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Early Viral entrée dosages pour l'identification et l'évaluation des composés antiviraux

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DOI :

10.3791/53124

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29 octobre 2015

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1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole qui examine des étapes spécifiques de l’entrée virale afin d’identifier et d’évaluer de nouveaux agents antiviraux.

Résumé

Les systèmes cellulaires sont utiles pour découvrir des agents antiviraux. La dissection du cycle de vie viral, en particulier les premiers stades d’entrée, permet une approche mécaniste pour identifier et évaluer les agents antiviraux qui ciblent des étapes spécifiques de l’entrée virale. Dans le présent rapport, les méthodes d’examen de l’inactivation virale, de l’attachement viral et de l’entrée/fusion virale en tant que tests antiviraux à ces fins sont décrites, à l’aide du virus de l’hépatite C comme modèle. Ces tests devraient être utiles pour découvrir de nouveaux antagonistes/inhibiteurs de l’entrée virale précoce et aider à élargir la portée des agents antiviraux candidats pour le développement de médicaments.

Introduction

Les infections virales constituent une menace constante pour la santé publique et une cause importante de maladies épidémiques, de morbidité et de décès dans le monde. Les modes spécifiques de lutte contre les infections virales comprennent la mise au point de vaccins et de traitements antiviraux. Bien que les efforts de vaccination aient permis d’immuniser contre plusieurs virus, de nombreux agents pathogènes viraux n’ont toujours pas de vaccin protecteur, notamment le virus de la dengue (DENV), le cytomégalovirus humain (HCMV), le virus de l’hépatite C (VHC), le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et le virus respiratoire syncytial (VRS)1-5. Les antiviraux, quant à eux, jouent un rôle important dans la gestion de ces infections virales lorsque les vaccins prophylactiques ne sont pas disponibles. Cependant, à ce jour, il n’existe que peu de médicaments antiviraux homologués et rentables par rapport au nombre d’agents pathogènes viraux qui menacent la santé publique. Plus important encore, en raison de l’augmentation des voyages dans le monde et de l’urbanisation rapide, la situation est aggravée par les risques d’épidémies dues à des infections virales émergentes/réémergentes qui sont introduites dans des zones non indigènes6. Les récentes éclosions causées par le virus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), les virus de la grippe (H1N1, H5N1, H3N2 et H7N9), le DENV, le virus du Nil occidental (VNO), le virus de la rougeole (MV), le virus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) et le virus Ebola6-12 sont parmi les exemples qui témoignent de la nécessité de mettre au point des antiviraux lorsque la vaccination et/ou les traitements ne sont pas disponibles. De plus, il existe toujours un risque potentiel de générer des infections résistantes aux médicaments avec les antiviraux actuellement utilisés. Par conséquent, le développement et l’élargissement continus de la gamme d’antiviraux à ces infections virales émergentes ou réémergentes sont nécessaires pour fournir de meilleures stratégies de gestion et protéger la santé publique.

La plupart des thérapies antivirales consistent en des antiviraux à action directe (AAD) qui ciblent une protéine virale spécifique ou un cofacteur qui intervient dans des étapes importantes du cycle de vie viral. Par exemple, l’analogue nucléosidique acyclovir inhibe l’ADN polymérase de l’herpèsvirus, les inhibiteurs de la protéase bocéprévir et télaprévir antagonisent le VHC NS3, et l’oseltamivir et le zanamivir sont des inhibiteurs de la neuraminidase qui bloquent la libération de particules virales de la grippe à partir des cellules infectées13-15. Il existe cependant très peu d’inhibiteurs viraux homologués, notamment l’Enfuvirtide, qui cible la gp41 du VIH pour empêcher la fusion, et le Maraviroc, qui bloque le corécepteur du VIH CCR5, empêchant ainsi l’entrée virale16. L’exploration de nouveaux antagonistes/inhibiteurs de l’entrée virale pourrait aider à fournir des traitements supplémentaires à des fins prophylactiques ou thérapeutiques, par exemple en association avec d’autres antiviraux ayant un mécanisme d’action différent pour mieux gérer les infections virales17-19.

L’identification des antiviraux peut impliquer la conception de médicaments guidée par la structure et une stratégie basée sur le criblage de médicaments candidats. Les méthodes d’évaluation de l’activité antivirale des agents d’essai comprennent les dosages biochimiques de l’activité enzymatique et l’évaluation par des systèmes cellulaires20-23. Dans les systèmes cellulaires, le cycle de vie viral peut être disséqué en stades distincts de l’infection, tels que les événements d’entrée (attachement, fusion, désenrobage), la phase de réplication (réplication du génome viral et traduction des protéines) et la sortie du virion (assemblage, maturation et libération). Étant donné que les tests peuvent être adaptés pour étudier chaque étape spécifique à l’aide de divers outils et méthodes, cette approche permet l’identification et l’examen d’antiviraux candidats potentiels dotés d’un mécanisme d’action spécifique ciblant les différentes étapes analysées. Par exemple, pour analyser l’effet du médicament spécifiquement sur les particules virales libres avant de se lier à la cellule hôte, un « test d’inactivation virale » peut être effectué. Dans ce test, le virus est laissé incuber avec le médicament testé, puis dilué pour titrer le médicament avant d’infecter une monocouche cellulaire. Des étapes supplémentaires telles que l’attachement viral et les étapes d’entrée/fusion peuvent également être analysées individuellement, en modifiant la température pendant l’infection. Pour de nombreux virus enveloppés, l’entrée/fusion virale au niveau de la membrane de la cellule hôte est grandement facilitée à 37 °C, mais elle est généralement exclue à 4 °C, ce qui n’affecte pas la liaisondu virus entre 24 et 29. Enfin, l’utilisation de virus rapporteurs ou de systèmes cellulaires pourrait faciliter ces études et permettre une analyse à haut débit.

Nous avons précédemment utilisé l’approche cellulaire et disséqué l’entrée précoce de divers virus enveloppés pour l’examen des composés antiviraux susceptibles d’antagoniser l’entrée virale30,31. Les différentes méthodes utilisées, y compris l’inactivation virale, l’attachement viral et les tests d’entrée/fusion virale, sont décrites.

Protocole

Remarque: Veiller à ce que toutes les procédures impliquant la culture cellulaire et infection par le virus sont menées dans les hottes de biosécurité certifiés qui sont appropriés pour le niveau des échantillons de biosécurité être manipulé. Aux fins de la description des protocoles, la luciférase de Gaussia VHC à marquage rapporteur est utilisé comme un modèle de virus 32. Dans le contexte des résultats représentatifs, l'acide des composés de chébulagique (CHLA) et punicalagin (PUG) sont utilisés comme antiviraux candidats qui ciblent les interactions avec les glycosaminoglycanes glycoprotéine virale de surface cellulaire lors de l'entrée virale premières étapes 31. L'héparine, qui est connu pour interférer avec l'entrée de nombreux virus 30,31,33,34, est utilisé comme un traitement de contrôle positif dans ce contexte. Pour des informations de base sur des techniques de virologie, la propagation de virus, la détermination du titre du virus, et l'expression de la dose infectieuse en unités formant des plages (PFU), concentrer les unités de formage (FFU), ou multiplicité d'infection (MOI), le lecteur est re35 préféré pour référencer. Pour des exemples antérieurs et des conditions optimisées utilisés pour les virus indiqués dans les résultats représentatifs, le lecteur est renvoyé aux références 30-32,36-39 ainsi que les détails figurant au tableau 1, figure 1A et la figure 2A.

1. Culture cellulaire, Préparation composé et composé de cytotoxicité

  1. Cultiver la lignée cellulaire respectif pour le système d'infection par le virus à analyser (tableau 1). Pour le HCV, cultiver les cellules Huh-7,5 dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 200 U / ml de pénicilline G, 200 ug / ml de streptomycine et 0,5 pg / ml d'amphotéricine B.
  2. Préparation des composés d'essai et les témoins en utilisant leurs solvants respectifs: par exemple, dissoudre ABSC et PUG dans le diméthylsulfoxyde (DMSO); préparer l'héparine dans l'eau double distillée stérile. Pour tous les autres dilutions, utiliser des milieux de culture.
    Remarque: Le concent finaleration de DMSO dans les traitements composés de test est inférieure à 1% dans les expériences; 1% de DMSO est comprise comme traitement témoin négatif dans les tests de comparaison.
  3. Déterminer la cytotoxicité des composés à tester (par exemple, ABSC et PUG) sur les cellules pour l'infection virale en utilisant une viabilité cellulaire déterminer réactif tel que le XTT (2,3-bis [2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl] -5-phénylamino) carbonyl] -2H-tétrazolium hydroxyde):
    1. Pour le VHC, ensemencer 7,5 Huh-cellules dans une plaque de 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur O / N pour obtenir une monocouche.
    2. Appliquer témoin de DMSO (1%) ou des concentrations croissantes de composés d'essai ABSC et PUG (ex. 0, 10, 50, 100, et 500 pM) dans les puits de culture en triple exemplaire.
    3. Incuber à 37 ° C pendant 72 heures, puis jeter le milieu dans la plaque et laver les cellules avec 200 pi de tampon phosphate salin (PBS) deux fois.
    4. Ajouter 100 pi de assaying de solution du kit test in vitro en toxicologie-XTT dans chaque puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant encore 3 heures pour permettre la production XTT formazan.
    5. Déterminer l'absorbance avec un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de test de 492 nm et une longueur d'onde de 690 nm de référence.
    6. Calculer le pourcentage de survie des cellules en utilisant la formule suivante: viabilité cellulaire (%) = A / As x 100%, où «A» et «sous» se référer à l'absorbance des composés d'essai et le témoin de solvant (par exemple 1% de DMSO. ) traitements, respectivement. Déterminer la concentration de 50% de cytotoxicité cellulaire (CC 50) des composés d'essai à partir d'un logiciel d'analyse tel que GraphPad Prism selon le protocole du fabricant.

2. Lecture de l'infection virale

Remarque: La lecture d'une infection virale dépend du système de virus utilisé et peut impliquer des procédés tels que des dosages de plaques ou meaSuring signaux rapporteurs de virus rapporteurs marqués. Procédé pour détecter une infection par le VHC reporter sur la base de l'activité rapporteur de la luciférase est décrite ci-dessous.

  1. Recueillir les surnageants des puits infectés et de clarifier à 17.000 xg dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C.
  2. Mélanger 20 ul de surnageant de test à 50 ul de substrat de la luciférase à partir de la trousse de dosage de la luciférase de Gaussia et de mesurer directement avec un luminomètre selon les instructions du fabricant.
  3. Exprimer HCV infectieux tel que log 10 d'unités lumineuses relatives (RLU) de détermination de l'inhibition virale (%) et de calculer la concentration efficace 50% (EC50) des composés d'essai contre une infection par le VHC en utilisant des algorithmes de logiciel GraphPad Prism selon le protocole du fabricant.

3. Inactivation virale Assay

Remarque: Des exemples de période d'incubation et la dose virale de différents virus aRE admises à la figure 1A. Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU.

  1. Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d'obtenir une monocouche.
  2. Incuber les composés ou des contrôles essai (concentrations finales sont: CHLA = 50 uM; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) avec les particules de VHC à 37 ° C (figure 1A, «à long terme» ) dans un rapport de 1: 1. Par exemple, pour un inoculum de virus de 100 pi contenant 1 x 10 4 FFU, ajouter 100 ul d'une dilution de travail de 100 uM ABSC; on obtient de l'ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM.
  3. On dilue le mélange virus-drogue de concentration (sans effet) "sous-thérapeutique" des composés d'essai. Par exemple, la concentration inefficace de l'ABSC et PUG contre le VHC est à 1 uM 31; doncceci nécessite une dilution de 50 fois du mélange virus-médicament qui peut être accompli avec 9,8 ml de milieu basal (milieu de culture cellulaire avec 2% de FBS).
    Remarque: La dilution à la concentration de sous-thérapeutique empêche l'interaction significative entre les composés d'essai et la surface de la cellule hôte et permet l'examen de l'effet du traitement sur les virions exempts de cellules. Notez que cette dilution est dépendante de la dose-réponse antivirale des composés d'essai contre l'infection virale particulière, et il est déterminé avant de réaliser cet essai particulier 31.
  4. A titre de comparaison, le virus mélanger avec les composés d'essai et dilué immédiatement (pas de période d'incubation) de concentration sub-thérapeutique avant l'infection (Figure 1A, «à court terme»).
  5. Ajouter 100 pi du mélange VHC-médicament dilué sur le Huh-7,5 monocouche de cellules (la quantité de virus est maintenant à 1 x 10 2 FFU; finale MOI = 0,01) et incuber pendant 3 heures à 37 ° C pour permettre viraleadsorption.
  6. Suite à l'infection, retirer le inoculum dilué et laver délicatement les puits avec 200 pi de PBS deux fois.
    Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules.
  7. Appliquer 100 pi de milieu de base à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 72 heures.
  8. Analyser l'infection résultant en testant le surnageant pour l'activité luciférase comme décrit dans '2. Lecture d'une infection virale.

4. virale Attachment Assay

Remarque: Les exemples de la période d'incubation et la dose virale pour divers virus sont répertoriés dans la figure 2A, «attachement». Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU.

  1. Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d'obtenir une monocouche.
  2. Pré-refroidir les monocouches de cellules dans des plaques à 4 ° C for 1 h.
  3. Co-traiter les cellules infectées par le VHC inoculum (MOI = 0,01) et les composés d'essai ou de contrôle (concentrations finales sont: CHLA = 50 uM; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) à 4 ° C pour 3 h. Par exemple, pour un inoculum de virus de 90 ul contenant 1 x 10 2 FFU, ajouter 10 ul d'une dilution de travail de 500 uM ABSC; on obtient de l'ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM et une infection par le VHC à une MOI = 0,01 sur la monocouche cellulaire.
    Remarque: Il est important de réaliser l'expérience à 4 ° C, car elle permet la liaison du virus mais empêche l'entrée qui se produit le plus efficacement à 37 ° C. Effectuer l'addition de composés de virus et de test sur de la glace et l'incubation qui a suivi dans un réfrigérateur à 4 C ° pour garantir que la température est maintenue à 4 ° C.
  4. Retirer le surnageant et laver délicatement la monocouche cellulaire avec 200 pi de PBS glacé deux fois.
    Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules <./ li>
  5. Appliquer 100 pi de milieu de base à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 72 heures.
  6. Analyser l'infection résultant en testant le surnageant pour l'activité luciférase comme décrit dans '2. Lecture d'une infection virale.

5. virale Entrée / Fusion Assay

Remarque: Exemple de périodes d'incubation et dose virale pour divers virus sont répertoriés dans 'Entrée / Fusion' Figure 2A. Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU.

  1. Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d'obtenir une monocouche.
  2. Pré-refroidir les monocouches de cellules dans des plaques à 4 ° C pendant 1 heure.
  3. Infecter les cellules infectées par le VHC (MOI = 0,01) à 4 ° C pendant 3 heures. Par exemple, utiliser un inoculum viral 100 ul contenant 1 x 10 2 FFU.
    Remarque: Effectuez l'Addition de l'inoculum viral sur de la glace et l'incubation qui a suivi dans un réfrigérateur à 4 C ° pour maintenir la température à 4 ° C, ce qui permet l'entrée virale, mais non obligatoire.
  4. Retirer le surnageant et laver délicatement les monocouches de cellules avec 200 pi de PBS glacé deux fois.
    Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules.
  5. Traiter les puits avec les composés d'essai ou de contrôle (concentrations finales sont les suivantes: 50 uM = ABSC; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) et incuber à 37 ° C pendant 3 heures. Par exemple, ajouter 10 ul d'une dilution de travail 500 um CHLA à 90 pi de milieu, mélanger, et de traiter les puits; on obtient de l'ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM.
    Remarque: Le passage de 4 ° C à 37 ° C facilite désormais l'événement d'entrée / fusion virale et permet donc l'évaluation de l'effet de composés de test sur cette étape particulière.
  6. Aspirer le surnageant contenant le médicament et enlever non intérioriséles virus extracellulaires, soit par lavage avec 200 ul de tampon citrate (citrate de sodium 50 mM, chlorure de potassium 4, pH 3,0) ou du PBS. Appliquer 100 ul de milieu de base avant l'incubation à 37 ° C pendant 72 h.
  7. Analyser l'infection résultant en testant le surnageant pour l'activité luciférase comme décrit dans '2. Lecture d'une infection virale.

Résultats

Dans la figure 1, le «test d'inactivation virale» a été réalisée pour examiner si deux composés naturels CHLA et PUG spécifiques pourraient inactiver les virus enveloppés dans différents état ​​libre-cellulaire et prévenir l'infection ultérieure. La réponse à la dose antivirale et la cytotoxicité de ces composés ont été déterminées avant l'exécution de l'étude mécaniste 31. Les virus ont été pré-traitées avec les composés d'essai et ensuite les mélanges virus-médicament ont été dilués à des concentrations sous-thérapeutiques avant l'inoculation sur la monocouche de cellule respectif pour chaque système de virus. Comme le montre la figure 1, les deux ABSC et PUG sont apparus pour interagir avec les virions exempts de cellules, ce qui entraîne des effets irréversibles qui protégeaient la monocouche de cellules à partir de l'infection ultérieure. Les deux composés d'essai réalisé un près de 100% d'inhibition contre le HCMV, le VHC et DENV-2, alors qu'un 60 - bloc 80% a été observée contre MV et RSV. Ces résultats SuggEst ce que l'ABSC et PUG ont un impact direct sur ces particules virales libres en les neutralisant l'inactivation et leur infectivité.

Dans la figure 2, l'attachement et d'entrée / essais de fusion ont été réalisées pour étudier l'effet de l'ABSC et PUG contre ces événements virales précoces liées entrée-de HCMV, VHC, DENV-2, MV, et RSV. Les deux CHLA et PUG efficacement empêché liaison des virus étudiés sur la cellule hôte respective comme indiqué par l'inhibition de l'infection virale résultante (Figure 2, «attachement»: barres gris clair). L'effet inhibiteur sur l'attachement du virus par les deux composés était semblable contre HCMV (figure 2B), le VHC (figure 2C), DENV-2 (figure 2D), et RSV (Figure 2F), allant de 90 - 100%. D'autre part, PUG semblait être plus efficace que l'ABSC contre MV liaison (Figure 2E), le taux de la tw d'inhibitioncomposés o variant entre 50 - 80%. L'héparine de traitement de commande, qui est connu pour bloquer l'entrée de nombreux virus, aussi inhibé la fixation de HCMV, DENV-2, RSV, annonce MV, mais est moins efficace contre le VHC. Le suivi 'essai entrée / fusion virale' examiner si CHLA et PUG ont conservé leur activité au cours de la phase entrée du virus / fusion (Figure 2, 'Entrée / Fusion ": barres gris foncé). Encore une fois, les deux ABSC et PUG ont été observés à altérer efficacement l'étape d'entrée / de fusion virale des virus examinés (Figure 2B - F), ce qui donne un 50 - effet protecteur de 90% sur la monocouche de cellule respectif. Héparine aussi puissamment inhibé entrée / fusion dans DENV-2 et les infections à VRS, mais était moins efficace contre le HCMV, le VHC et MV (<40% d'inhibition en moyenne).

Virus Type de cellule
HCMV HEL
VHC Huh-7.5
DENV-2 Vero
MV CHO-SLAM
RSV HEp-2

Tableau 1:. Hôte type de cellule à une infection virale du type de cellule utilisé pour chaque système d'infection virale décrit dans les résultats représentatifs est indiquée. Des détails supplémentaires concernant les cellules peuvent être trouvés dans la référence 31.

figure-results-1
Figure 1. L'inactivation des infections virales par les composés de test CHLA et PUG Différents virus ont été traités avec les composés d'essai pendant une longue période. (Incubé pendant 1,5 à 3 h avant le titrage; barres gris clair) ou une période courte (dilué immédiatement; gris foncé bars) à 37 ° C avant une dilution de concentration sub-thérapeutiquetion et l'analyse ultérieure de l'infection sur les cellules hôtes respectives. (A) Schéma de l'expérience (montré sur la gauche) avec la concentration de virus final (PFU / puits ou MOI), à long terme période virus médicament incubation (i), et le temps d'incubation subséquente (ii) indiqué pour chaque virus dans le tableau sur la droite. Les analyses de (B) de HCMV, (C) le VHC, (D) DENV-2, (E) MV, et (F) de RSV sont indiqués dans chaque panneau supplémentaire. Les résultats sont tracées en fonction du traitement de contrôle négatif DMSO pour infection par le virus ainsi que les données représentées sont les moyennes ± l'erreur-type de la moyenne (SEM) à partir de trois expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié de la référence 31. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. L'évaluation des activités antivirales de composés d'essai ABSC et PUG contre l'attachement du virus et l'entrée / fusion. (A) Le mode opératoire expérimental, la concentration en virus (PFU / puits ou MOI), et le moment de l'addition et le traitement avec les composés d'essai (i, ii, iii) sont présentés pour chaque virus dans les schémas et les tableaux associés. Dans l'analyse de fixation de virus (barres gris clair), des monocouches de différents types de cellules ont été pré-refroidi à 4 ° C pendant 1 heure, puis co-traités avec les virus respectifs et les composés d'essai à 4 ° C (1,5 - 3 h, i) avant de rincer les inoculats et les composés d'essai à une incubation ultérieure (37 ° C, ii) et de l'examen de l'infection par le virus. Dans l'entrée du virus / analyse de fusion (barres gris foncé), des monocouches de cellules ensemencées ont été pré-refroidi à 4 ° C pendant 1 h et ensuite provoqués avec chacun des virus à 4 ° C pendant 1,5 - 3 h (i). Les cellules ont ensuitelavé et traité avec des composés d'essai pendant une période d'incubation supplémentaire (ii) au cours de laquelle la température a été décalé à 37 ° C pour faciliter l'événement d'entrée / fusion virale. A la fin de l'incubation, les virus extracellulaires ont été retirés soit par un tampon citrate (pH 3,0) ou lavages au PBS et les cellules ont été encore incubées (iii) pour l'analyse d'une infection par virus. Résultats pour (B) HCMV, (C) le VHC, (D) DENV-2, (E) MV, et (F) RSV sont indiqués dans chaque panneau supplémentaire. Les données sont tracées en fonction du traitement de contrôle négatif de DMSO infection par le virus et sont présentées comme moyenne ± SEM à partir de trois expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié de la référence 31. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Dans ce rapport, les méthodes d’identification et d’évaluation des composés antiviraux fondées sur une approche mécaniste de dissection des événements d’entrée virale précoce ont été décrites. Plus précisément, les tests nous ont permis d’examiner l’effet des composés testés sur les particules virales libres, la fixation virale et l’entrée/fusion virale. Des étapes critiques ont été mises en œuvre pour évaluer distinctement l’effet du médicament sur le stade spécifique de l’entrée virale précoce. Par exemple, dans le « test d’inactivation virale », la dilution du mélange virus-médicament à une concentration sous-thérapeutique empêche une interaction significative entre le composé testé et la surface de la cellule hôte en « titrant » le médicament. Cela permet de s’assurer que l’effet inhibiteur observé sur l’infection ultérieure de la cellule hôte est dû à une interaction directe entre le composé testé et les virions acellulaires, plutôt qu’à un effet du composé testé sur la membrane de la cellule hôte ou les molécules associées à la membrane, y compris les récepteurs viraux30. De même, le décalage de température entre 4 °C (qui permet la liaison du virus mais pas l’entrée) et 37 °C (qui facilite l’entrée/fusion du virus) dans le « test d’attachement viral » et le « test d’entrée/fusion virale » est crucial pour déterminer l’effet du composé testé sur chacun de ces événements spécifiques. Ceci est possible en raison de la sensibilité à la température des virus enveloppés au cours de ces étapes de l’infection24-29. Il est donc important que les dosages soient effectués à la température indiquée pour garantir l’exactitude des résultats ; par exemple, en réalisant l’expérience sur de la glace pour la maintenir à 4 °C et en plaçant l’échantillon directement dans un incubateur à 37 °C pour le changement de température. De plus, l’utilisation de témoins négatifs (ex. solvant DMSO pour la préparation de médicaments) et positifs (ex. traitement à l’héparine) permet également d’établir davantage la précision des dosages. L’utilité et l’applicabilité de ces méthodes ont été démontrées dans de nombreuses études antivirales26,30,31,40,41. Il convient de noter que, bien que l’héparine soit incluse comme témoin pour les trois tests dans le contexte des résultats représentatifs, elle bloque généralement la liaison initiale au virus plutôt que l’étape de fusion/entrée qui s’ensuit (comme le montrent les données de la figure 2). D’autres mesures de contrôle pourraient également être utilisées, comme des anticorps neutralisants dirigés contre le virus (pour l’essai d’inactivation virale), des anticorps qui masquent les récepteurs de surface cellulaire du virus (pour l’essai d’attachement viral) et des inhibiteurs de fusion membranaire (pour l’essai de fusion virale ou d’entrée).

Les tests décrits dans ce rapport, qui sont spécifiques aux premiers stades de l’infection virale, sont utiles en termes d’application en tant que tests secondaires pour caractériser le mécanisme d’action des médicaments candidats à partir de criblages primaires qui ciblent généralement l’infection virale plus largement. Alternativement, ils pourraient également être incorporés dans les cribles primaires si l’on recherche spécifiquement des inhibiteurs de l’entrée virale précoce, y compris les agents inactivateurs du virus, les antagonistes de l’attachement viral et les inhibiteurs de l’entrée/fusion virale. Dans ce cas, leur utilisation permet une analyse de criblage plus ciblée et plus précise pour l’identification de candidats antiviraux spécifiques au mécanisme, ce qui, à son tour, accélérerait le développement de médicaments en aval.

L’utilisation d’essais cellulaires pour identifier les agents antiviraux offre plusieurs avantages importants par rapport aux essais biochimiques, notamment la révélation d’effets potentiels hors cible (tels que la cytotoxicité) et l’ajout d’une pertinence physiologique à la bioactivité des agents d’essai42. Ces questions sont des considérations importantes pour décider si un agent candidat est utile pour la poursuite dans les phases ultérieures du développement du médicament. De même, les tests spécifiques précoces à l’entrée virale décrits dans ce rapport permettent d’examiner l’effet du médicament sur l’étape distincte de l’entrée virale au niveau cellulaire, et plus particulièrement dans le contexte d’une infection virale authentique in vitro. Les résultats obtenus à partir de ces tests permettraient donc de mieux prédire l’efficacité antivirale des composés testés et d’identifier les effets hors cible potentiellement indésirables contre la cellule hôte. Une limitation potentielle est cependant qu’un essai in vitro basé sur des cellules peut ne pas refléter complètement l’étape d’entrée in vivo réelle dans le contexte d’une infection virale naturelle. Néanmoins, les tests présentés dans ce protocole servent de plate-forme analytique pour l’identification et l’évaluation basées sur le mécanisme de nouveaux agents antiviraux.

La mise au point de virus rapporteurs ou de systèmes de cellules rapporteures pour quantifier la quantité d’infection virale a grandement facilité le dépistage cellulaire et l’évaluation des composés antiviraux. On peut citer par exemple l’utilisation de virus recombinants porteurs d’un gène rapporteur ou au moyen de lignées cellulaires humaines recombinantes contenant un gène rapporteur piloté par le promoteur spécifique du virus31,43. Dans ce rapport, l’infection par le VHC marqué à la luciférase peut être facilement surveillée en quantifiant le signal rapporteur, facilitant ainsi l’analyse des données. En incorporant ces outils utiles basés sur des rapporteurs, les tests d’entrée virale précoce décrits ici peuvent essentiellement être adaptés au format à haut débit pour le criblage basé sur le mécanisme de banques de petites molécules.

En conclusion, un protocole a été décrit pour des tests disséquant l’entrée virale précoce comme moyen d’identifier et d’évaluer des composés antiviraux spécifiques au mécanisme. De tels tests seraient utiles pour découvrir de nouveaux antagonistes/inhibiteurs de l’entrée virale et aideraient à élargir la portée des agents antiviraux pour le développement en tant que traitements prophylactiques et/ou thérapeutiques.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’existe pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Cette étude est financée par l’hôpital universitaire médical de Taipei (102TMU-TMUH-19) et le ministère des Sciences et de la Technologie de Taïwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMGIBCO11995-040
FBSGIBCO26140-079
Pénicilline-StreptomycineGIBCO15070-063
Amphotéricine BGIBCO15290-018
DMSOSigmaD5879
Kit de dosage toxicologique in vitro,SigmaTOX2
à base de XTTPBS pH 7,4GIBCO10010023
Lecteur de microplaquesThermo Scientific89087-320
MicrocentrifugeuseThermo Scientific75002420
BioLux Kit de dosage de la Gaussia luciféraseNew England BiolabsE3300L  ;   ;   ;
LuminomètrePromegaGloMax-20/20
Citrate de sodium, dihydratéSigma71402
Chlorurede potassium SigmaP5405

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