A Novel Culture Modèle de cellules souches pluripotentes humaines Propagation de gélatine dans les médias Placenta conditionné

Résumé

Ce protocole offre un moyen simple et efficace de propager des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) en utilisant uniquement des milieux conditionnés dérivés du placenta humain dans une boîte recouverte de gélatine sans supplémentation exogène supplémentaire ou substrats synthétiques spécifiques aux hPSC.

Résumé

La propagation des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) dans des milieux conditionnés dérivés de cellules humaines dans des conditions de culture sans nourrisseur a été intéressante. Néanmoins, aucune méthode de propagation ex vivo humanisée et exempte de nourrisseur pour les hPSC n’a été mise au point ; à l’heure actuelle, des substrats exogènes supplémentaires, y compris le facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF), un facteur de maintien des hPSC maîtres, sont ajoutés à tous les milieux de culture et des substrats synthétiques tels que le Matrigel ou la laminine sont utilisés dans toutes les cultures sans nourrisseur. Récemment, notre groupe a développé un protocole simple et efficace pour la propagation des hPSC en utilisant uniquement des milieux conditionnés dérivés du placenta humain sur une boîte recouverte de gélatine sans supplémentation exogène supplémentaire ou substrat synthétique spécifique aux hPSC. Ce protocole n’a pas été signalé auparavant et pourrait permettre aux chercheurs de propager efficacement les hPSC dans des conditions de culture humanisées. De plus, ce modèle permet d’éviter les risques de contamination par des hPSC par des produits animaux tels que des virus ou des protéines inconnues. De plus, ce système facilite la production de masse de hPSC à l’aide du revêtement de gélatine, qui est simple à manipuler, ce qui réduit considérablement les coûts globaux de maintenance ex vivo des hPSC.

Introduction

L’objectif de ce protocole est la propagation de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi) dans des conditions ex vivo exemptes de nourrisseurs ex vivo entièrement humanisées, sans nécessiter de supplémentation exogène supplémentaire et de substrats synthétiques. À ce jour, le développement de modèles de culture ex vivo de hPSC, qui permettent l’introduction de produits de culture en clinique, a été une préoccupation majeure dans la recherche sur les cellules souches. Plus précisément, deux problèmes critiques doivent être....

Protocole

Déclaration éthique: L'étude de placenta humain a été réalisée de manière prospective, avec l'approbation de l'Institutional Review Board pour la recherche humaine de l'Université de Corée (AN09085-001). Toutes les expériences ont été réalisées dans une salle blanche Germ-gratuit au Centre médical de l'Université de Corée. La conception et les procédures utilisant hPSCs expérimentale ont été approuvés par l'Institutional Review Board de l'University Medical Center Corée (AN12277-003).

1. Préparation des Instruments, Culture Media, et Plats

1. Manteau de toutes les boîtes de culture avec 0,1% de gélatine....

Résultats

Un avantage de cette méthode de propagation de HPSC est qu'elle utilise des composants sécrétées à partir de cellules humaines. Une étape la plus ciritical dans le protocole est l'isolement et la culture de cellules placentaires humaines dérivées. Cela exige et la dissection précise d'une partie précise de HPC plaque villosités. La figure 1 montre la procédure pour l'isolement cellulaire dérivée du placenta humain. Ce procédé est simple et commode pour l'isolement de cellules, et peu.......

Discussion

Ce modèle a été mis au point pour se propager avec succès hPSCs, tout en conservant leurs caractéristiques, dans des conditions de culture sans cellules nourricières humanisés sans l'addition de facteurs de croissance recombinants exogènes tels que bFGF ou de l'insuline, ce qui permet la manipulation de hPSCs dans un micro-environnement humanisé. Exogène supplémentation bFGF est commun et l'application de substrats tels que Matrigel ou laminine est essentiel pour la culture libre-chargeur de hPSCs ^14.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mitomycine-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 &mu ; g/ml
Kit de détection de mycoplasmes	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gélatine	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10 %
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 &mu ; g/ml
RNeasy mini kit  ;	Spectrophotomètre Qiagen	74104
Nano Drop	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix  ;	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
Kit de caractérisation cellulaire ES	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Kit de synthèse d’ADNc de puissance  ;	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® ; Kit Micro ADN	Qiagen	56304
AmpF/STR® ; Identifiler® ; Kit d’amplification PCR	Applied Biosystems Inc.
Applied Biosystems® ; 3130xl Analyseur génétique  ;	Applied Biosystems Inc.

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