Quantification tridimensionnelle d'épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Summary

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Abstract

Épines dendritiques sont des petites saillies qui correspondent aux compartiments post-synaptiques excitateurs de synapses du système nerveux central. Ils sont répartis le long des dendrites. Leur morphologie est largement tributaire de l'activité neuronale, et ils sont dynamiques. Épines dendritiques expriment des récepteurs glutamatergiques (NMDA et AMPA récepteurs) sur leur surface et au niveau de la densité post-synaptique. Chaque colonne permet le neurone de contrôler son activité étatique et local indépendamment. Morphologies de la colonne vertébrale ont été largement étudiées dans les cellules pyramidales du cortex glutamatergiques du cerveau, en utilisant deux approches in vivo et des cultures de neurones obtenus à partir de tissus de rongeurs. Neuropathologiques conditions peuvent être associées à l'induction de l'altération de la colonne vertébrale et maturation, comme représenté sur les rongeurs neurones en culture et l'analyse quantitative unidimensionnelle ^1. La présente étude décrit un protocole pour l'analyse quantitative des morphologies 3D de la colonne vertébrale en utilisant cortic humaineal neurones dérivés de cellules souches neuronales corticales (progéniteurs tardifs). Ces cellules ont été initialement obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites. Ce protocole permet l'analyse des morphologies de la colonne vertébrale pendant les périodes de culture différents, et avec possibilité de comparaison entre des cellules souches pluripotentes induites obtenues à partir d'individus témoins avec ceux obtenus à partir de patients atteints de maladies psychiatriques.

Introduction

Épines dendritiques des neurones corticaux pyramidales sont de petites protubérances minces et qui sont distribués le long des dendrites basales et apicales de ces sous-types de neurones dans des rongeurs, des primates, et de cerveau humain. Ils sont les sites de la plupart des synapses excitateurs et afficher les fonctions clés de l'apprentissage et les processus cognitifs. Les structures détaillées des épines dendritiques humaines ont été techniquement étudié par microscopie électronique ^2. Cependant, une telle approche est de temps et représente lourde charge de travail. Plus récemment, un à trois dimensions (3D) de reconstruction de la morphologie des épines dendritiques a été rapporté dans le cortex du cerveau humain en utilisant un logiciel spécifique combiné à large analyse de la colonne vertébrale manuel ^3.

La protéine de fluorescence verte (GFP) couplé à la technologie immunofluorescence représente un outil précis pour l'identification de la colonne vertébrale et la mesure de la forme de microscopie de fluorescence. Cette approche peut être facilement appliquée à des neurones en culture. However, aucune donnée n'a été signalé sur l'analyse de la colonne vertébrale la maturation et la morphologie sur les neurones humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC).

L'objectif de cette étude était de décrire un protocole, qui permet l'imagerie de la colonne vertébrale dendritique de neurones humains cultivés in vitro. L'étiquetage de la GFP, microscopie confocale et analyse 3D avec le module filament Tracer de logiciels Imaris ont été utilisés dans le présent protocole. Étapes de culture qui sont nécessaires pour obtenir des neurones glutamatergiques corticaux de couches II à IV à partir de cellules souches neurales (NSC) sont également brièvement décrit ici. L'ensemble du protocole pour la production NSC humaine a déjà été publié ailleurs ^4.

Protocol

1. neuronale Culture

Remarque: la reprogrammation des fibroblastes en cellules souches pluripotentes, l'engagement à la lignée dorsale de télencéphale, dérivation, l'amplification, et la banque de progéniteurs corticaux fin (LCP) ont été décrits dans Boissart et al ^4. La différenciation neuronale des cellules de LCP-like a également été effectuée selon Boissart et al ⁴ avec de légères modifications. D'autres procédés ont été développés pour la reprogrammation directe de fibroblastes dans des cellules souches pluripotentes induites suivie de leur différenciation en neurones. Ce protocole a été retenue car elle permet la production sélective des neurones glutamatergiques pyramidaux.

1. Traiter 6 puits des plaques de culture avec des lamelles de verre avec de la poly-ornithine (dilué au 1/6 dans du DPBS, concentration stock 0,01%) O / N, suivie de trois lavages dans DPBS. Puis ajouter la laminine (concentration de stock 1 mg / ml, dilué 500 fois dans du DPBS) pendant au moins 10 heures sous la hotte à flux .
2. Plate et envoyé NSC à basse densité (50.000 cellules / cm ²⁾ dans 6 puits des plaques de culture avec des lamelles de verre dans 3 ml de milieu de culture constitué de DMEM / F12 (500 ml), 2 flacons (5 ml chacun) de supplément N2, 2 flacons (10 ml chacun) de supplément B27, 10 ml de Pen-streptomycine (Penicillin = 10.000 unités / ml et de la streptomycine = 10.000 unités / ml), 1 ml de 2-mercaptoéthanol (Solution mère: 50 mM) et de la laminine (1 / 500), sans facteurs de croissance. Étape critique: Effectuer cette étape avec soin en ajoutant des cellules avec des mouvements rotatifs lents afin de réduire le regroupement de cellules.
3. Retirez le milieu de culture. Ajouter moyen de N2B27 frais contenant 2 pg / ml de solution de laminine frais pour garder le neurone fixé sur les lamelles de verre et d'éviter l'agglutination. Changer le milieu tous les 3 jours. Garder une partie du milieu restant (200 ul) avant d'ajouter du milieu frais afin d'éviter le séchage de la cellule. Sinon, procéder rapidement et de changer le volume total (3 ml).

e_title "> 2. Lentiviral transduction

Remarque: vecteurs lentiviraux GFP ont été aimablement fournies par le Dr Uwe Maskos laboratoire à l'Institut Pasteur (Paris) et préparés selon le protocole publié ^5. Expression de la GFP est entraîné par le promoteur de phosphoglycérate kinase de souris (PGK). Pour cette étude, titre viral était de 400 ng / ul (solution mère dans du PBS 1x).

1. Transduction de neurones humains iPSC dérivés, à quelque étape de maturation par des particules virales en ajoutant 1 pl de la solution de réserve contenant 40 ng de la GFP vecteur lentiviral par puits de culture (plaques de 6 puits) et incuber pendant 48 heures dans un milieu de culture frais. Remarque: Pour ce protocole, la durée d'incubation permet un bon étiquetage des structures de la colonne vertébrale.

3. immunofluorescence

Remarque: Afin d'améliorer l'étiquetage de l'ensemble morphologie du rachis, l'étiquetage d'immunofluorescence a été effectuée en utilisant un anticorps anti-GFP dans des conditions perméabilisées.

1. Retirer milieu de culture et de fixer les cellules transduites sur des lamelles dans du paraformaldéhyde 4% pendant 10 min à température ambiante, puis laver 3 fois dans du PBS 1X (10 minutes chacun).
2. Des lamelles de immerger dans PBS additionné de 0,05% de Triton (100x) et 10% de sérum de cheval pour 1 heure à température ambiante, puis laver 3 fois en PBS 1x.
3. Ajouter 100 ul de 1 x PBS additionné de 4% de sérum de cheval et l'anticorps primaire (1/1000) dirigé contre la GFP et dilué par un facteur de 1000 sur chaque lamelle. Incuber dans une boîte sombre O / N à 4 ° C, puis laver 3 fois avec PBS 1x.
4. Diluer Alexa Fluor 488 conjugué anticorps (1/200) dans du PBS supplémenté avec 0,5% de Tween 20 et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Puis laver 3 fois en PBS 1x et monter des lamelles sur des lames de verre avec un milieu de montage pour la microscopie de fluorescence.

4. épines dendritiques Imaging

1. Effectuer imagerie confocale à travers un microscope confocal à balayage laser microscope.
2. Sélectionner neurones sains avec une morphologie pyramidaletrouver une arborisation dendritique complet, et de quantifier au moins 10 neurones par l'état à partir d'expériences distinctes. Quantifier 60 - 100 um par Dendrite.
3. Acquérir des images à l'aide d'une huile 40X NA = 1,3 objective et une ligne laser de 488 nm pour la GFP excitation, avec une puissance de crête typique au niveau de l'échantillon environ 20 uW. Définir la taille du pixel autour de 80 nm à échantillonner convenablement épines dendritiques.
   Remarque: L'appel de l'analyse subséquente pour une image dans laquelle le bruit ne compromet pas la bonne segmentation des dendrites et des épines. Avec les réglages d'échantillonnage et de puissance spatiales mentionnés ci-dessus, nous avons observé que un pixel temps de séjour de 3,15 ms est suffisante pour collecter suffisamment de photons pour construire une telle image. Pour les échantillons sombres, la qualité d'image peut être améliorée en moyenne de 2 à 4 scans. L'acquisition de plusieurs tuiles XY peut être nécessaire pour couvrir la région d'intérêt, qui doit ensuite être cousus ensemble avant le traitement.
4. Pour goûter à la totalité du volume de neurone, acquérir un Z-stack, avecZ un espacement allant de 150 nm à 300 nm, ce qui donne 20 à 30 Z tranches.
   Remarque: La résolution spatiale latérale atteint avec ces paramètres est de 234 nm et la résolution axiale est de 591 nm. L'échantillonnage est ici choisie suffisante, mais que la résolution axiale est plus grande que la plus petite taille des épines à imager, l'analyse favorise les épines qui se prolongent latéralement à partir des dendrites.
   

5. 3D Quantification des épines dendritiques

Remarque: Les sections suivantes décrivent spécifiquement l'utilisation du logiciel Imaris pour analyse. Implémentations alternatives existent, y compris NeuronStudio ^{15 ou} Metamorph ^8, qui peut fournir des résultats similaires.

Utilisez les paramètres clés suivants:

1. Comme une étape de pré-traitement, utiliser le filtrage gaussien à travers les installations de traitement d'image offertes par le logiciel. Effectuer un filtrage gaussien par le traitement d'image> Smoochose> filtre gaussien. Régler la largeur de filtre pour être égale à la taille des pixels en XY.
2. Effectuer un tracé semi-automatique de dendrites, en utilisant le module filament Tracer du logiciel.
   1. Tout d'abord, estimer le diamètre Dendrite, en utilisant l'outil de la distance dans l'onglet tranche du logiciel.
   2. Dans l'onglet Surpass, cliquez sur l'outil de filaments. Pour une meilleure robustesse, ce protocole repose sur le suivi semi-automatique; cliquer sur la création automatique Ignorer. L'interface du module montre maintenant l'onglet Draw. Ici, sélectionnez AutoPath comme une méthode, Dendrite comme un type, et l'entrée du diamètre de dendrites estimé.
   3. Utilisez le mode de sélection du pointeur, tournant le curseur dans une boîte. Maj-clic-droit sur le point de départ de dendrites. Remarque: le logiciel effectue les calculs initiaux.
   4. Déplacez le pointeur le long de la dendrites. Du point de départ (représentered comme une sphère bleue), une ligne jaune représentant le chemin de dendrites plus probable est indiquée. Maj-clic gauche sur le point de terminaison de dendrites.
3. Effectuez la épines segmentation automatique. Remarque: Les épines sur la dendrite tracé se trouvent automatiquement par l'interface du module.
   1. Dans l'interface du module, cliquez sur l'onglet Création. Dans la liste déroulante Reconstruire, choisissez Reconstruire Dendrite Diamètre et cochez la case de données Conserver. Puis cliquez sur Reconstruire.
   2. Régler le seuil de sorte que le volume segmenté correspond au volume réel de dendrites. Comme un algorithme, sélectionnez Distance la plus courte de Carte Distance. Cliquez sur le bouton Suivant.
   3. Déterminer le plus petit diamètre de la tête de la colonne vertébrale et la longueur maximale, à nouveau en utilisant l'outil de la distance dans l'onglet tranche du logiciel, puis de revenir à l'onglet dépasser et entrer les paramètres. Fou ce protocole, les valeurs autour de 200 - 300 nm pour le diamètre minimal et 4 um pour la longueur maximale sont de bons points de départ. Ne cochez pas la case Autoriser Direction épines. Cliquez sur le bouton Suivant.
   4. Réglez le Seuil Points de semences afin que les points bleus représentant épines localisent aux chefs de la colonne vertébrale réels. Cliquez sur le bouton Suivant. Note: Le calcul de base est fait maintenant et peut être long.
4. Classer les épines en allant à l'onglet Outils de l'interface du module. Cliquez sur Classer épines. Dans l'interface utilisateur invité, assurez-vous qu'il ya quatre catégories définies par leur morphologie comme suit: Stubby: longueur <1 pm; Champignon: Longueur (colonne vertébrale)> 3 et la largeur maximum (de la tête)> largeur moyenne (cou) x 2; Long et mince: Largeur moyenne (tête) ≥ Largeur moyenne (cou); Filopodia comme: Longueur ≤ 4 pm (sans tête).
   Remarque: La moInterface Dule génère quatre nouveaux objets à incandescence contenant les résultats de la classification.
5. Exporter des données statistiques: sur l'un de ces quatre interfaces d'objets, cliquez sur l'onglet Statistiques.
   Cliquez sur l'exportation toutes les statistiques to File.
   Remarque: D'autres valeurs statistiques peuvent être exportés pour dendrites (. Par exemple, longueur, surface, diamètre moyen, la profondeur de la branche, la ramification angle, volume, etc.), Et pour les épines (par exemple, la rectitude, zone de fixation, la longueur et le volume des distincte parties de la colonne vertébrale, diamètre de la colonne vertébrale, les densités, etc.)

Results

La présente étude décrit un protocole normalisé pour la colonne vertébrale quantification des dendrites culture de neurones pyramidaux dérivés de iPSC. Ce protocole permet l'analyse de la colonne vertébrale maturation sur les neurones humains et sa possible par rapport à la maturation des épines dans des cultures neuronales de rongeurs standard ainsi que in vivo dans des modèles animaux.

La figure 1A représente un schéma des différentes étapes de culture qui permett...

Discussion

La quantification des caractéristiques morphologiques de neurones pyramidaux appuyé sur le logiciel. L'interface filament traceur a été utilisé pour la segmentation des neurones et des épines, et le module de XT a été utilisé pour leur analyse.

Pour analyser l'exactitude de notre technique, nous avons d'abord comparé les paramètres mesurés morphologiques (longueur, surface et volume total de la colonne vertébrale le cas échéant), avec ceux publiés en utilisant rat neurones pyrami...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-PBS (1x), sans Calcium, Magnésium et Rouge de Phénol	Gibco/ Life Technologies	14190169
Solution de Poly-L-Ornithine Bioréactif	Sigma Aldrich	P4957
Laminine de souris	Dutscher Dominique	354232
N2 Supplément	Gibco/ Life Technologies	17502048
B-27 Supplément sans vitamine A (50 fois)	Gibco/ Life Technologies	12587010
DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-mercaptoéthanol	Gibco/ Life Technologies	31350-010
Pénicilline-Steptomycine	Gibco/ Life Technologies	15140-122
GFP Sérum de lapin Anticorps polyclonal	Gibco/ Life Technologies	A-6455
Sérum de cheval	Gibco/ Life Technologies	16050130
Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-Lapin  ;	Gibco/ Life Technologies	A11034
Polyclonal Anti-betaIII tubuline	Anticorps Millipore	AB9354
Coverglass 13 mm	VWR	631-0150
Prolong Gold Antifade Réactif avec DAPI	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid	Sigma Aldrich Chimie	P7949
Triton X-100	Sigma Aldrich Chimie	X100-100ML
Fibroblastes humains	Coriell Cell Line Biorepository	GM 4603 et GM 1869	Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
Microscope confocal à balayage laser	Zeiss (Allemagne)	LSM 700
Imaris Software	Bitplane AG, Zurich	version 6.4.0	Les modules Filament Tracer et Imaris XT sont nécessaires
Logiciel	Huygens Logiciel Huygens, SVI, Pays-Bas	Version Pro	En option (pour les tests de déconvolution)