Article de méthode

Cartographie optique du commerce intra-réticulum sarcoplasmique Ca 2+ Et potentiel transmembranaire dans le Lapin Coeur Langendorff perfusé

DOI :

10.3791/53166

⸱

10 septembre 2015

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California Davis, 2Departments of Pharmacology and Biomedical Engineering, University of California Davis

Dans cet article

Résumé

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Cet article décrit le protocole détaillé et l'équipement nécessaire pour une double cartographie optique du potentiel transmembranaire (V m) et d'une connexion intra-réticulum sarcoplasmique (SR) Ca 2+ dans le coeur de lapin Langendorff perfusé. Cette méthode permet l'observation directe et la quantification de V m et SR Ca 2+ dynamique dans le coeur intact.

Résumé

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La manipulation du réticulum sarcoplasmique (SR) Ca2+ joue un rôle clé dans le couplage normal excitation-contraction et la manipulation aberrante du SR Ca2+ est connue pour jouer un rôle important dans certains types d’arythmie. Parce que les arythmies sont des phénomènes émergents spatialement distincts, elles doivent être étudiées au niveau tissulaire. Cependant, les méthodes permettant de sonder directement SR Ca2+ dans le cœur intact restent limitées. Cet article décrit le protocole pour la cartographie optique double du potentiel transmembranaire (Vm) et de l’intra-SR libre [Ca2+] ([Ca2+]SR) dans le cœur de lapin perfusé par Langendorff. Cette approche tire parti de l’indicateur de faible affinité Ca2+ Fluo-5N, qui a une fluorescence minimale dans le cytosol où le [Ca2+] intracellulaire ([Ca2+]i est relativement faible) mais présente une fluorescence significative dans la lumière de la RS où [Ca2+]SR est dans la gamme millimolaire. En plus de révéler spatialement les caractéristiques de la RS Ca2+ sur toute la surface épicardique du cœur, cette approche présente l’avantage distinct de la surveillance simultanée de Vm, ce qui permet d’étudier la relation bidirectionnelle entre Vm et la RS Ca2+ et le rôle de la RS Ca2+ dans les phénomènes arythmogènes.

Introduction

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La cartographie optique double du Ca2+ intracellulaire et du potentiel transmembranaire (Vm) dans le cœur intact perfusé par Langendorff est devenue un pilier des recherches en électrophysiologie cardiaque, y compris les mécanismes de l’arythmie et du couplage excitation-contraction1-4. Cette approche a fourni des connaissances sans précédent sur l’électrophysiologie normale et anormale et, surtout, sur la relation bidirectionnelle entre Vm et Ca2+ intracellulaire. Cependant, la cartographie optique du Ca2+ intracellulaire avec des indicateurs fluorescents de haute affinité (tels que Rhod-2 et Fluo-4) ne rapporte que les changements en vrac du Ca2+ intracellulaire et est incapable de distinguer si ces changements sont dus au flux, à la libération et à la recapture transmembranaires du Ca2+ dans les réserves intracellulaires ou, dans la plupart des cas, à une combinaison des deux. De plus, les indicateurs Ca2+ de haute affinité ont une cinétique marche-arrêt lente et peuvent ne pas signaler avec précision les changements rapides de la concentration de Ca2+ 5.

Chaque potentiel d’action déclenche une augmentation du Ca2+ intracellulaire, connu sous le nom de transitoire Ca2+ intracellulaire (CaT). Dans le cœur des mammifères, environ 70 à 90 % du CaT total est dû à la libération de Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique (SR) via l’ouverture des récepteurs de la ryanodine (RyRs)6. Au sein de la RS, environ la moitié du total de Ca2+ est liée à la calséquestrine (CSQ) et à d’autres tampons intra-SR7, qui jouent un rôle important dans l’homéostasie de la RS Ca2+ 8,9. La quantité de SR Ca2+ libre dicte la force motrice de la libération de SR Ca2+ ainsi que le déclenchement de RyR, et a donc un impact significatif sur le CaT intracellulaire. De plus, les altérations de la libération ou de la recapture de SR Ca2+ peuvent, à leur tour, avoir un impact sur Vm via l’échange électrogène Na+-Ca2+, ce qui peut avoir des conséquences arythmogènes. Par conséquent, en plus du CaT, la surveillance de la SR libre Ca2+ peut fournir des informations importantes sur le dysfonctionnement contractile et électrophysiologique.

Au cours des dernières années, les chercheurs ont fait des progrès significatifs dans la surveillance de la RS Ca2+ dans les myocytes cardiaques isolés et à partir d’un seul endroit sur le cœur intact. L’une de ces méthodes nécessite des impulsions rapides de caféine pour ouvrir les RyR et la teneur en Ca2+ SR est ensuite déduite ou calculée à partir de l’augmentation immédiate du Ca2 + 10 intracellulaire. Une autre approche intrigante utilise des indicateurs Ca2+ de faible affinité, tels que Fluo-5N11 ou Mag-Fluo412, qui se lient à la SR libre Ca2+. Ces indicateurs ont des constantes de dissociation (Kd) comprises entre 10 et 400 μM et présentent donc une fluorescence minimale dans le cytosol par rapport à la lumière de la RS, où la concentration de Ca2+ ([Ca2+]SR) est de l’ordre du millimolaire. À l’aide d’indicateurs de faible affinité Ca2+, plusieurs aspects du cycle de la SR Ca2+ ont été étudiés au niveau du myocyte isolé, notamment la libération fractionnée de Ca2+ et les mécanismes des alternances de Ca2+ 13,14. Cependant, afin de bien comprendre la nature hétérogène du cycle de SR Ca2+ dans le cœur intact et le rôle de SR Ca2+ dans des phénomènes arythmiques spatialement distincts, des méthodes d’imagerie de SR Ca2+ sur la surface épicardique du cœur intact sont nécessaires15.

Cet article décrit la méthodologie de cartographie optique double de SR Ca2+ et Vm libres dans le cœur de lapin intact perfusé de Langendorff avec l’indicateur de faible affinité Ca2+ Fluo-5N. En plus de révéler spatialement les caractéristiques de la RS Ca2+ sur toute la surface épicardique du cœur, cette approche présente l’avantage de la surveillance simultanée de Vm, ce qui permet d’étudier la relation bidirectionnelle entre Vm et la RS Ca2+.

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Protocole

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Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Comité de l'Université de Californie, Davis, et adhéré à la Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health.

1. Préparation

  1. Préparer deux concentrés (25X) les stocks de solution modifiée de Tyrode à l'avance et conserver à 4 ° C: (1) Stock I (en mM: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26.25) et (2) Stock II (en mM: NaHCO 3 500).
    1. Fraîchement préparer une solution de 2 L Tyrode de la composition suivante (en mM): NaCl 128,2, CaCl 2 1,3, KCl 4,7, MgCl2 1,05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO 3 20 et glucose 11,1 en combinant 1840 ml d'eau désionisée (DI) l'eau, 80 ml Stock I, 80 ml de stock II, et 4 g de glucose. Ne pas mélanger directement Stock I et II Stock; ajouter lem à 1.840 ml DI pour éviter la précipitation.
  2. Préparer la solution d'achat d'actions de l'excitation-contraction découplant blebbistatin à 10 mg / ml dans anhydre di-méthylsulfoxyde (DMSO) à l'avance et conserver la solution d'achat d'actions à 4 ° C.
  3. Préparer des solutions mères de colorants fluorescents: (1) RH237 tension sensible colorant (1 mg / ml dans le DMSO) et (2) Indicateur de faible affinité calcium Fluo-5N AM (2 mg / ml dans le DMSO) selon les recommandations du fabricant. Utilisez les préparatifs immédiatement pour éviter la décomposition avec perte subséquente de la capacité de chargement.
  4. Le premier système de recirculation de la perfusion de Langendorff avec oxygénée (95% de O 2, CO 2 5%) solution de Tyrode. Régler le débit de O 2 / CO 2 pour maintenir le pH de la solution de Tyrode à 7,4 ± 0,05. Utilisez un filtre net en ligne en nylon tissé (taille des pores: 11 pm) pour filtrer en continu la solution de perfusion.
    1. Premier système de perfusion à température ambiante, comme loadi ultérieureng de Fluo-5N AM est effectuée à température ambiante. Pour Fluo-5N AM chargement, utiliser un petit volume de recirculation de perfusion (~ 150 ml). Après charge de colorant, utiliser un plus grand volume de liquide de perfusion (1 - 2 L, voir figure 1C).
  5. Tournez sur le système d'acquisition de données et de préparer pour la surveillance en continu de l'ECG et de la perfusion pression. Préparer le système de surveillance de pression: Brancher un capteur de pression à la ligne de perfusion et de surveiller la pression de perfusion avec un amplificateur de Transbridge. Ajuster la pression de perfusion de base à 0 mm de Hg lorsque le coeur ne soit pas connectée au système de perfusion.
  6. Alignez les caméras de cartographie optique pour assurer un alignement spatiale entre le m V et SR Ca 2+ signaux.
    1. Tout d'abord, concentrer les caméras en plaçant une règle ou un objet avec le texte dans le plat de perfusion. Tournez les caméras de cartographie dans un mode de vue en direct et la mise au point jusqu'à ce que le texte est clair et net. Acquérir une image de trame unique de chaque caméra.
    2. Overlayces images et d'ajuster la transparence de l'image du haut de sorte que les deux images sont visibles. Le texte dans les images doivent se chevaucher exactement. Si pas parfaitement alignés, de régler l'angle du miroir dichroïque ou la position de chaque caméra jusqu'à ce que les deux images sont alignées.

2. récolte, de perfusion, et Dye-chargement du Lapin Coeur

  1. Fixez le lapin dans un dispositif de retenue de lapin approuvé. Profondément anesthésier via une injection intraveineuse (veine marginale de l'oreille) de pentobarbital sodique (50 mg / kg) et de l'héparine (1000 IU).
    1. Lorsque le lapin affiche absence de réflexes nociceptifs, faire une incision cutanée médiane pour exposer le sternum et les côtes. Couper à travers le sternum avec des ciseaux chirurgicaux contondants pointe de la xyphoïde au manubrium. Prenez soin de ne pas endommager le coeur lors de l'ouverture du sternum. Étaler les côtes pour exposer le coeur.
    2. Exciser rapidement l'ensemble du bloc cœur-poumon en coupant rapidement tous les navires et les tissus conjonctifs. Immediadiatement placer le bloc cœur-poumon dans la solution glacée Tyrode.
  2. Situer l'aorte pour perfusion rétrograde. Couper l'aorte ascendante juste en amont de trois branches de la crosse aortique. Cathétériser l'aorte à une canule de 8 G connecté au système de perfusion. Utilisez un morceau de suture USP 0 de soie pour sécuriser l'aorte sur la canule.
  3. Disséquer soigneusement la trachée, poumons, et la graisse épicardique du coeur. Avec une pince et des ciseaux pointus de dissection, localisez la valve mitrale et soigneusement d'endommager ou de retirer un dépliant pour prévenir la congestion de la solution dans le ventricule gauche.
  4. Immerger le coeur dans la chambre de perfusion verre chemisé horizontalement avec la surface antérieure du cœur vers le haut pour l'imagerie. Fixer la canule à un morceau de Sylgard avec les repères en forme de U sur le fond de la coupelle de silicium pour empêcher le mouvement du cœur au cours de la cartographie (figure 1D). Si désiré, ajouter une petite épingle d'insectes à la pointe du cœur pour stabilisation.
  5. Position électrocardiogramme (ECG) électrodes dans le bain sur le côté droit et gauche du cœur. Immerger entièrement les électrodes dans le bain et veiller à ce qu'ils ne sont pas en contact avec la surface du cœur de fournir un ECG de volume menée analogue à une configuration plomb I. Vérifier un plomb je ECG morphologie normale. Ajuster le flux (25 - 35 ml / min) pour s'assurer que la pression aortique est maintenue à 60 - 70 mm de Hg.
  6. Éteignez les lumières de la pièce et d'ajouter de 0,3 à 0,6 ml de solution stock blebbistatin (étape 1.2) au perfusat (concentration finale 10 - 20 uM).
    1. Éteignez les lumières des chambres pour éviter photoinactivation de blebbistatin. Si nécessaire, un petit coup de projecteur ou projecteur peuvent être utilisés pour fournir un éclairage de la tâche.
      Remarque: blebbistatin est un inhibiteur d'ATPase de la myosine et un découpleur excitation-contraction. Parce Fluo-5N chargement nécessite des conditions prolongées (60 min) RT (hypothermie) (voir les étapes 2.8 - 2.10), la production d'énergie cardiaque pourrait être compromise. Therefore, plus de blebbistatin dans le perfusat avant charge de colorant peut réduire la demande d'énergie 16 et d'éliminer les artefacts de mouvement pendant les enregistrements optiques ultérieurs 17.
  7. Lorsque la contraction du cœur a cessé (10 - 15 min, vérifié sur l'enregistrement de la pression aortique), basculer vers le système de recirculation perfusion de petit volume (voir l'étape 1.4.1).
  8. Préparer et charger solution de chargement Fluo-5N AM: Ajouter 0,25 ml de Fluo-5N AM solution stock (étape 1.3) à 0,25 ml chaude 20% de Pluronic F127. Ajouter 0,5 ml de solution de Tyrode chaud au mélange, bien mélanger et ajouter au système de recirculation perfusion de petit volume.
  9. Surveiller en permanence la pression de perfusion et de l'ECG et de régler le débit si nécessaire. Dye chargement dure environ 1 heure à température ambiante. 45 min après le chargement a commencé, tourner sur le bain d'eau circulant pour commencer le réchauffement du système de perfusion et de perfusion à 37 ° C.
  10. Après 60 min de Fluo-5N AM chargement, switch la perfusion à l'ensemble du système de recirculation de perfusion de volume (voir l'étape 1.4).
  11. Diluer 50 pi de tension sensible solution colorant RH237 de stock (étape 1.3) dans 1 ml de la solution de Tyrode tiède et ajoutez lentement (~ 5 minutes) dans une proximale de l'orifice d'injection de la canule.

3. cartographie optique

  1. Pendant les derniers moments de charge de colorant, positionner le coeur et concentrer les caméras de cartographie optique pour assurer le champ approprié de vue de l'expérience.
  2. Si désiré, placer une électrode de stimulation bipolaire sur la surface épicardique du cœur pour la stimulation.
  3. Placez un plastique ou en verre lamelle sur la surface de la chambre de perfusion pour réduire l'artefact de mouvement sur la surface du liquide qui peut être présent en raison de la recirculation du liquide de perfusion.
    Remarque: Comme alternative à une lamelle, utilisez un couvercle de Petri plat propre plastique de 50 mm.
  4. Concentrer les guides de lumière pour éclairer uniformément la surface du cœur avec eXCitation lumière. Utilisez diode électroluminescente bleue (LED) sources de lumière et de filtrer davantage la lumière avec un 475-495 nm filtre passe-bande (figure 1A).
  5. Recueillir fluorescence émise avec un macroscope et deux complémentaires métal-oxyde-semiconducteur (CMOS) caméras de cartographie optique. Diviser la lumière émise avec un miroir dichroïque à 545 nm.
    1. Filtre passe-long de la longueur d'onde fragment, contenant le signal de V m, à 700 nm. -Filtre passe-bande de longueur d'onde la plus courte fragment, contenant le SR signal de Ca 2+, 502 à 534 nm (figure 1A). Régler la fréquence d'acquisition de données optiques de 0,5 à 1 kHz.
  6. Pour chaque enregistrement optique, d'abord lancer le protocole de stimulation souhaité, allumez la lumière d'excitation, et de recueillir: 1 - 4 sec des données. Si désiré, synchroniser l'acquisition des protocoles et des données stimulation.
    Remarque: Il est impossible de re-charger le Fluo-5N AM, donc le rapport signal sur bruit (SNR) sera decreasoi tout au long de l'expérience en raison de teindre les fuites de la SR. Limitez protocole expérimental à 1 - 2 h pour assurer des valeurs élevées de SNR.
  7. À la suite de l'expérience, laver le système de perfusion dans la séquence de l'eau DI, 70% d'alcool réactif, et de nouveau avec de l'eau DI.
  8. Filtre à chaque jeu de données avec un filtre gaussien spatial (rayon de 3 pixels) en utilisant des progiciels disponibles dans le commerce selon le protocole du fabricant.
  9. Si nécessaire, aligner spatialement la m V et SR Ca 2+ ensembles de données. Comme à l'étape 1.6, superposer des images de chaque caméra et vérifier que les structures anatomiques du coeur (ie., Vasculaire coronaire, les bords des oreillettes ou les ventricules) ou d'autres objets dans le champ de vision (par exemple, la canule, l'électrode de stimulation) exactement chevauchement. Si non, alignement spatial des ensembles de données est nécessaire.
  10. Décaler l'image supérieure transparente dans le x et y direction jusqu'à ce que le chevauchement exacte est atteinte, en prenant note du nombre de pixelsl'image doit être décalée dans chaque direction. L'ensemble des données correspondant à l'image du haut (soit V m ou SR Ca 2+) doit alors être déplacé par le nombre déterminé de pixels dans chaque direction pour assurer un alignement précis entre le m V et SR Ca 2+ ensembles de données.

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Résultats

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La figure 1A représente un diagramme schématique de la configuration optique pour double m V SR Ca2 + et la cartographie. Avec cette configuration, il ya une séparation spectrale complète de la m V et SR Ca 2+ signaux (figure 1B). Un schéma du système de perfusion à double boucle utilisée pour Fluo-5N colorant chargement est illustrée à la figure 1C. La figure 1D montre l'orientation horizontale du coeur dans ...

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Discussion

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Les clés du succès Fluo-5N charge de colorant sont la configuration recirculation perfusion de petit volume, ce qui permet une concentration élevée Fluo-5N sans avoir besoin de grandes quantités de colorant, la longueur des temps de chargement (1 h), et effectuer le chargement à la température ambiante. Si le chargement est effectué à des températures physiologiques, l'activité enzymatique cellulaire rapidement clive le tag de -AM lorsque le colorant traverse la membrane cellulaire, le piégeage des molécules de colo...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu en partie par les National Institutes of Health des États-Unis (R01 HL 111600) et l’American Heart Association (12SDG9010015).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
NaClFisher ScientificS271-1Composant de la solution de Tyrode
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500Composant de la solution de Tyrode
KClFisher ScientificS217-500Composant de la solution de Tyrode
MgCl2 (6H2O)Fisher ScientificM33-500Composant de la solution de Tyrode
NaH2PO4 (H2O)FisherScientific S369-500Composant de la solution
de Tyrode NaHCO3ScientificS233-3Composant de la solution de Tyrode
D-GlucoseFisher ScientificD16-1Composant de la solution de Tyrode
95 % O2 5 % CO2AirCarbogen de gazPour l’oxygénation et le pH de la solution de Tyrode
BlebbitatineTocris Bioscience1760Découpleur d’excitation-contraction
RH237Biotium61018Colorant sensible au voltage
Fluo-5N AMInvitrogenF-26915Indicateur de faible affinité Ca2+ ; Alternative : Invitrogen F-14204 ; Le chargement doit être effectué à température ambiante
Pluronic F127Biotium59004Pour le chargement de l’indicateur Ca2+ ; Réchauffer jusqu’à ce que la solution soit claire avant utilisation
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD2650Pour dissoudre la blebbistatine et les colorants
FiltreEMD MilliporeNY110470011 μ ; m Filtre en ligne
Transducteur de pressionWPIBLPR2Pour mesurer la pression de perfusion
Transpont Transducteur AmplificateurWPISYS-TBM4MPour transduire/amplifier le signal de pression ; PowerLab peut également être utilisé avec les instruments BioAmp PowerLab
26Tl’enregistrementcontinu des signaux de pression et ECG
THT MacroscopeSciMediaConfiguration optique macroscopique. Détails : Objectif 0,63X (NA = 0,31), objectif à condensation 2X, champ de vision résultant = 3,1 cm x 3,1 cm, profondeur de champ = ~ 1,5 mm
MiCam Ultima-L CMOSSciMediaCaméras de cartographie optique
Spot LED de précisionMightexPLS-0470-030-15-SSource lumineuse LED
Fisher appropriés Pour

Références

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Mots-clés

Calcium du r ticulum sarcoplasmiqueperfusion de LangendorffFluo 5N AMcolorant sensible au voltagechargement d indicateur de calciumimagerie double longueur d ondem canismes de l arythmie

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