Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux

Jennifer L. Furman; Brandon B. Holmes; Marc I. Diamond

doi:10.3791/53205

Article de méthode

Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux

DOI :

10.3791/53205

⸱

8 décembre 2015

Jennifer L. Furman^*¹ , Brandon B. Holmes^*¹ , Marc I. Diamond¹

¹Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Le transfert de cellule à cellule d’agrégats de protéines, ou de graines protéopathiques, peut être à l’origine de la progression de la pathologie dans les maladies neurodégénératives. Ici, un nouveau test de cytométrie en flux FRET est décrit qui permet une détection spécifique et sensible de l’activité d’ensemencement à partir d’échantillons recombinants ou biologiques.

Résumé

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De plus en plus de preuves soutiennent la propagation transcellulaire d’agrégats de protéines toxiques, ou graines protéopathiques, comme mécanisme d’initiation et de progression de la pathologie dans plusieurs maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer et les tauopathies associées. Le rôle potentiellement critique des graines de tau dans la progression de la maladie soutient fortement la nécessité d’un test sensible qui détecte facilement l’activité d’ensemencement dans les échantillons biologiques.

En combinant la spécificité du transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET), la sensibilité de la cytométrie en flux et la stabilité d’une lignée cellulaire monoclonale, un test d’ensemencement ultra-sensible a été mis au point et est compatible avec la détection de graines à partir d’échantillons recombinants ou biologiques, y compris des homogénats de cerveau humain et de souris. Le test utilise des cellules monoclonales HEK 293T qui expriment de manière stable le domaine répété (RD) sujet à l’agrégation de tau hébergeant la mutation P301S associée à la maladie fusionnée à CFP ou YFP, qui produisent un signal FRET lors de l’agrégation de protéines. L’absorption de graines tau protéopathiques (mais pas d’autres protéines) dans les cellules du biocapteur stimule l’agrégation de RD-CFP et de RD-YFP, et la cytométrie en flux surveille de manière sensible et quantitative cette FRET induite par l’agrégation. Le test détecte les concentrations femtomolaires (équivalent monomère) de graines de tau recombinantes, a une plage dynamique couvrant trois ordres de grandeur et est compatible avec les homogénats cérébraux de souris transgéniques tauopathiques et de sujets tauopathiques humains. Avec de légères modifications, le test peut également détecter l’activité d’ensemencement d’autres grains protéopathiques, tels que la α-synucléine, et est également compatible avec les cultures neuronales primaires. La facilité, la sensibilité et la large applicabilité de la cytométrie en flux FRET la rendent utile pour l’étude d’un large éventail de troubles de l’agrégation des protéines.

Introduction

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L'accumulation intracellulaire de la protéine tau amyloïdes tauopathies définit comme la maladie d'Alzheimer. Dans les stades précoces de la maladie, la pathologie est généralement localisée à des régions discrètes du cerveau, mais avec la progression de la maladie, la pathologie se propage le long de invariablement réseaux neuronaux distincts ^1-5. L'accumulation de preuves suggère transcellulaire propagation d'agrégats de protéines toxiques à la base de cette pathologie (revue dans ^10/06). Dans ce modèle, les graines proteopathic (par exemple, tau) sont libérés de cellules du donneur et pénètrent dans les cellules voisi....

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Protocole

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NOTE: Ce protocole met l'accent sur l'utilisation de FRET cytométrie en flux pour détecter l'activité d'ensemencement à partir d'échantillons biologiques de la souris. Il est également compatible avec des fibrilles recombinantes et des échantillons biologiques humains. Souris l'euthanasie et le cerveau la récolte a été effectuée conformément aux procédures IACUC approuvés.

1. Extraction cerveau

À la suite de l'anesthésie profonde avec de l'isoflurane (2%), perfuser une souris avec du PBS glacé contenant 0,03% de l'héparine, et extraire le cerveau en suivant les indications de Gage et al. ¹⁸

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Résultats

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FRET cytométrie en flux permet sensible, quantitative, et la détection rapide de l'activité de l'ensemencement à partir d'échantillons recombinantes ou biologiques. Configuration de test est facile: lignées cellulaires stables monoclonaux dérivés exprimant la protéine tau-RD-CFP / YFP sont transduites avec du matériel de semences, incubées pendant 24-48 h, et soumis à l'analyse par cytométrie de flux (figure 1A). En l'absence de semences, les cellules de biocapteurs maintenir tau sous une forme monomè.......

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Discussion

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La cytométrie en flux système de FRET décrit ici est un outil puissant pour évaluer rapidement et quantitativement l'activité de la protéine tau ensemencement. Elle exige seulement une expérience de culture cellulaire modérée et une connaissance pratique de FRET et cytométrie de flux. D'autres essais de semis, comme Thioflavine T - qui présente une fluorescence améliorée lorsqu'il est lié à la structure de feuillet bêta - sont laborieux et nécessitent un substrat de protéine pure, recombinant. En outre, .......

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Déclarations de divulgation

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Ce test a été licencié à Janssen Pharmaceuticals.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le Consortium Tau (M.I.D) ; Subvention 1R01NS071835 (M.I.D.), subvention du ministère de la Défense PT110816 (à M.I.D.), 1F32NS087805 (à J.L.F.) et 1F31NS079039 (à B.B.H.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue
TBS	Sigma	T5912
Inhibiteurs de protéase cOmplete (sans EDTA)	Roche	4693159001
Cryo-flacons	Sarstedt	72.694.006
Balance analytique	Mettler Toledo	XSE 105DU
Weighing Boats	Fisher Scientific	13-735-743
Tube conique de 15 ml	USA Scientific	1475-0501
Omni Sonic Ruptor Homogénéisateur à ultrasons	Omni International	18-000-115
Micro-pointe pour homogénéisateur à ultrasons	Omni International	OR-T-156
2-Propanol	Fisher Scientific	A451
Casque antibruit	Fisher Scientific	19-145-412
Kimwipes	Fisher Scientific	S47299
Tubes de 1,5 ml	USA Scientific	1615-5510
Microcentrifugeuse ;	Eppendorf	5424 000.215
DPBS	Life Technologies	14190-136
DMEM	Life Technologies	11965-084
Sérum fœtal bovin	HyClone	SH30071.03
Pénicilline-Streptomycine	Life Technologies	15140-122
GlutaMax	Life Technologies	35050-061
Trypsine-EDTA	Life Technologies	25300-054
50 ml Tubes coniques	Phenix Research	SS-PH15
25 ml réservoir de réactifs	VWR	41428-954
Pipette multicanaux	Fisher Scientific	TI13-690-049
Plaques à fond plat 96 puits	Corning	3603
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
96 plaques à fond rond	bien rond Corning	3788
16 % Paraformaldéhyde	Microscopie électronique Sciences	RT 15710
PBS	Sigma-Aldrich	P5493
EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS
HBSS	Life Technologies	14185-052
Centrifugeuse Sorvall ST 40	Thermo Scientific	75004509
BIOLiner Rotor à godet oscillant	Thermo Scientific	75003796
Hémacytomètre	VWR	15170-172
MACSQuant VYB Cytomètre en flux	Miltenyi Biotec	130-096-116
Chill 96 Rack	Miltenyi Biotec	130-094-459
Logiciel d’analyse Flow Jo	Flow Jo
20 &mu ; l pointes de pipette	Rainin	GPS-L10
200 &mu ; l pointes de pipette	Rainin	GPS-250
1 ml pointes de pipette	Rainin	GPS-1000
200 &mu ; l pointes de pipette	USA Scientific	1111-1800
5 ml pipette sérologique	Phenix Research	SPG-606180
10 ml pipette sérologique	Phenix Research	SPG-607180
25 ml pipette sérologique	Phenix Research	SPG-760180

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neu....

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Mots-clés

FRET Flow Cytometry Proteopathic Seeding Tau Aggregation Biosensor Cells Flow Cytometry Analysis Fluorescence Compensation Seeding Activity Detection Recombinant Tau Seeds Brain Homogenates HEK 293T Cells

Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux

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