Protocole pour tridimensionnelle confocale Analyse morphométrique des astrocytes

Summary

Les astrocytes du SNC modifient leurs propriétés fonctionnelles et structurelles en réponse à des stimuli nocifs. Ce rapport présente un protocole d’évaluation de la morphologie tridimensionnelle des astrocytes dans des états pathologiques ou après des interventions thérapeutiques.

Abstract

Comme les cellules gliales dans le cerveau, les astrocytes ont divers rôles fonctionnels dans le système nerveux central. En présence de stimuli nocifs, les astrocytes modifier leurs propriétés fonctionnelles et structurales, une condition appelée astrogliose réactif. Ici, un protocole pour l'évaluation des propriétés morphologiques des astrocytes est présenté. Ce protocole inclut la quantification des 12 paramètres différents à savoir la zone de surface et le volume du tissu couvert par un astrocyte (territoire des astrocytes), l'ensemble des astrocytes notamment les branches, le corps de la cellule, et le noyau, ainsi que la longueur totale et le nombre de branches, l'intensité de fluorescence immunoréactivité des anticorps utilisés pour la détection des astrocytes, des astrocytes et de la densité (nombre / 1000 um ^2). A cet effet en trois dimensions (3D) des images microscopiques confocales ont été créés, et des logiciels d'analyse d'images 3D comme Volocity 6.3 a été utilisé pour les mesures. Les tissus du cerveau de rat exposés à la bêta-amyloïde _1-40 1-40), avec ou sans une intervention thérapeutique a été utilisé pour présenter la méthode. Ce protocole peut également être utilisé pour la 3D analyse morphométrique d'autres cellules provenant soit in vivo soit in vitro dans des conditions.

Introduction

En bonne santé du système nerveux central (SNC), les astrocytes jouent un rôle important dans la régulation de la circulation sanguine, le métabolisme énergétique, la fonction et la plasticité synaptique, et l'ion extracellulaire et neurotransmetteur homéostasie ^1-3. En outre, les astrocytes répondent à différents stimuli nocifs et les conditions anormales telles qu'un traumatisme, une infection, une ischémie ou une neurodégénérescence via astrogliose réactif qui est caractérisée par une hypertrophie, la prolifération et le remodelage fonctionnel de ^4,5 astrocytes.

Astrogliose réactif peut concevoir la répons....

Protocol

Cette étude a été réalisée en conformité avec les politiques énoncées dans le Guide pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire (NIH) approuvées par le Comité d'éthique de l'Université des sciences médicales de l'Iran (Téhéran, Iran).

1. Les animaux, la chirurgie et spécimens Préparatifs

NOTE: Préparer les tissus du cerveau pour l'analyse microscopique confocale 3D.

1. Diviser les animaux au hasard en deux groupes: le peptide Aß _1-40 -Injection (n = 8), et Aß _1-40 -Injection traitement avec la génistéine (n = 8); administrer la génistéine (....

Results

Cette section présente quelques exemples des observations qualitatives et quantitatives produites par l'analyse morphométrique 3D. Pour les résultats complets de l'ensemble des 12 paramètres mentionnés plus tôt, s'il vous plaît voir notre publication précédente ^10.

Observations qualitatives

Les astrocytes exposées branches minces ou épaisses qui étaient généralement longtemps dans Aß _1-40 rats injectés (Figure 1). Quelques p.......

Discussion

Dans le protocole actuel, nous avons utilisé la morphométrie confocale 3D pour évaluer 12 paramètres différents qui ont été associés à la morphologie des astrocytes. A cet effet, l'hippocampe de rats tissu avec Aß _{1-40 -} astrogliose induit, avec ou sans prétraitement de la génistéine en tant qu'agent anti-inflammatoire ont été utilisés. En utilisant des images 3D et des logiciels morphométrique, nous avons pu montrer l'effet de la génistéine sur astrogliose-à-dire la morphologie des astro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bêta-amyloïde 1-40	Sigma Aldrich	79793	Garder en -70 ° ; C
Genistein	Sigma Aldrich	446-72-0	garder en -20 ° ; C
Anticorps polycolonaux de lapin contre la protéine acide fibrillaire gliale	DAKO	Z0334
Anticorps IgG anti-lapin conjugués alcalins au phosphate	DAKO
Liquid Permanent Chromogen	DAKO	K0640
Liquid permanent Red Substrate Buffer	DAKO	K0640
Cremophor EL	Sigma Aldrich	27963	Huile de ricin polyéthoxylée - Étape 1.1
LSM 700 Microscopie confocale à balayage laser	Carl Zeiss
Volocité 6.3	Perkin Elmer Inc.,Analyse
d’images 2000	Tekno Optic
Appareil stréotaxique	Stoelting
Graph pad Prism 5	Graph pad software Inc.