le cylindre extérieur a un diamètre initial supérieur au diamètre du stent pour simuler la pince et le cylindre intérieur a un diamètre initial de 1 mm pour simuler un ballonnet de gonflage.
    3. Double-cliquez sur l'élément du modeleur de montage de l'arbre «instances» pour assembler le dessus dudit pièces dans des positions relatives.
    4. Utilisez le module de maillage du logiciel FEA, spécifier le type d'élément comme élément hexaédrique 20 nœuds avec intégration réduite, spécifier la taille de l'élément, et la maille du stent.
    5. Spécifiez paires de contact rigides friction entre le stent et les deux cylindres respectivement dans les «propriétés d'interaction» de l'arbre du modèle.
    6. Attribuer contrainte-déformation comportement élasto-plastique de l'acier inoxydable 2,205 pour le modèle de stent.
    7. Définir les conditions aux limites pour le sertissage d'une part le cylindre extérieur à 1 mm qui simule le cRimping du stent. Retirer le cylindre extérieur pour simuler la relaxation du stent serti. Développez le cylindre intérieur à 3 mm pour simuler l'expansion et enfin, retirer le cylindre intérieur pour simuler le recul du stent.
    8. Définir les paramètres de simulation, y compris le nombre de processeurs et la quantité de RAM alloués dans le 'Analyse' élément de modèle de l'arbre et exécuter la simulation.
    9. Une fois la simulation terminée, ouvrez le fichier de résultat (filename.odb) et post-traitement des résultats pour étudier les principales souches et itérative améliorer la conception de stent pour obtenir une souche principale de 20%, ce qui est inférieur à la limite de l'échec de la matière .

2. Stent fabrication et les essais pour le sertissage et expansion

  1. Stent fabrication
    1. Obtenir les 2205 tubes en acier inoxydable par le forage des armes à feu et la précision bar à broyer la matière à une entreprise d'usinage de précision tels que l'action Precision Products dans Pioneer,OH.
    2. Transférer les tubes au sol de précision et la conception modèle de stent à plat pour une entreprise de stent coupe comme Laserage Technology Corporation à Waukegan, IL pour la coupe et le polissage électrolytique laser.
    3. Passiver la surface des stents en les immergeant électropoli dans un acide fort (HCl 50%) pendant 10 min, suivie par une base (10% de NaHCO 3) pour un autre 10 min. ATTENTION: manipuler des produits chimiques avec un équipement de protection approprié et sous une hotte. Enfin, lavez les stents à l'alcool éthylique et de l'eau déminéralisée. Ce processus est appelé décapage à l'acide.
  2. Essai de stent fabriqué pour le sertissage et l'expansion
    1. Sertir le stent sur un ballon à trois volets en utilisant une main tendue outil de sertissage. Tenez le stent et le ballon à trois volets dans l'outil de sertissage. Appuyez sur la poignée pour déformer radialement le stent à être sertie sur le ballon.
    2. Inspectez le stent serti en utilisant un microscope pour uniforme sertissage et aucun signe de défaillance de la structure en raisonà déformation plastique.
    3. Développer pour le diamètre de 3 mm conçu en pressurisant le ballon à trois volets avec de l'eau. Examiner les stents élargis pour les fractures microscopiques et l'expansion uniforme.

3. Caractérisation de stent pour le champ magnétique conservée

REMARQUE: aimant cylindrique de 2 pouces de diamètre et 1 pouce de hauteur a été utilisé dans cette étude. Les pôles de l'aimant sont alignés le long de l'axe. La densité de surface de flux magnétique de l'aimant est d'environ 1 T.

  1. Magnétiser les stents diamétralement ou axialement l'aide d'un aimant néodyme forte. Tenez le stent à proximité de l'aimant puissant pour environ 1 min pour la magnétisation.
  2. Maintenir l'extenseur sur l'une des faces plates avec son diamètre le long des lignes de champ magnétique d'être magnétisés diamétralement ou tenir le stent à côté de la surface cylindrique avec son axe le long des lignes de champ magnétique pour magnétiser axialement. Fiel magnétique retenuD du stent a été jugée stable pendant au moins 24 heures, mais utiliser le stent dès que possible après aimantation.
  3. Montez les stents individuellement sur des mandrins de verre et puis montez les mandrins de verre dans le mandrin de précision de l'appareil de sondage magnétique. Sonde de microcapteurs magnétiques peut être positionné précisément à proximité du stent sans toucher la surface en utilisant la scène XYZ ensemble de l'appareil de sondage magnétique (Figure 4).
  4. Mesurer la lecture de référence du micro magnétique loin du stent, puis mesurer le champ magnétique retenu à la surface de l'endoprothèse en positionnant la sonde en utilisant les stades XYZ de l'appareil de sondage magnétique.

4. Études cellule de capture magnétiques

  1. Obtention de cellules, l'étiquetage avec SPION et coloration avec un colorant fluorescent
    1. Dériver les cellules endothéliales excroissance (COE) du sang périphérique porcine comme décrit dans 5,7. Culture dans un flacon T-75 until environ 80% de confluence (5x10 6 à 8x10 6 cellules).
    2. Synthétiser SPIONs que le diamètre de 10 nm de la magnétite (Fe 3 O 4) de noyau entouré par 50 nm d'épaisseur de poly (lactique-co-acide glycolique) (PLGA) comme décrit dans l'enveloppe 8,9.
    3. Incuber les COE dérivé avec SPION à une concentration de 200 ug / ml de milieu de culture cellulaire de 16 h à 37 o C.
    4. Aspirer le milieu de culture cellulaire doucement. Laver avec précaution les cellules en ajoutant 10 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le ballon, à bascule, et en aspirant le PBS.
    5. Colorer les cellules avec un colorant fluorescent (CM-Dil) pour visualiser lors des expériences. Ceci est réalisé selon les instructions du fabricant en ajoutant le colorant à 10 ml de milieu de culture cellulaire à une concentration de 5 ul / ml et l'incubation avec les cellules pendant 30 min à 37 ° C.
    6. Laver les cellules avec du PBS comme à l'étape 4.1.4 et incuber avec 3 ml de solution de trypsine-EDTA 0,25% pendant 5 minutes à 37 ° C etlever les cellules de la fiole.
    7. Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml, de haut avec du PBS, et centrifuger à 500 g pendant 5 min pour former un culot cellulaire.
    8. Remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS à une concentration de 1-2x10 6 cellules / ml et bien mélanger par pipetage dans et hors du tube conique à plusieurs reprises.
  2. Des études in vitro de cellules
    1. Concevoir et fabriquer (par exemple, l'impression 3D), un appareil simple pour tenir le stent juste au-dessus de la surface d'une lamelle de verre.
    2. Démagnétisez un stent à l'aide d'un démagnétiseur électromagnétique ou magnétiser un stent diamétralement ou axialement l'aide d'un aimant néodyme forte.
    3. Pipeter l'EOC de SPION marqué en suspension dans PBS dans le plat contenant les stents de contrôle axialement magnétisés ou diamétralement magnétisés ou non magnétisées. Image les stents avec EOC en suspension dans PBS immédiatement pour fluorescence à l'aide d'un microscope inversé à fluorescence.
5. Des études in vivo animaux

  1. Implantation d'un stent
    1. Dessinez le sang périphérique à partir de 4 porcs Yorkshire sains - pesant environ 50 kg - 3 semaines avant l'implantation du stent, respectivement, et la culture COE comme décrit dans 5,7.
    2. Administrer un médicament anti-plaquettaire à partir de 3 jours avant la chirurgie (aspirine 325 mg et clopidogrel 75 mg par jour).
    3. Le jour stent implantation, anesthésier les porcs avec intramusculaire Telazol, xylazine, et de l'atropine (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg, respectivement) comme indiqué dans les soins des animaux et de l'utilisation des directives institutionnelles applicables.
    4. Intuber et placer le porc sur l'inhalation de 1-2,5% isoflurane.
    5. Rasez la région du cou ventrale du porc et de mener la procédure dans des conditions stériles générales.
    6. Implant 1 magnétisé et 1 stent non-aimanté dans l'artère coronaire droite (RCA) en utilisant la technique de cathétérisme cardiaque standard.
      1. Catheterisation des animaux doit être réalisée par un cardiologue interventionnel formés. Accéder à l'artère carotide droite avec une gaine 9 français.
      2. Cathétériser l'artère coronaire cible et d'injecter un colorant de contraste iodé pour obtenir des images de radioscopie.
      3. Placer un fil de guidage coronaire norme 0,014 pouce dans l'artère. Avancer le ballon et le stent en utilisant ce fil de guidage et de déployer le stent dans un vaisseau 3-3,5 mm de diamètre.
    7. Occlure le flux sanguin à l'intérieur de l'extrémité proximale de RCA les stents implantés au moyen d'un ballonnet sur ​​fil et d'environ 2x10 6 fournir EOC autologues marquées avec SPION en suspension dans 4 ml de PBS par l'intermédiaire du cathéter central sur une période de 2 min.
    8. Restaurer le flux sanguin vers le RCA après 2 min d'occlusion supplémentaire.
    9. Transférer l'animal à la salle de récupération et de suivre de près l'animal jusqu'à ce qu'il a repris conscience.
    10. Continuer à administrer des médicaments anti-plaquettaire (aspirine 325 mg et clopidogrel 75 mg) après l'opération jusqu'au sacrifice.
  2. Expiant stent et l'histologie
    1. Euthanasier les animaux 7 jours après la chirurgie par abord anesthésier l'animal comme expliqué précédemment, puis administrer par voie intraveineuse une dose létale de pentobarbital de sodium (100 mg / kg) que par le soin des animaux et de l'utilisation des directives institutionnelles applicables.
    2. Récolter chirurgicalement les segments artériels stentées. Fixer les artères explantées dans un tampon de formol à 10% pour un minimum de 30 min. Laissez les échantillons dans un tampon de formol pour une analyse ultérieure histologique.
    3. Externaliser l'échantillon fixe d'installations capables d'effectuer l'histologie avec les stents métalliques. Au cours de ce traitement, les échantillons sont incorporer dans le méthacrylate de méthyle, en coupe transversale, et analysés histologiquement en utilisant la technique de coloration de Mallory avec taches bleu de Prusse pour les particules de fer.

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Résultats

Conception de stent itératif basé sur FEA (Figure 1) a montré un stent qui peut sertir et étendre avec une souche principale de 20%, ce qui est moins que la déformation à la rupture de 30%. Sertissage et l'essai d'expansion (figure 2) ne présentaient aucun signe de fracture. Photos du stent déformé ont montré une bonne entente avec déformations FEA calculés et aussi des photos microscopie montré aucune fracture (Figure 3). Comme on s'y attendait à part...

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Discussion

Nous avons développé un stent magnétique qui peut fonctionner comme un stent en métal nu et peut attirer les cellules endothéliales Spion marqué. Dans des études précédentes impliquant des stents magnétiques, les chercheurs ont utilisé nickel stents actifs commerciaux et des bobines ou des mailles en matériaux magnétiques en raison de l'indisponibilité d'un stent ferromagnétique 5,10-14. D'autres groupes ont également utilisé la nature paramagnétique disponibles dans le commerce de l'acier ino...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs remercient Tyra Witt, Cheri Mueske, Brant Newman et le Dr Peter J. Psaltis, MBBS, PhD pour leurs précieuses contributions. Cette étude a bénéficié du soutien financier du Fonds européen de développement régional – FNUSA-CICR (No. CZ.1.05/1.100/02.0123), la subvention de développement scientifique de l’American Heart Association (AHA #06-35185N), les National Institutes of Health (T32HL007111) et le Grainger Innovation Fund – Grainger Foundation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2205 Acier inoxydableCarpenter Technology CorporationMatériau de stock de barre ronde
AbaqusDassault systèmesLogiciel
AtropineMédicament sur ordonnance.
ClopidogrelNom commercial : Plavix. Médicament sur ordonnance.
CM-DiILife TechnologiesV-22888Sondes moléculaires, Eugene, OR
Milieu de croissance endothéliale-2LonzaCC-3162
Outil de sertissage portatifIngénierie par blocsM1-RMC
Acide chlorhydrique (HCl)Sigma AldrichMFCD00011324ATTENTION : porter l’équipement de propulsion et la poignée sous la hotte
Anesthésie à l’isofluranePiramal Critical Care, Inc.  ;
Alcool éthyliqueSigma AldrichMFCD00003568
NdFeB aimant 2 » Dia x 1 » d’épaisseurAimants étonnantsD1000PAimant disque magnétisé axialement avec pôles sur faces planes
BallonTout ballon à trois volets OTW disponible dans le commerce peut être utilisé
Saline tamponnée au phosphateLife Technologies10010-023Communément appelé bicarbonate de sodium PBS
(NaHCO3)Sigma AldrichMFCD00003528
pentobarbital sodiqueZoetisNom commercial : Sleepaway (26 %), FatalPlus, Beuthanasi.  ; Substance contrôlée à commander uniquement par vétérinaire
agréé SolidWorksDassault systemsLogiciel
Microcapteur SpinTJ-020 MicroMagneitcsSensible SolutionsSonde longue Microcapteur STJ-020 SPION
Mayo ClinicNanoparticules synthétisées en interne (Réf : Lee, S. J. et al. Nanoparticules d’oxydes ferriques magnétiques encapsulées avec du poly(D,L latide-co-glycolide) et leurs applications à l’agent de contraste d’imagerie par résonance magnétique. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi :DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
TelazolZoetisSubstance contrôlée à commander uniquement par vétérinaire
agréé Trypsine EDTALife Technologies25200-056Gibco, Grand Island, NY
XylazineBayer Animal HealthNom commercial : Rompun. La position solaire contrôlée ne doit être commandée que par un vétérinaire agréé
à trois volets Over-The-Wire

Références

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Réimpressions et autorisations

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