Quantification tridimensionnelle d'épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Summary

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Abstract

Épines dendritiques sont des petites saillies qui correspondent aux compartiments post-synaptiques excitateurs de synapses du système nerveux central. Ils sont répartis le long des dendrites. Leur morphologie est largement tributaire de l'activité neuronale, et ils sont dynamiques. Épines dendritiques expriment des récepteurs glutamatergiques (NMDA et AMPA récepteurs) sur leur surface et au niveau de la densité post-synaptique. Chaque colonne permet le neurone de contrôler son activité étatique et local indépendamment. Morphologies de la colonne vertébrale ont été largement étudiées dans les cellules pyramidales du cortex glutamatergiques du cerveau, en utilisant deux approches in vivo et des cultures de neurones obtenus à partir de tissus de rongeurs. Neuropathologiques conditions peuvent être associées à l'induction de l'altération de la colonne vertébrale et maturation, comme représenté sur les rongeurs neurones en culture et l'analyse quantitative unidimensionnelle ^1. La présente étude décrit un protocole pour l'analyse quantitative des morphologies 3D de la colonne vertébrale en utilisant cortic humaineal neurones dérivés de cellules souches neuronales corticales (progéniteurs tardifs). Ces cellules ont été initialement obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites. Ce protocole permet l'analyse des morphologies de la colonne vertébrale pendant les périodes de culture différents, et avec possibilité de comparaison entre des cellules souches pluripotentes induites obtenues à partir d'individus témoins avec ceux obtenus à partir de patients atteints de maladies psychiatriques.

Introduction

Épines dendritiques des neurones corticaux pyramidales sont de petites protubérances minces et qui sont distribués le long des dendrites basales et apicales de ces sous-types de neurones dans des rongeurs, des primates, et de cerveau humain. Ils sont les sites de la plupart des synapses excitateurs et afficher les fonctions clés de l'apprentissage et les processus cognitifs. Les structures détaillées des épines dendritiques humaines ont été techniquement étudié par microscopie électronique ^2. Cependant, une telle approche est de temps et représente lourde charge de travail. Plus récemment, un à trois dimensions (3D) de reconstruction de la morphologie ....

Protocol

1. neuronale Culture

Remarque: la reprogrammation des fibroblastes en cellules souches pluripotentes, l'engagement à la lignée dorsale de télencéphale, dérivation, l'amplification, et la banque de progéniteurs corticaux fin (LCP) ont été décrits dans Boissart et al ^4. La différenciation neuronale des cellules de LCP-like a également été effectuée selon Boissart et al ⁴ avec de légères modifications. D'autres procédés ont été développés pour la reprogrammation directe de fibroblastes dans des cellules souches pluripotentes induites suivie de leur différenciation en neurones. Ce protocole a ....

Results

La présente étude décrit un protocole normalisé pour la colonne vertébrale quantification des dendrites culture de neurones pyramidaux dérivés de iPSC. Ce protocole permet l'analyse de la colonne vertébrale maturation sur les neurones humains et sa possible par rapport à la maturation des épines dans des cultures neuronales de rongeurs standard ainsi que in vivo dans des modèles animaux.

La figure 1A représente un schéma des différentes étapes de culture qui permett.......

Discussion

La quantification des caractéristiques morphologiques de neurones pyramidaux appuyé sur le logiciel. L'interface filament traceur a été utilisé pour la segmentation des neurones et des épines, et le module de XT a été utilisé pour leur analyse.

Pour analyser l'exactitude de notre technique, nous avons d'abord comparé les paramètres mesurés morphologiques (longueur, surface et volume total de la colonne vertébrale le cas échéant), avec ceux publiés en utilisant rat neurones pyrami.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-PBS (1x), sans Calcium, Magnésium et Rouge de Phénol	Gibco/ Life Technologies	14190169
Solution de Poly-L-Ornithine Bioréactif	Sigma Aldrich	P4957
Laminine de souris	Dutscher Dominique	354232
N2 Supplément	Gibco/ Life Technologies	17502048
B-27 Supplément sans vitamine A (50 fois)	Gibco/ Life Technologies	12587010
DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-mercaptoéthanol	Gibco/ Life Technologies	31350-010
Pénicilline-Steptomycine	Gibco/ Life Technologies	15140-122
GFP Sérum de lapin Anticorps polyclonal	Gibco/ Life Technologies	A-6455
Sérum de cheval	Gibco/ Life Technologies	16050130
Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-Lapin  ;	Gibco/ Life Technologies	A11034
Polyclonal Anti-betaIII tubuline	Anticorps Millipore	AB9354
Coverglass 13 mm	VWR	631-0150
Prolong Gold Antifade Réactif avec DAPI	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid	Sigma Aldrich Chimie	P7949
Triton X-100	Sigma Aldrich Chimie	X100-100ML
Fibroblastes humains	Coriell Cell Line Biorepository	GM 4603 et GM 1869	Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
Microscope confocal à balayage laser	Zeiss (Allemagne)	LSM 700
Imaris Software	Bitplane AG, Zurich	version 6.4.0	Les modules Filament Tracer et Imaris XT sont nécessaires
Logiciel	Huygens Logiciel Huygens, SVI, Pays-Bas	Version Pro	En option (pour les tests de déconvolution)