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Article de méthode

A Novel Culture Modèle de cellules souches pluripotentes humaines Propagation de gélatine dans les médias Placenta conditionné

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DOI :

10.3791/53204

⸱

3 août 2015

 , 
1Department of Biomedical Science, Graduate School of Medicine, Korea University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole offre un moyen simple et efficace de propager des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) en utilisant uniquement des milieux conditionnés dérivés du placenta humain dans une boîte recouverte de gélatine sans supplémentation exogène supplémentaire ou substrats synthétiques spécifiques aux hPSC.

Résumé

La propagation des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) dans des milieux conditionnés dérivés de cellules humaines dans des conditions de culture sans nourrisseur a été intéressante. Néanmoins, aucune méthode de propagation ex vivo humanisée et exempte de nourrisseur pour les hPSC n’a été mise au point ; à l’heure actuelle, des substrats exogènes supplémentaires, y compris le facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF), un facteur de maintien des hPSC maîtres, sont ajoutés à tous les milieux de culture et des substrats synthétiques tels que le Matrigel ou la laminine sont utilisés dans toutes les cultures sans nourrisseur. Récemment, notre groupe a développé un protocole simple et efficace pour la propagation des hPSC en utilisant uniquement des milieux conditionnés dérivés du placenta humain sur une boîte recouverte de gélatine sans supplémentation exogène supplémentaire ou substrat synthétique spécifique aux hPSC. Ce protocole n’a pas été signalé auparavant et pourrait permettre aux chercheurs de propager efficacement les hPSC dans des conditions de culture humanisées. De plus, ce modèle permet d’éviter les risques de contamination par des hPSC par des produits animaux tels que des virus ou des protéines inconnues. De plus, ce système facilite la production de masse de hPSC à l’aide du revêtement de gélatine, qui est simple à manipuler, ce qui réduit considérablement les coûts globaux de maintenance ex vivo des hPSC.

Introduction

L’objectif de ce protocole est la propagation de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi) dans des conditions ex vivo exemptes de nourrisseurs ex vivo entièrement humanisées, sans nécessiter de supplémentation exogène supplémentaire et de substrats synthétiques. À ce jour, le développement de modèles de culture ex vivo de hPSC, qui permettent l’introduction de produits de culture en clinique, a été une préoccupation majeure dans la recherche sur les cellules souches. Plus précisément, deux problèmes critiques doivent être résolus. Tout d’abord, il est nécessaire de disposer d’un système de culture ex vivo humanisé pour la propagation des CSPh, qui évite le risque de contamination par les produits cellulaires animaux. Deuxièmement, un modèle de culture sans nourrisseur est nécessaire pour faciliter la production de masse facile et économique de CSPh. Pour les applications thérapeutiques des hPSC, il est nécessaire d’identifier les facteurs qui régulent leur auto-renouvellement et leur différenciation.

Depuis que Xu et al. ont initialement signalé la faisabilité d’utiliser des milieux conditionnés (CM) dérivés de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) pour cultiver des hESCs sur Matrigel1, de nombreuses études ont examiné les méthodes de propagation ex vivo optimales pour les hPSC2-4. Cependant, il n’a pas été mis au point un système idéal de propagation des hPSC humanisés ex vivo sans feeder, car les méthodes actuelles nécessitent des substrats exogènes supplémentaires, notamment le bFGF et l’insuline, facteurs bien connus de maintien des hPSC, dans les milieuxde culture 5 à 7. De plus, des substrats synthétiques tels que le Matrigel ou la laminine sont utilisés dans toutes les cultures exemptes de nourrisseurs.

La raison d’être du développement et de l’utilisation de ce protocole est basée sur nos études antérieures montrant que les cellules chorioniques du placenta humain soutiennent parfaitement la propagation des hPSCs sans supplémentation en bFGF8-11. Ce protocole présente un certain nombre d’avantages, notamment sa simplicité en ce qui concerne la manipulation et sa rentabilité, et il s’agit d’une culture humanisée presque parfaite qui permet la propagation des hPSC sans substrats synthétiques exogènes. L’application de la CM dérivée du placenta humain (hPCCM) pour les hPSC comporte 3 étapes. Tout d’abord, les cellules choriales sont isolées du placenta humain et cultivées. Deuxièmement, la hPCCM est produite à partir de cellules cultivées. Troisièmement, les hPSC sont cultivées à l’aide de hPCCM et leurs caractéristiques sont confirmées.

Ce protocole facilitera les applications cliniques des hPSC et l’étude des mécanismes de prolifération et d’attachement des hPSC. Dans cet article, le protocole pour la propagation réussie des hPSC dans les hPCCM sur une boîte recouverte de gélatine est présenté.

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Protocole

Déclaration éthique: L'étude de placenta humain a été réalisée de manière prospective, avec l'approbation de l'Institutional Review Board pour la recherche humaine de l'Université de Corée (AN09085-001). Toutes les expériences ont été réalisées dans une salle blanche Germ-gratuit au Centre médical de l'Université de Corée. La conception et les procédures utilisant hPSCs expérimentale ont été approuvés par l'Institutional Review Board de l'University Medical Center Corée (AN12277-003).

1. Préparation des Instruments, Culture Media, et Plats

  1. Manteau de toutes les boîtes de culture avec 0,1% de gélatine. Autoclave une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et une pince. Stériliser ciseaux chirurgicaux, des microtubes, et de la gaze à 121 ° C sous £ 15 psi pendant plus de 15 min.
  2. 0,25% de trypsine-éthylène amine tétra-acétique, préparé préchauffé (trypsine-EDTA) et support préchauffé culture filtré (DMEM) contenant 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml streptomycavant de commencer les procédures.

2. Isolement cellulaire à partir de placenta humain

  1. Obtenir le tissu placentaire, après la livraison de césarienne, de femmes enceintes en bonne santé qui subissent un avortement thérapeutique normal ou au 7-32 semaines de gestation après l'obtention du consentement éclairé écrit.
  2. Avoir le spécialiste obstétriques placenta humain plaques choriales chirurgicalement séparées (CAH) du placenta; incuber dans ces 0,25% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 20 min, puis laver avec 5 ml de PBS.
  3. Isoler villosités choriales du CAH l'aide de ciseaux; émincer les villosités et les laver trois fois avec 1 ml de PBS. Après hachage, placer les villosités choriales dans un tube de centrifugeuse en utilisant une pointe de pipette; laver les échantillons avec 500 pi de PBS par pipetage de haut en bas, et centrifuger les tubes pour 120 g pendant 3 min. Laver deux fois les tissus avec 500 ul de milieu de culture préchauffé.
  4. les cellules dans du milieu de culture sur des plaques revêtues de gélatine à 37 ° C, dans 5% de CO 2 et sous 95% d'humidité. Pré-manteau toutes les plaques avec 0,1% de gélatine pendant 1 heure à 37 ° C. Les colonies de cellules de fibroblastes se formeront et la croissance adhérente environ 5-7 jours après le début de la culture dans le même milieu.
  5. Remplacez le milieu tous les 2-3 jours jusqu'à ce que le troisième passage. Au cours de la culture, l'enlèvement des débris de cellules flottant dans le milieu de culture; fibroblastes placentaires croissance vont attacher à la plaque. Culture des cellules de fibroblastes provenant de l'HPC à la 10 ème passage, puis les récolter pour les cultures de CSEh après trypsinisation et la mitomycine-C (10 pg / ml) de traitement.
  6. Avant la congélation CAH que des échantillons d'achat d'actions, utiliser transcription inverse-réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR) pour confirmer que BHP ne sont pas contaminés par des agents pathogènes qui infectent couramment le placenta, y compris les mycoplasmes (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginine, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,et M. capricolum) et les espèces bactériennes, Ureaplasma urealyticum, en utilisant un kit de détection de mycoplasme.
    1. Suivez les instructions du fabricant pour effectuer RT-PCR, utiliser toutes les amorces et des mélanges fournis dans le kit. Utilisez les surnageants des cellules qui ont été cultivées pendant 36 jours pour la détection des mycoplasmes. Ajouter 3 ul de ces échantillons pour les mélanges de PCR et effectuer la procédure 1 er PCR pendant 35 cycles, chacun consistant en 94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 2 min, et 72 ° C pendant 1 min.
    2. Ajouter avec précaution 0,5 ul du produit de PCR 1 er au mélange PCR et effectuer la procédure 2 ème PCR pendant 30 cycles en utilisant les mêmes conditions que précédemment. Analyser les produits amplifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1%; appliquer 10 pi de chacun des 1 er et 2 ème produits PCR pour les gels.
  7. Si CAH sont trouvés d'être contaminés par des agents pathogènes, les élimineren utilisant une combinaison d'antibiotiques (BM-cycline), en suivant les instructions du fabricant. Ajouter un nouveau milieu contenant 10 pg / ml de BM-cycline 1 pendant 3 jours, puis traiter les cellules avec 5 ug / ml BM-cycline 2 pendant 4 jours. Répétez ce cycle deux fois, puis vérifier la contamination par des mycoplasmes nouveau.

3. Les cellules de placenta humain récolte dérivés milieu conditionné (hPCCM)

  1. Après l'exclusion de la contamination, de traiter les cellules attachées (85-90% de confluence; (1,5 × 10 7 cellules / fiole) avec de la mitomycine-C (10 ug / ml) pendant 2 heures et 30 min, et lavé les cellules trois fois avec 10 ml PBS. incuber les cellules avec un milieu préchauffé sans mitomycine-C pendant 24 heures.
  2. Un jour après le traitement, incuber les cellules dans 10 ml de milieu (DMEM-F12 supplémenté avec 20% de sérum knock-out remplacement [KOSR], 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, 1% de NEAA et 1% de pénicilline-streptomycine). Après 24 heures d'incubation, la récolte CM dans un tube conique de 15 ml etfiltrage du CM à l'aide d'un filtre à seringue de 0,22 um.
  3. Ajouter encore 10 ml de nouveau milieu et l'incubation. Collecter toutes les surnageants des cultures chaque jour pendant 1 semaine et geler le milieu récolté à -80 ° C. D'éviter les cycles de gel-dégel.

4. culture des droits de cellules souches embryonnaires (CSEh) et l'induction de cellules souches pluripotentes (CISP)

  1. Obtenir des lignées de cellules souches embryonnaires humaines, les cellules H1 et H9 (énumérés dans le registre NIH CSEh sous le nom WA01 et WA09, respectivement) et induit-pluripotentes cellules souches iPSC-1: iPS (prépuce) -1 et iPSC-2 (IISH1i- BM) de l'Institut de recherche WiCell (Madison, WI, USA). Les cellules doivent être décongelés et mis en culture selon les instructions du fabricant.
  2. Pour le groupe de contrôle, des cellules de culture sur la vaisselle membrane basale Matrix-revêtus largement utilisé dans le milieu de culture défini sans sérum sans chargeur et à 37 ° C et à 5% de CO 2. Initialement, semences 80-100 touffes de hPSCs in 35 mm plats. Cultiver les cellules dans ces plats jusqu'à 70-80% de cellules de passage de confluence et de routine sous-culture une fois tous les 5-6 jours, en utilisant des méthodes mécaniques ou enzymatiques (Dispase). Laver les cellules deux fois avec du milieu de pré eux dans un rapport de 1: 4. Remplacez le milieu avec un milieu frais tous les jours.
  3. Pour les groupes expérimentaux, des cellules en culture dans hPCCM sur des plats pré-revêtues avec 0,1% de gélatine et d'effectuer des passages de routine une fois tous les 5 jours, soit mécaniquement, soit par voie enzymatique. cellules de la plaque à des rapports dans la plage de 1: 6-1: 10. hPSCs attachent à la gélatine dans les 2 jours après le transfert. Remplacez le support avec un milieu frais tous les jours.

5. Caractérisation des pluripotentes humaines Cellules souches

NOTE: Caractériser hPSCs utilisant plusieurs méthodes, telles que alcaline phosphatase coloration, immunocytochimie, quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) et Western blot.

  1. Immunofluorescence
    1. Pour immunofluorescence coloration, hPSCs de culture et fixer les cellules dans 8 puits chambres de diapositives avec 4% (p / v) de paraformaldehyde pendant 10 min; ensuite, les cellules perméabilisées avec 0,1% (v / v) de Triton-X100 pendant 15 min, et de bloquer les cellules pendant 1 heure avec 3% (v / v) de sérum de cheval normal dans du PBS contenant 0,1% (v / v) de Tween 20. Laver PBS deux fois pendant 5 min entre chaque étape.
    2. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire (OCT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, dilution de 1: 1000) O / N à 4 ° C et avec l'anticorps secondaire.
    3. Avant le montage, incuber les cellules avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 minutes dans l'obscurité. Laver les cellules rigoureusement trois fois pendant 5 min chacun et secs cellules complètement, dans l'obscurité. Préserver les cellules de la fluorescence milieu de montage et de les observer sous un microscope à fluorescence.
  2. qRT-PCR
    1. Isoler l'ARN total à partir de cellules en utilisant un kit RNeasy selon les spécifications du fabricant et de quantifier l'ARN extrait à l'aide d'un spectrophotomètre Goutte Nano.
    2. La synthèse d'ADNc par addition de 2 pg de l'ARN total à un oligonucléotide contenant 20 ul de mélange réactionnel (dT) et des amorces de transcriptase inverse Superscript II; suivre les instructions du fabricant dans cette procédure.
    3. Amplifier l'ADNc synthétisé avec un système de iQ iCycler Bio-Rad, en utilisant iQ qPCR SYBR Green Master Mix et les séquences d'amorces décrites dans le tableau supplémentaire S1. Normaliser les valeurs de seuil de cycle des gènes d'intérêt à ceux de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH).
  3. Phosphatase alcaline (AP) coloration
    1. Détecter l'activité AP en utilisant la caractérisation de cellules ES Kit, selon le protocole du fabricant.
    2. Au jour 5, aspirer les médias et fixer les hPSCs avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 12 min. Ne pas overfix; fixation des cellules pendant plus de 2 min donnera lieu à l'inactivation de la phosphatase alcaline. Aspirer le fixateur et rincer à l'1x Rinse Buffer. Ne paslaisser sécher les puits entre les étapes.
    3. Ajouter une solution de coloration assez pour couvrir chaque puits (1 ml par puits d'une boîte de 35 mm). Incuber les plaques dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
    4. Après incubation, laver la vaisselle avec 1x Rinse Buffer. cellules de couverture avec 1x PBS pour éviter le dessèchement et examinent et l'image les cellules colorées en utilisant un microscope Olympus.
  4. Western Blot
    1. Effectuer une analyse western blot comme décrit précédemment dans 9. En bref, déterminer les concentrations protéiques dans les lysats cellulaires. Résoudre des quantités égales de protéine à une électrophorèse sur gel de sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) de gel de dodécylsulfate de sodium et le transfert des protéines sur un polyfluorure de vinylidène (PVDF).
    2. Bloquer le transfert et sonder O / N avec des anticorps primaires différentes à 4 ° C; incuber ensuite l'blot avec des anticorps secondaires conjugués à HRP pendant 1 heure. Laver la membrane trois fois pendant 10 min à chaque fois entre les incubations. Détecter des signaux à l'aide d'un réactif ECL.
  5. Court Répétez Tandem (STR) Analyse
    1. hPSCs ont été récoltées dans les groupes témoins et expérimentaux dans le même passage. L'ADN génomique a été extrait en utilisant un kit Micro ADN, selon les instructions du fabricant.
    2. Amplifier l'ADN génomique pour 16 loci génétiques différents en utilisant le kit d'amplification PCR ampf / STR, selon les spécifications du fabricant et électrophorèse capillaire a été réalisée en utilisant un analyseur génétique.

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Résultats

Un avantage de cette méthode de propagation de HPSC est qu'elle utilise des composants sécrétées à partir de cellules humaines. Une étape la plus ciritical dans le protocole est l'isolement et la culture de cellules placentaires humaines dérivées. Cela exige et la dissection précise d'une partie précise de HPC plaque villosités. La figure 1 montre la procédure pour l'isolement cellulaire dérivée du placenta humain. Ce procédé est simple et commode pour l'isolement de cellules, et peu...

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Discussion

Ce modèle a été mis au point pour se propager avec succès hPSCs, tout en conservant leurs caractéristiques, dans des conditions de culture sans cellules nourricières humanisés sans l'addition de facteurs de croissance recombinants exogènes tels que bFGF ou de l'insuline, ce qui permet la manipulation de hPSCs dans un micro-environnement humanisé. Exogène supplémentation bFGF est commun et l'application de substrats tels que Matrigel ou laminine est essentiel pour la culture libre-chargeur de hPSCs 14.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs indiquent aucun conflit d'intérêt.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., professeur agrégé, Département d'obstétrique et de gynécologie, Collège médical de l'Université de Corée) pour fournir le tissu placentaire. Ce travail a été financé en partie par des subventions (R1211902) de la National Research Foundation de Corée (NRF), République de Corée.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mitomycine-CSigma-Aldrich CorporationM428710 &mu ; g/ml
Kit de détection de mycoplasmesTaKaRa Bio Inc.#6601
MatrigelBD Biosciences#354277
mTeSR1STEMCELL Technologies Inc.#05850
DispaseWorthington Biochemical CorporationLS021001 mg/ml
GélatineSigma-Aldrich CorporationG25000.10 %
BM-CyclinRoche799 05010 &mu ; g/ml
RNeasy mini kit  ;Spectrophotomètre Qiagen74104
Nano DropThermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix  ;Bio-Rad Laboratories#170-8882AP
Kit de caractérisation cellulaire ESChemicon International, Inc.,SCR001
Kit de synthèse d’ADNc de puissance  ;iNtRON Biotechnology25011
QIAamp® ; Kit Micro ADNQiagen56304
AmpF/STR® ; Identifiler® ; Kit d’amplification PCRApplied Biosystems Inc.
Applied Biosystems® ; 3130xl Analyseur génétique  ;Applied Biosystems Inc.
4322288

Références

  1. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  2. Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
  3. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60(2010).
  4. Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880(2012).
  5. Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  6. Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
  7. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
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  9. Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
  10. Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
  11. Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
  12. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  13. Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  14. Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).

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