Modèle in vitro de physiologiques et pathologiques Blood Flow avec application aux enquêtes de cellules vasculaires Rénovation

Résumé

Ce protocole se réplique du flux sanguin physiologique ou pathologique in vitro pour aider à déterminer la réponse des cellules dans des pathologies de la maladie. En introduisant une pression en aval de la chambre une pompe à sang amortissement, le flux sanguin à travers le système vasculaire peut être récapitulé et prélevée sur une monocouche de l'endothélium vasculaire ou une co-culture mimétique.

Résumé

Maladie vasculaire est une cause fréquente de décès aux États-Unis. Ici, nous présentons une méthode pour examiner la contribution de la dynamique des flux vers les pathologies de maladies vasculaires. Artères malsaines présentent souvent raidissement de paroi, des cicatrices, ou une sténose partielle qui peuvent tous affecter les taux d'écoulement des fluides, et l'ampleur des flux pulsatile, ou de l'indice de pulsatilité. Replication de différentes conditions d'écoulement est le résultat d'un réglage de la pression d'écoulement en aval de la chambre une pompe à sang amortissement. L'introduction d'air dans un système fermé de circulation permet à un milieu compressible pour absorber la pression pulsatoire de la pompe, et donc varier l'indice de pulsatilité. Le procédé décrit ici est tout simplement reproduit, avec entrée hautement contrôlable, et les résultats facilement mesurables. Certaines limitations sont reconstitution de la forme d'onde d'impulsion physiologique complexe, qui est seulement une approximation par le système. Les cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et les fibroblastes, sont affectées par le thr d'écoulement de sangOugh l'artère. La composante dynamique de la circulation sanguine est déterminée par l'observation de sortie et la paroi artérielle cardiaque. Cellules vasculaires mécano-transduction de la dynamique d'écoulement peut déclencher la libération de cytokines et de diaphonie entre les types de cellules dans l'artère. Co-culture de cellules vasculaires est une image qui reflète plus précise interaction cellule-cellule sur la paroi du vaisseau sanguin et de la réponse vasculaire de signalisation mécanique. Contribution de la dynamique des flux, y compris la réponse des cellules aux composants dynamiques et moyennes (ou stables) de flux, est donc une mesure importante dans la détermination de la pathologie de la maladie et l'efficacité du traitement. Grâce à l'introduction d'un modèle in vitro de co-culture et de la pression d'amortissement en aval de la pompe de sang qui produit le débit cardiaque simulé, diverses pathologies de maladies artérielles peuvent être étudiées.

Introduction

Les taux de morbidité pour les maladies cardiovasculaires sont la plus grande en Amérique, avec de nombreux résultant de vascularisation malsain. Des artères saines sont constituées de tissu élastique, avec une surface luminale doux revêtu d'une cellule endothéliale (CE) monocouche. Débit artériel peut être modélisée comme une fonction d'onde d'oscillation avec un débit moyen positif. L'indice de pulsatilité (PI) est le quotient d'oscillation ampleur et débit moyen (PI = (Max -. Min.) / Moyenne), ^{1 et} a été modélisée in vitro avec élasticité variable de ^la cuve 2 élasticité artérielle est important dans le stockage de l'écoulement. énergie des contractions cardiaques, dilatant sous pression systolique, et joue un rôle important dans la modulation de PI d'écoulement de sang. Parce que le coeur maintient une approche cohérente, pulsatile, débit volumétrique, expansion artérielle augmente la zone de coupe, l'amélioration de la stabilité de l'écoulement en réduisant la vitesse d'écoulement, contrainte de cisaillement, et PI. Fréquemment, les changements artères malsaines présentes à l'élasticitéou de conformité, l'affichage de raidissement remodelage vasculaire, le tissu cicatriciel ou calcification ^{3, 4.} En outre, d'autres troubles vasculaires, tels que hyperplasie néo-intimale (NIH), ⁵ l'hypertension et l'anévrisme et ⁶ fibrose vasculaire ^4, peuvent se contracter le diamètre du vaisseau. Cependant, le traitement médicamenteux en cours et le traitement de l'appareil de maladies vasculaires négligent souvent l'importance du respect de la paroi de la cuve ou le débit sanguin dans la dynamique maladie vasculaire qui est souvent compliquée par des changements dans la morphologie de la cuve et des propriétés. Ni l'angioplastie par ballonnet ni stenting repondre la complication de la paroi ⁷ élasticité. Par conséquent, la modélisation in vitro de sang flux résultant de la maladie artérielle et des traitements est important dans les enquêtes sur les pathologies de la maladie et l'efficacité future du traitement. Ici, nous décrivons un procédé de réplication du flux sanguin physiologiques et pathologiques conçu pour déterminer la réponse cellulaire dans la maladie vasculaire Pathollogies. L'écoulement du fluide provoque la contrainte de cisaillement à la paroi de la cuve, qui est un signal mécanique important dans la santé des vaisseaux, affectant toutes les cellules dans le système vasculaire. Plusieurs capteurs mécaniques sur l'endothélium vasculaire pour le cisaillement de fluide ont été identifiés, y compris cil primaire démontré dans des études récentes pour endothéliale mechanosensing ^8. L'activité des cellules endothéliales et la morphologie sont affectés par la vitesse d'écoulement, la direction et pulsatilité. En outre, des cellules musculaires lisses (SMC) la migration peut être affectée par mécano-signaux de circulation à faible vitesse par liquide interstitiel ^9, et peut également se faire par la signalisation paracrine à partir de cellules endothéliales par leur réponse à l'écoulement et mécano-transduction des signaux de débit via cytokine libérer ^10. La "dose" dépendance de cisaillement moyen, PI, et la signalisation paracrine peut également être interdépendants. A cet effet, la détermination de la réponse cellulaire à un cisaillement fluide vasculaire avec "dosage" varié en culture monocoucheou co-culture in vitro pourrait fournir des indications mécanistes dans le remodelage vasculaire et d'améliorer la maladie et la prédiction de traitement. Le système d'écoulement utilisé dans cette expérience se compose d'une pompe à sang, un réservoir d'air de l'écoulement d'amortissement en amont, un débitmètre en aval seulement utilisée lors de la configuration expérimentale, une culture de cellules en aval, la chambre d'écoulement à plaques parallèles, et le réservoir de support. Contrôle des variables de flux vasculaires tels que débit moyen, battements par minute, et PI peut être atteint par le taux de contrôle de flux, la fréquence du pouls et de la pression d'amortissement mise en place. Pompes à sang pulsatiles sont disponibles avec course variable déplacement, à la fréquence de course contrôlée, directement liées à signifier débit volumétrique, et la fréquence d'impulsion. Introduction d'un réservoir d'air à l'intérieur du circuit d'écoulement permet un amortissement de la pression, la réduction de l'oscillation d'écoulement de grandeur. Media est un fluide incompressible, tandis que l'air à l'intérieur de la chambre d'amortissement est compressible, permettant excès de pression de la vague de flux pour êtreabsorbée par compression de l'air. Le rapport air des médias permet un contrôle sur la quantité de l'amortissement se produit. Une chambre d'écoulement de culture de cellules sur mesure 75 mm de longueur par 50 mm de largeur a été créé à partir d'acrylique. Écoulement entre par l'orifice d'entrée, et se dilate à travers le collecteur d'admission, assurer un écoulement uniforme dans la totalité de la chambre d'écoulement. Flux et des structures similaires sont présents à la sortie de la chambre. Les cellules sont ensemencées sur des lames fonctionnalisées, et ensuite fixés à la chambre d'écoulement. Cela permet à de grandes populations, facilement récupérés après l'étude. Des expériences de co-culture peuvent utiliser une membrane de polycarbonate poreux pour éliminer le contact de cellule à cellule entre les cultures tout en permettant le transport cytokine / débit. Ce système a déjà été utilisé pour modéliser l'écoulement de haute PI et son effet sur ​​la culture monocouche endothéliale et CE / SMC co-culture ^{1, 10,} pour étudier la réponse cellulaire à la maladie de PI pathologiquement élevé. En décrivant le protocole utilisé pour modéliser ces flux conconditions, nous espérons aider les autres dans la détermination de la contribution de signal de débit à la cellule de réponse.

Protocole

1. Silanisation et biomolécules fonctionnalisation de diapositive ou Polycarbonate Membrane

Note: Beaucoup de produits chimiques et de solutions dans ce protocole ont des taux d'évaporation élevés (de l'éthanol (EtOH), acétone, etc.). Autres étapes impliquent des temps d'incubation longs pour faible taux d'évaporation. Film de paraffine est recommandé de sceller les conteneurs. Attention: Beaucoup de produits chimiques (y compris: l'acide sulfurique, de l'acétone, (3-aminopropyl) triéthoxysilane, glutaraldéhyde, EtOH) sont considérées comme dangereuses ou volatile. Consulter la fiche de données de sécurité (FDS) de chaque matériau pour le stockage, la manipulation et l'élimination avant utilisation.

1. Placez nouvelle lame de verre mesurant 75 mm par 50 mm par 1 mm, en propre, plat de coloration de lame de verre, sans égard à l'orientation, assurer la pleine immersion. Utiliser un récipient pour les étapes 1.1-1.12.
   Remarque: Pour la co-culture, comprennent le polycarbonate (PC) membrane avec 0,4 microns la taille des pores, coupé à la taille de 75 mm par 50 mm, pour tous ste ultérieureps pour PC fonctionnalisation et l'ensemencement CE.
2. Immergez-diapositive dans l'acide sulfurique (20%), O / N.
   Attention: Consulter la fiche signalétique pour l'acide sulfurique avant utilisation.
3. Laver glissière en les immergeant dans de l'eau désionisée (DI) pendant 5 minutes, trois fois, en changeant chaque fois DI.
4. Plongez diapositive dans l'acétone pendant 30 min.
   Attention: Consulter la fiche signalétique pour l'acétone avant de l'utiliser.
5. Plongez diapositive dans 6% (3-aminopropyl) triéthoxysilane solution / acétone O / N.
   Attention: Consulter la fiche signalétique pour (3-aminopropyl) triéthoxysilane et de l'acétone avant de l'utiliser.
6. Immerger diapositive dans de l'acétone pendant 5 minutes, trois fois, en changeant chaque fois de l'acétone.
   Attention: Consulter la fiche signalétique pour l'acétone avant de l'utiliser.
7. Laver par immersion dans un diaporama DI pendant 5 minutes, trois fois, en changeant chaque fois DI.
8. Plongez diaporama en solution glutaraldéhyde / DI de 1,5% pendant 60 min.
   Attention: Consulter la fiche signalétique pour glutaraldéhyde avant utilisation.
9. Laver par immersion dans un diaporama DI pendant 5 minutes, deux fois, en changeant chaque fois DI.
10. Placer la lames dans 70% d'éthanol (EtOH) pendant 30 min dans stérile, hotte à flux laminaire.
11. Retirer de l'EtOH et évaporer à permettre résidu restant. Immerger les lames en DI et le drain stérile afin de réhydrater les diapositives.
    Remarque: Diapositives ou une membrane de PC peut être scellé dans le support de lame de verre et conservé à 4 ° C jusqu'à une semaine. Lors de l'utilisation pour la culture cellulaire, répétez les étapes 1.10 et 1.11.
12. Retirer la lame du support de diapositives et le placer dans un 100 mm par 100 mm boîte de Pétri carrée dans la hotte à flux laminaire.
    Remarque: Ce récipient sera utilisé pour toutes les étapes restantes.
    1. Préparer diapositive ou PC pour l'ensemencement des cellules endothéliales pour l'expérience de la monoculture.
       1. Manteau de la diapositive fonctionnalisé ou PC (étape 1.11) avec 1 ml de solution de fibronectine (25 ug / ml), d'un côté, recouvrant la surface approximative exposé à la chambre de culture cellulaire.
       2. Incuber les lames ou PC dans l'incubateur stérile réglé à 37 ° C pendant 1-2 heures.
       3. Après incubation, aspirer la solution restante à l'aide d'un glass aspirateur pipette reliée à un vide.
          Remarque: Les lames peuvent maintenant être stocké O / N à 4 ° C pour une utilisation future.
    2. Suivre 1.12.2 étapes seulement pour la préparation d'EC / SMC co-culture. Préparer et ensemencer la culture lisse cellule musculaire (SMC) pour l'expérience de co-culture.
       1. Lieu joint en silicone sur le dessus de la glissière (étape 1.11), avec des dimensions de 75 mm sur le diamètre extérieur de 50 mm, diamètre intérieur de 50 mm par 30 mm, épaisseur de 0,5 mm, et des perforations qui alignent avec le vide de la chambre de flux.
       2. Préparer 1 ml SMC dans 10% de FBS / DMEM suspension. Neutraliser 1 ml de solution de 2 mg / ml de collagène de type I avec 7% de NaHCO ₃ et 0,1 M de NaOH solution à pH de 7,4, et mélanger avec SMC suspension avec une densité cellulaire finale de 2 x 10 ⁶ cellules / ml.
       3. Répandre la solution SMC au sein de joint et incuber diapositives à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 30 min.
       4. Après incubation, couvrir la diapositive avec du sérum 25 ml 0,1% fœtal bovin (FBS) mélangé modifié par DulbeccoEagle Medium (DMEM) pendant 72 heures.
13. Cellules endothéliales de la Culture (ECS) sur membrane lame de verre / polycarbonate.
    1. Graine de 1 ml EC dans 10% de FBS / DMEM, avec concentration initiale de 6,0 x 10 ⁵ cellules / ml, sur des surfaces de fibronectine de lame de verre ou une membrane de polycarbonate.
    2. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C, 5% CO ₂ et 10% de FBS pendant 120 minutes.
    3. Couvrir les lames contenant des cellules avec plus de 10% de FBS / DMEM, et les placer dans l'incubateur à 37 ° C, 5% de CO _{2 O} / N, jusqu'à 70% -80% de confluence.

2. Détermination de la viscosité du fluide et débit volumétrique

Remarque: viscosimètres rotatifs sont des équipements sensibles, et le mode d'emploi de viscosimètre devraient être consultés avant la calibration, la réduction à zéro, ou effectuer des mesures.

1. Déterminer cisaillement fluide désiré (τ) de la littérature de la vascularisation ciblée de l'expérience.
2. Measure 1% de FBS / DMEM viscosité (μ), en utilisant un viscosimètre rotatif.
3. Déterminer le débit volumétrique requis (Q) de l'équation de Poiseuille:
   ,
   où τ = cisaillement de fluide, μ = viscosité, Q = vol. le débit, la largeur w = chambre, et h = hauteur de la chambre).
4. Régler la pompe à débit dérivé dans l'étape 2.3 de flux, et l'utilisation pour toutes les étapes subséquentes.

3. Détermination de l'indice pulsatilité

Remarque: Tous les ports de connexion au sein du système doivent être connectés avec Barb lock-ring pour-taille appropriée, ou connexions femelles luer-à-barbe. Le raccordement de tuyaux PVC peut alors être connecté à raccords cannelés, et le circuit terminé.

1. Connectez circuit d'écoulement comme dans la figure 2, avec la chambre (Figure 3) et débitmètre à ultrasons d'amortissement dans le sens d'écoulement correct.
   Remarque: ultrasons débitmètre est une pièce sensible de l'équipement, etle mode d'emploi doit être consulté avant l'utilisation.
2. Remplir circuit d'écoulement et le réservoir avec de l'eau DI, en veillant à ce tube de sortie de réservoir (la pompe) est immergée dans le volume du réservoir. Visualiser la forme d'onde de débit en utilisant un débitmètre.
3. Ouvrez la vanne de sortie d'air sur la chambre d'amortissement pour changer le rapport de volume de fluide / air. Fermer valve de décharge à différents intervalles de niveau de liquide et calculer l'indice de pulsatilité (PI = (V _Max - V _min) / V _moyenne) en utilisant la forme d'onde du débit de pointe (V _Max), creux (V _min), et la moyenne _(moyenne V). Des valeurs PI record dans le cahier.
4. Mark résultant niveau du liquide et PI sur la chambre d'amortissement, à l'aide d'un feutre à pointe, stylo à encre permanente pour une utilisation future. Déterminer les niveaux de PI souhaités de la pathologie la littérature ^11.
5. Silicon Tube Formation-facultatif, méthode plus avancée de pulsatilité contrôle
   1. Mélanger la base d'élastomère de silicone et un agent de durcissement à différents rapports (par exemple, un base rapport à agent de reticulation de 10: 1 à 36: 1.) de modules d'élasticité varie ciblées, comme illustré auparavant ²
   2. Fabriquer des tubes de silicone répétée processus dip-cure, plongeant brièvement canule en acier (14 G) dans le mélange de prépolymère de silicone avec un rapport prédéterminé base-agent de réticulation.
   3. Placer la canule de prépolymère revêtu dans un four réglé à 60 ° C pendant 4 heures pour durcir le revêtement de polymère sur la canule, à commuter la direction dans le milieu de processus de durcissement.
   4. Répétez le processus de trempage avec le même mélange d'élastomère de silicone et remettez au four pendant 4 heures supplémentaires, ce qui entraîne dans ~ 0,3 mm d'épaisseur des tubes.
   5. Retirer le tube de silicone ultra-mince de la canule en acier inoxydable.
   6. Connectez tubes à l'écoulement circuit au lieu de chambre d'amortissement, et PI de test pour chaque en 3.3.

4. Pompe Stérilisation

1. Plongez la chambre d'écoulement (Figure 2), un tube en PVC, et des joints en 10% de peroxyde d'hydrogène (H _{2 O} 2). Laver avec DI stérile avant l'étape 4.
2. Placez la pompe à sang sur une étagère de l'incubateur de rechange.
   Remarque: Incubateur étagères doivent être en acier inoxydable, et être capable de supporter le poids de l'ensemble du circuit d'écoulement.
3. Remplir le circuit d'écoulement et le réservoir avec 10% de H _{2 O 2} en veillant à ce tube de sortie de réservoir (la pompe) est immergée dans le volume du réservoir. Faire circuler _H 2 O 2 par pompage dans le circuit pendant 20 min dans la hotte à flux laminaire avec une lumière UV sur.
4. Aspirer tous H _{2 O 2} à partir de tubes, et laver avec du PBS stérile par pompage à travers le circuit d'écoulement.

5. Débit Assemblée Chambre

Remarque: La chambre d'écoulement se compose d'un acrylique, plaque sur mesure, avec des orifices d'aspiration et orifices d'entrée et de flux de sortie (voir Figure 2). Ensemble de chambre consiste à placer la chambre d'écoulement et les joints au-dessus des supports de culture, properly aligné, et il est décrit ci-dessous.

1. Réchauffez 1% de FBS / DMEM dans un bain d'eau à 37 C ° et préparer la chambre d'écoulement.
   1. Prenez diaporama CE sur les médias (de l'étape 1.13) et placez le joint sur le dessus avec le côté de la cellule vers le haut.
   2. (Facultatif) Prenez membrane de PC sur les médias (de l'étape 1.13) et placez le joint sur le dessus avec le côté de la cellule vers le haut. Placer la lame co-culture avec tête de série SMC (étape 1.12.2) sous la membrane de PC.
2. Aligner canal de vide de la chambre d'écoulement avec les trous dans le joint d'étanchéité (figure 2).
3. Fixez tube à vide aux ports de vide (Figure 2) assurant aucune fuite de médias à vide.
4. Feuille de polycarbonate de place sous lame de verre et ensemble de chambre de flux de serrage avec pinces à ressort, un de chaque côté de la chambre de débit (figures 2 et 5).
5. Système de la Place de l'écoulement dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2, et remplir le circuit avec les médias par pompage du réservoir rempli à basse pulsatilité.Maintenir ce flux pendant 4 heures pour le préconditionnement cellules.
6. Régler le volume de fluide dans la chambre d'amortissement au niveau de la PI marquée, et de la culture pour le temps désiré.

Résultats

Maintien des conditions d'écoulement est tributaire de l'assemblage correct du circuit de flux (Figure 1). Le tube diamètre est important dans la sélection d'un ensemble, avec des diamètres plus grands réduire la résistance d'écoulement et la chute de pression subséquente, avant et après la chambre de culture. Pour assurer la vitesse de pression et de débit destiné, assembler le système avec débitmètre avant l'expérience avec des tubes destinés. Alignement de la chambre de culture vide ...

Discussion

Ce protocole décrit un procédé de reproduction d'écoulement pulsatile in vitro, et peut-être première étape dans la détermination instrumentale de la contribution des conditions d'écoulement à des pathologies de la maladie. Des études antérieures utilisant ce protocole ont trouvé des conditions de flux contribuent à la réponse inflammatoire vasculaire. ^{1, 10} En outre, ce protocole est destiné aux laboratoires expérimentés. En tant que tel, ni en profondeur la mécanique des fluides, ni analyse...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétone	Sigma-Aldrich	34850
Acide sulfurique	Sigma-Aldrich	320501
(3-aminopropyl)triéthoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Solution de glutaraldéhyde	Sigma-Aldrich	G5882
Éthanol	Sigma-Aldrich	459844
Lame de verre (70  ; mm x 50  ; mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
Membrane polycarbonate	Millipore Corp.
Joint en silicone	Grace Bio-Labs	RD 475464
Fibronectine (25 &mu ; g/ml)	Sigma-Aldrich	F1141
Collagène Type-I	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
Chambre			Cette chambre est fabriquée sur mesure et peut être demandée à l’aide du dessin technique de Figure 3.
Pompe à sang	Appareil Harvard	529552
Tube en polycarbonate de vinyle	US Plastic	65066, 65063, 65062	Différentes tailles peuvent être requises
Luer Connections	Nordson Medical	Diverses	tailles différentes seront nécessaires, et un certain nombre de pièces doivent être achetées pour une utilisation de remplacement.
L’acrylique	personnalisé	usiné en interne	peut être acheté en feuilles et usiné pour l’usage prévu. Le dessin d’ingénierie illustré dans Figure 2 peut être utilisé pour recréer cette chambre.
Boîte de Pétri carrée	Cole-Parmer	EW-14007-10
Porte-lames en verre	Capitol Scientific	WHE-900303
Sérum de veau fœtal	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Débitmètre	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Sylgard Kit élastomère	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G Canule en acier	Approvisionnement général de laboratoire	S8365-1