Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciférase SERCaMP

Résumé

L’homéostasie calcique du réticulum endoplasmique est perturbée dans diverses pathologies. Un rapporteur de protéine de surveillance calcique du RE (SERCaMP) peut être utilisé pour détecter les perturbations dans le stockage du calcium du RE. Ce protocole décrit l’utilisation d’une SERCaMP de la gaussia luciférase pour examiner l’homéostasie calcique du RE in vitro et in vivo.

Résumé

Le réticulum endoplasmique (RE) contient le plus haut niveau de calcium intracellulaire, avec des concentrations d'environ 5000 fois plus élevée que les niveaux cytoplasmiques. Un contrôle serré sur ER calcium est impératif pour le repliement des protéines, la modification et la traite. Les perturbations à ER calcium peuvent conduire à l'activation de la réponse de la protéine dépliée, un mécanisme de réponse au stress du RE à trois broches, et contribuer à la pathogenèse d'une variété de maladies. La capacité de surveiller les modifications de calcium ER apparition et la progression au cours de la maladie est important en principe, mais difficile en pratique. Méthodes actuellement disponibles pour ER de surveillance de calcium, tels que les colorants et les protéines fluorescentes calcium-dépendante, ont permis de mieux comprendre la dynamique ER de calcium dans les cellules, mais ces outils ne sont pas bien adaptés pour des études in vivo. Notre laboratoire a démontré qu'une modification de l'extrémité carboxy-terminale de la luciférase de Gaussia confère sécrétion du rapporteur en réponse àER appauvrissement de calcium. Les procédés d'utilisation d'une luciférase en fonction, la protéine de surveillance de calcium du RE sécrétée (SERCaMP) pour in vitro et in vivo dans des applications sont décrits ici. Cette vidéo met injections hépatiques, la manipulation pharmacologique de GLUC-SERCaMP, la collecte et le traitement du sang, et les paramètres de dosage pour le suivi longitudinal de ER calcium.

Introduction

Le réticulum endoplasmique (RE) des fonctions dans de nombreuses capacités cellulaires, y compris le repliement des protéines, la sécrétion de protéines, l'homéostasie lipidique et de signalisation intracellulaire ^1. Central à la fonction ER normale est de maintenir les concentrations de calcium luminal à ~ 5000 fois ceux trouvés dans le cytoplasme ^2-4. Ce processus intensif d'énergie est réglementée par la ATPase Sarco / réticulum endoplasmique de calcium (SERCA), une pompe qui déplace des ions calcium dans le RE. Efflux de calcium du RE est principalement médiée par la ryanodine (RyR) et l'inositol triphosphate (IP3R) récepteurs. P....

Protocole

1. Essai in vitro: Détection SERCaMP sortie d'une écurie SH-SY5Y Cell Line

1. Plate-SH-SY5Y Gluc-ASARTDL (SERCaMP) dans une culture tissulaire traitée plaques à 150.000 cellules par cm ² de surface. Pour plaques à 96 puits, par exemple, les graines de 50.000 cellules par puits (figure 1A). Cultiver les cellules SH-SY5Y dans DMEM (glucose élevé, GlutaMAX, pyruvate) + 10% de croissance de sérum bovin + 1x pénicilline / streptomycine.
   1. Cellules jusqu'à 15 fois (figure 1B) de Passage. Numéro de passage supérieur n'a pas été testé.
   2. Retour à cellules incubateur humidifié à 37 ° C av....

Résultats

La méthode GLUC-SERCaMP permet pour l'évaluation des ER homéostasie calcique en échantillonnant les liquides extracellulaires. Plusieurs contrôles peuvent être inclus dans la conception expérimentale pour améliorer l'interprétation des résultats. Tout d'abord, l'utilisation d'un journaliste constitutivement sécrétée (par exemple GLUC sans ASARTDL C-terminale ou "GLUC-Pas Tag") peut être utilisé pour évaluer les effets des traitements expérimentaux sur la voie de sécrétion (de sécré.......

Discussion

Ce protocole met en évidence in vitro et in vivo de l'utilité de Gluc-SERCaMP pour contrôler l'épuisement de calcium ER. Bien que la modification de la protéine pour générer SERCaMP semble généraliser à d'autres ¹² protéines rapporteurs, nous avons choisi pour la luciférase de Gaussia son robuste (200-1,000 fois supérieure) bioluminescence par rapport aux autres luciférases ^18. Nous démontrons détectable induite thapsigargine GLUC-SERCaMP libération à travers .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de 1,5 ml	Fisher  ;	02-682-550
Solution NP-40 à 10 %  ;	Pierce	28324	pour dosages GLuc intracellulaires
Seringues luer-lok	1 ml Fisher	14-823-30
Embouts filtrants 200 microlitres	Rainin	RT-L200F
3-0 sutures chirurgicales	Fisher	NC9598192
aiguilles 30 G	Fisher Scientific	14-821-13A  ;
Plaques d’étanchéité adhésives pour microplaques	Thermo	AB-0558
Coussinets de préparation à l’alcool	Fisher	22-246-073
Système d’anesthésie automatique	E-Z Anesthésie	EZ-AF9000
Chambre de récupération animale	Lyon Vet	ICU-912-004
B27 supplément	Life Technologies	17504-044
Solution de bétadine	Fisher	NC9386574
Bleach	Clorox	n/a
Sérum de croissance bovine	Thermo	SH30541.03
Coelentrazine, Native	Regis Technologies	1-361204-200
Applicateurs à embout en coton	Puritan	806-WC
Aiguilles coupantes Sutures circulaires 3/8	WPI	501803
Nettoyeur ultrasconique numérique	Fisher Scientific	FS60D
DMEM à haute teneur en glucose, GlutaMAX, pyruvate	Life Technologies	10569-010
Échelle de masse d’ADN	Life Technologies	10496-016
Gaussia luciferase (protéine recombinante)	Nanolight	321-100
Anticorps Gaussia luciferase (pour WB, ICC ou IHC)	New England Biolabs	E8023S	1:2 000 (WB)
Germinator 500	CellPoint Scientific	DS-401
Plaques de dosage de gluc (96 puits, opaques)	Fisher	07-200-589
Hank’s balanced salt solution	Life Technologies	14175-095
Heparin	Allmedtech	63323-276-02
Isoflurane	Butler Schein	29404
Kétamine	Henry Schein	995-2949
Kwik Stop Poudre styptique	Butler Schein	5867
L-glutamine	Sigma	G8540
Méthanol	Fisher	a452-4
Microfuge 22R Centrifugeuse	Bekman Colter	368831
Neosporin	Fisher	19-898-143
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Stéréoscope	Nikon	SMZ745T
Nucleospin Gel et nettoyage PCR	Machery-Nagel	740609
P200 pipet	Rainin	L-200XLS+
p24 Lenti-X kit de titrage rapide	Clontech	632200
Scellé de film PCR	Fisher	AB0558
Pénicilline/streptomycine	Life Technologies	15140-122
Cocktail inhibiteur de protéase	Sigma	P8340
ReFresh Charcoal Filter canister	E-Z Anesthesia	EZ-258
Lames de scalpel, #10	Fine Science tools Inc	10010-00
SD rats 150-200 g	Charles River	Rats	rats commandés à 150-200 g.  ; Chirurgie 5 jours après l’arrivée
Étiquettes d’oreille pour petits animaux	National Band and Tag co	1005-1
Champs chirurgicaux stériles	Braintree Scientific	SP-MPS
Synergy 2 lecteur de plaques	BioTek	n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Thapsigargin	Sigma	T9033	nocif pour santé humaine
Virapower lentiviral packaging mix	Life Technologies	K4975-00
Xfect Réactif de transfection	Clontech	631318
Xylazine	Valley Vet	468RX