En comparant l'affinité des protéines de liaison en utilisant GTPase Compétition dosages

Summary

Ce protocole compare les affinités relatives des partenaires de liaison pour les GTPases de la famille Rho, y compris Rac1. In vivo, les protéines de liaison à Rac1 sont en compétition pour une seule interface de liaison, dont la conformation est dictée par un nucléotide lié. Le nucléotide est à la fois important et difficile à contrôler expérimentalement, en raison du taux d’hydrolyse élevé.

Abstract

Dans ce protocole, nous démontrons une méthode pour comparer la compétition entre les protéines de liaison à la GTPase. Une telle approche est importante pour déterminer les capacités de liaison des GTPases pour deux raisons : le fait que toutes les interactions impliquent la même face des GTPases signifie que les événements de liaison doivent être considérés dans le contexte des concurrents, et le fait que le nucléotide lié doit également être contrôlé signifie que les approches conventionnelles telles que l’immunoprécipitation ne conviennent pas à la biochimie des GTPases. Le test repose sur l’utilisation de protéines purifiées. Le Rac1 purifié immobilisé sur des billes est utilisé comme protéine d’appât, et peut être chargé avec du GDP, une version non hydrolysable de GTP ou laissée sans nucléotides, de sorte que l’étape de signalisation à étudier peut être contrôlée. Les protéines de liaison à étudier sont purifiées à partir de cellules de mammifères, pour permettre un repliement correct, au moyen d’une étiquette GFP. L’utilisation du même marqueur sur les deux protéines est importante car non seulement elle permet une purification et une élution rapides, mais elle permet également de détecter les deux concurrents avec le même anticorps pendant l’élution. Cela signifie que les quantités relatives des deux protéines liées peuvent être déterminées avec précision.

Introduction

Le cytosquelette d’actine qui détermine la forme, la polarité et les propriétés migratoires des cellules de mammifères est régulé par la famille Rho des petites GTPases. Les GTPases de la famille Rho comprennent RhoA qui stimule la contraction du cytosquelette, Rac1 qui stimule la ramification de l’actine et la protrusion membranaire, et Cdc42 qui a des effets similaires sur la polymérisation de l’actine à Rac1 et provoque la formation de filopodes ^1,2. L’activité de signalisation de la GTPase est déterminée par la liaison d’un nucléotide, qui contrôle la contraction et la relaxation des boucles de l’interrupteur I et de l’interrupteur II qui médient les interactions protéine-protéine avec les régulateurs et les effecteurs. Les GTPases liées à la guanosine 5'-triphosphate (GTP) activent les effecteurs en aval, tandis que la forme liée à la guanosine 5'-diphosphate (GDP) est inactive. Dans la cellule, les cycles d’hydrolyse du GTP et d’échange de nucléotides permettent un renouvellement rapide des signaux de la GTPase qui sont nécessaires à la dynamique du cytosquelette. Le renouvellement nucléotidique est régulé par trois mécanismes. Les facteurs d’échange de nucléotides (GEF) de la guanine stabilisent la GTPase sans nucléotides, catalysant l’échange de GDP pour la GTP, et stimulant ainsi l’activité de signalisation de la GTPase ^3,4. Les protéines activatrices de la GTPase (GAPase) catalysent l’hydrolyse de la GTP en GDP, inhibant ainsi l’activité de signalisation de la GTPase ⁵. Les molécules séquestrantes telles que le régulateur de la condensation de la chromatine 2 (RCC2) et les inhibiteurs de la dissociation des nucléotides de la guanine (GDI) obscurcissent les boucles de commutation et, dans le cas des GDI, éliminent la GTPase de la membrane en interagissant avec la queue de prényle ^6,7. Chacune des trois classes de molécules régulatrices interagit avec les boucles de commutation, tout comme les effecteurs en aval et certains régulateurs de trafic tels que la coronine-1C ⁷. Le but de ce protocole est de mesurer la compétition pour le site de liaison du commutateur I/II entre les régulateurs présumés et les molécules de signalisation en aval. Il convient de noter que les tests de compétition testent la liaison à un site de liaison partagé, de sorte que ce protocole ne convient pas pour tester les interactions avec d’autres sites, comme la liaison des GDI à la queue prényle.

La subtilité des différences de conformation entre les formes actives et inactives, combinée à la nature labile du nucléotide lié, a rendu difficile l’étude des événements de liaison à la GTPase. Le rôle du nucléotide lié signifie que les tests de liaison conventionnels tels que l’immunoprécipitation ou la résonance plasmonique de surface ne sont pas bien adaptés à l’investigation, car le nucléotide ne peut pas être contrôlé. Cet obstacle est aggravé par le chevauchement des sites de liaison des GEF, des GAPs, des effecteurs, des molécules séquestrantes et des molécules de trafic, ce qui rend difficile l’interprétation des données de liaison d’une interaction unique dans le contexte de la compétition qui se produira dans la cellule. L’immunoprécipitation, en particulier, est compromise par la compétition entre les partenaires de liaison, car dans certaines conditions cellulaires, un partenaire de liaison peut être identifié au détriment de tous les autres, tandis que dans d’autres conditions, un autre partenaire peut dominer. La nature dynamique de la signalisation de la GTPase est essentielle au fonctionnement de la GTPase et doit être prise en compte lors de l’analyse des relations entre les interactions de liaison des différents régulateurs. En effet, nous avons récemment décrit un parcours qui reposait fortement sur la liaison compétitive. Nous avons identifié la coronine-1C comme une molécule de trafic qui se lie aux boucles de commutation de GDP-Rac1 ⁷. Dans les zones où l’activité du FEM est faible, le trafic domine, ce qui permet d’éliminer le Rac1 de ces régions. Cependant, lorsque Rac1 est délivré dans des régions de la cellule où l’activité du GEF est élevée, le GEF supplante la coronine-1C, activant ainsi Rac1 et empêchant l’élimination de Rac1 médiée par la coronine-1C de cette zone. Le modèle va plus loin, car l’action des échanges du FEM a lié le PIB au GTP, déplaçant encore plus l’équilibre de la coronine-1C. Par conséquent, l’activité de Rac1 pourrait s’expliquer entièrement en termes de concurrence et d’affinité relative.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour comparer les affinités relatives de différents partenaires de liaison pour de petites GTPases, en utilisant Rac1 comme exemple. En utilisant une approche de protéine purifiée, il est possible de reconstituer une chaîne d’événements de signalisation par comparaison, dans une expérience où le nucléotide lié peut être étroitement contrôlé.

Protocol

1. Purification de GTPase de la TPS-étiqueté

1. Culture un E. coli comme BL21 transformées par pGEX-Rac1 O / N à 37 ° C, en agitant à 220 rpm, dans 500 ml de milieu de autoinduction (25 mM Na _{2 HPO 4,} 25 mM KH _{2 PO 4,} 50 mM NH _{4 Cl,} 5 mM de Na _{2 SO} 4, MgSO ₄ 2 mM, _CaCl2 2 mM, 0,5% de glycerol, 0,05% de glucose, 0,2% de lactose, 5 g de tryptone, 2,5 g d'extrait de levure, 100 pg / ml d'ampicilline).
2. Récolte de bactéries par centrifugation pendant 10 min à 10 000 xg, 4 ° C.
3. Remettre en suspension culot bactérien dans 20 ml de réactif d'extraction de protéine, inhibiteur de la protéase 1x et incuber pendant 20 min à température ambiante avec inversion.
4. Clarifier le lysat par centrifugation à 40 000 g pendant 30 min.
5. Ajouter 2 ml de billes magnétiques de glutathion, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS: 10 mM de Na ₂ HPO _4, 1,8 mM de KH _{2 PO} 4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM).
6. Incuber pendant 2 h, le mélange par inversion à 4 ° C.
7. Laver les billes de protéine chargée par quatre fois avec 10 ml de PBS, en utilisant un trieur de particules magnétiques afin de précipiter les billes à chaque étape.
8. Billes dans deux ml de PBS et les remettre en suspension la protéine magasin chargé à -80 ° C dans 100 ul de parties aliquotes jusqu'à utilisation.

2. Expression de protéines de liaison à GTPase

1. La veille de l'expérience, des plasmides transfecter codant la protéine fluorescente verte (GFP) -tagged versions de chaque protéine GTPase-contraignant dans un 75-cm ² ballon séparé de HEK293T comme suit. Pour la validation des nucléotides chargement, transfect GFP-tagged TrioD1 dans un troisième de 75 cm ² flacon de HEK293T.
   1. Diluer polyethylamine à 1 mg / ml dans 100 ul de NaCl 150 mM stérile.
   2. Ajouter 27 ul polyethylamine diluée à 223 ul réduits médias sériques.
   3. Ajouter ADN plasmidique de 12 ug à 250 pi réduits médias sériques.
   4. Incuber chaque tube pendant 2 minutes à température ambiante.
   5. Combinez le polyethylamine et l'ADN se mêle dans un seul tube et vortex pendant 2 min.
   6. Incuber pendant 15-20 min à température ambiante.
   7. Remplacez le support de croissance (milieu Eagle modifié Dulbecco, 10% de sérum fœtal bovin, 2 mM de L-glutamine, pas d'antibiotiques) sur 90% de confluence HEK293T avec 5 ml de milieu de croissance frais.
   8. Ajouter le mélange combiné polyethylamine / ADN à incuber la fiole et O / N à 37 ° C, 5% CO _2.

3. Purification des protéines de liaison à GTPase

1. Rincer flacons de cellules transfectées dans du PBS et égoutter flacon pendant 5 minutes, aspirer le liquide libre.
2. Racler les cellules dans 500 ul de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% de Nonidet P-40, 1x inhibiteur de protease) en tube de microcentrifugation.
3. Lyse des cellules par mélange par inversion à 4 ° C pendant 30 min.
4. Au cours de lyse, laver deux lots de 40 ul perles GFP-Trap trois fois avec le tampon de lyse frais, perles sédimentation à 2700 g pendant 2 min entre les lavages.
5. Clarifier les lysats par centrifugation à 21 000 xg pendant 10 min.
6. Transfert précisé lysat de chacune des protéines de concurrents pour séparer les perles lavées GFP-trap et permettent protéines GFP-fusion pour lier pendant 2 heures, le mélange par inversion à 4 ° C. Gardez lysat de cellules GFP-TrioD1 sur la glace.
7. Laver chargés perles GFP-Trap deux fois dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM de NaCl, 0,7% (p / v) Nonidet P-40 et deux fois dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), mM MgCl 20 ₂ , sédimentation perles à 2700 g pendant 2 min entre les lavages.
8. Éluer les protéines de fusion GFP-40 ul en ajoutant 0,2 M de glycine (pH 2,5) et aspiration et refoulement pendant 30 sec. Immédiatement perles sédiments à 21 000 g pendant 60 s et le liquide de transfert à un nouveau tube de centrifugeuse contenant 4 pi 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Le faire rapidement pour limiter les dommages à la protéine purifiée.
9. Analyser 1 pi de chaque protéine purifiée par Western blot et la sonde avec un anticorps anti-GFP pour déterminer le rendement relatif en utilisant un Blott quantitativeing système selon le protocole du fabricant. En variante, la détermination des concentrations de protéines par l'acide (BCA) bicinchoninique dosage mais cela introduit des erreurs si les protéines ne réagissent pas avec le dosage d'une manière identique ou il ya protéines contaminantes.
10. Égaliser la concentration molaire de la protéine par l'addition de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 _mM de MgCl2.

4. Nucleotide chargement de GTPase

1. Décongeler une aliquote de billes magnétiques TPS-Rac1, préparés à l'étape 1.
2. Prendre 90 pl de billes de GST-Rac1 et laver trois fois avec 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM, en utilisant un trieur de particules magnétiques afin de précipiter les billes à chaque étape.
3. Aspirer à partir du tampon de perles et ajouter 100 ul de 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM de NaCl, 0,1 mM de DTT, 4 mM d'EDTA.
4. Selon que le PIB, GTP ou non nucléotidique chargement est nécessaire pour l'expérience de la concurrence, ajouter 12 ul PIB 100 mM, 12 mM ul gu 10anosine 5 '- [γ-thio] triphosphate (GTPyS) ou pas de nucléotides à 60 pi perles TPS-Rac1.
5. Pour les contrôles nucléotidique de chargement, les billes restantes divisé en trois aliquotes de 10 ul et ajouter 2 ul de 100 mM de PIB, 2 ul de 10 mM de GTPyS non nucléotidique ou de chaque tube.
6. Incuber les mélanges de billes pendant 30 min à 30 ° C avec agitation.
7. Stabiliser nucléotidique liée Rac1 par addition de 1 M _de MgCl2: 3 pi du mélange à expérimental (étape 4.4), 0,5 pi à chacun des mélanges de commande (étape 4.5).

5. Concurrence contraignant.

1. Mettre en place 6 microtubes, contenant chacun:
   200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 _mM de MgCl2
   10 ul expérimentales perles de Rac1 nucléotidiques chargé de l'étape (4.7)
   5 ul de protéine Rac1 liaison A (protéine de liaison constant)
2. Pour chaque tube, ajouter 0, 1, 2,5, 5, 10 ou 20 ul de protéine B de liaison à Rac1 (protéine de liaison variable). Ces volumes supposent unnviron concentrations d'achat d'actions égales des protéines de liaison constants et variables et peuvent avoir besoin d'être ajustée.
   1. Ajustez les volumes de protéines de liaison A et B, si il ya de grandes différences dans les affinités de liaison des deux protéines et cela devrait être déterminées empiriquement à travers les répétitions expérimentales. Porter au volume total du mélange de liaison à 235 ul par addition de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 _mM de MgCl2.
3. Mettre en place un tube de centrifugeuse contenant:
   200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 _mM de MgCl2
   10 ul expérimentales perles de Rac1 nucléotidiques chargé de l'étape (4.7)
   10 pi de protéine Rac1 liaison A (protéine de liaison constant)
4. Mettre en place le PIB, GTPyS et pas de tubes de contrôle de nucléotides:
   200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 _mM de MgCl2
   10 pi de billes de Rac1 de contrôle chargés dans l'étape 4.5 avec le PIB, GTPyS ou non nucléotidique et stabilisées dans l'étape 4.7.
   180 pi HEK293T GFP-TrioD1 lysat préparé comme dans l'étape 3.6
   4 ul _de MgCl2 1 M
5. Incuber le mélange pendant 2 heures, le mélange par inversion à 4 ° C.
6. Laver les billes trois fois avec 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 _mM de MgCl2.
7. Éluer les protéines liées dans 20 pi de tampon d'échantillon réducteurs (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% de SDS, 20% de glycerol, 0,02 mg / ml de bleu de bromophénol, 5% β-mercaptoethanol).

6. Analyse de la concurrence

1. Résoudre 10 ul de la protéine liée (étape 5.6) par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sodium (SDS-PAGE) et transfert de Western.
2. Incuber la membrane à 4 ° CO / N en anticorps anti-GFP dilué 1/1000 dans un tampon bloquant dilué dans du PBS 1x à, 0,1% de Tween-20 pour détecter à la fois des protéines de liaison marquées GTPase.
3. Laver trois fois la membrane pendant 10 minutes avec du PBS, 0,1% de Tween-20.
4. Incuber la membrane pendant 30 minutes à température ambiante dans 800 DyLight conjugué anti-lapin secanticorps secon-, dilué à 1 / 10.000 en tampon de blocage dilué dans du PBS 1x à, 0,1% de Tween-20.
5. Laver trois fois la membrane pendant 10 minutes avec du PBS, 0,1% de Tween-20.
6. Analyser la membrane en utilisant un système d'imagerie infrarouge, en utilisant le logiciel pour mesurer l'intensité des bandes selon le protocole du fabricant.
7. Tracer l'intensité de chaque bande de protéine par rapport au volume du concurrent variable (Protein B).
8. Diviser le volume de concurrent variable au point où les lignes se croisent sur le volume d'concurrent constant (protéine A, 5 pi) pour déterminer le rapport de concurrent à laquelle l'équilibre est atteint.
9. Pour la validation de l'état de chargement de nucleotides, des membranes de sonde pour p21-activated kinase 1 (PAK1) (un effecteur) et GFP-TrioD1 (a FEM), comme décrit dans les étapes 6.1-6.6.

Results

Ce protocole est conçu pour calculer les affinités relatives des partenaires de liaison pour Rac1, sans avoir besoin de connaître la concentration précise des concurrents (Figure 1). Détermination de la concentration en protéine et introduit des erreurs lors de l'examen compétition entre les molécules dans une voie de signalisation préalable. Cependant, il est important de savoir que les deux concurrents ont la même concentration molaire dans les solutions de réserve pour permettre des rapports simples à calculer lors de l'ajout des volumes différents de l'essai. 40 ul de billes GFP-Trap ont une capacité de liaison de ~ 300 pmol de sorte qu'une confluence de 75 cm ² flacons de très cellules exprimant se saturer les billes, de sorte que les préparations des deux protéines de liaison différents seront similaires avant l'ajustement (Figure 2A). Si l'on exprime les protéines de mal, ce problème peut être surmonté par la purification de cette protéine à partir de plus d'un flacon de cellules.

8 (figure 2B). GEFS lier préférentiellement au nucléotide sans GTPase de stabiliser l'état de transition. Comme GEF sont de faible abondance, habituellement inactifs et éponger souvent mal, il est préférable de surexprimer une FEM ou d'un fragment du FEM à l'essai gratuitement GTPase nucléotides. Nous utilisons souvent le premier homologie Dbl du Trio, exprimé comme une fusion GFP (GFP-TrioD1 ⁹⁾ (figure 2B), mais toute FEM travailler. Les protéines qui se lient à la GTPase de PIB chargé sont plus rares. Nous avons récemment rapporté RCC2 comme l'une telle protéine ^7, ou le PIB de chargement peut être validé simplement comme binding à FEM ni ni effecteur.

La sortie à partir de l'expérience sera un transfert de Western illustrant les deux partenaires de liaison marqués GFP liés à la GTPase. En utilisant un seul anticorps pour détecter les deux protéines, les concentrations auxquelles des quantités similaires des deux concurrents se lient peuvent être déterminées et donc les affinités relatives déduites. Dans cet exemple, la concurrence entre le domaine de l'hélice de la protéine Rac1-trafic, coronine-1C (Rac1-binding protein A), et la protéine Rac1-séquestrant, RCC2 (Rac1-binding protein B), est démontré (figure 3A). En utilisant un volume constant de coronine-1C hélice (5 pi), et en ajoutant des volumes croissants de RCC2, nous pouvons voir de la GFP efface que l'équilibre est atteint à 1,25-2,5 ul de RCC2 (astérisque), démontrant que RCC2 a une plus forte affinité pour Rac1 que coronine-1C. En mesurant l'intensité des bandes en utilisant quantitative Western blot, et le tracé des valeurs moyennes pour chaque competitor, le point d'équilibre peut être calculée avec précision, en identifiant les volumes à laquelle se coupent les courbes (figure 3B).

L'un des obstacles possibles à un dosage de compétition est réussie si les partenaires de liaison se lient les uns aux autres ainsi que la liaison à Rac1. Dans la figure 3A + B nous démontrons la concurrence entre RCC2 et le domaine de l'hélice de coronine-1C, plutôt que sur toute la longueur coronine-1C. La raison pour utiliser le coronine tronquée est que coronine-1C se lie également RCC2 à travers le domaine de la queue. Lorsque pleine longueur coronine-1C est titré contre RCC2, la liaison de deux protéines est détectée, en raison de la formation complexe ternaire, plutôt que la concurrence (figure 3C). Si la concurrence est en cours, la liaison d'une protéine va augmenter tandis que les autres baisses, et lié total GFP-fusion restera constant. Dans les cas où un complexe ternaire se forme, il est nécessaire de tronquer une de la protéine GTPase se liant de sorte que la competvisi- plus interagir.

Figure 1. Workflow. Représentation schématique du flux de travail pour déterminer l'affinité des protéines de GTPase liaison en utilisant des analyses de la concurrence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. La validation des protéines purifiées. (A) purifiée GFP-étiqueté protéines analysées par transfert de Western de liaison, sondant avec anti-GFP pour déterminer le rendement relatif des deux protéines Rac1. Ce type d'égalisation pendant l'expérience permet la concentration des deux protéines à être réglé de façon qu'ils correspondent à l'expérience de liaison. (B) GDP, GTPyS et aucun nucléotide chargé TPS-Rac1 a été incubé avec un lysat de HEK293T exprimant la GFP-TrioD1 et protéines détectées en traçant pour PAK1 endogène ou surexprimé GFP-TrioD1 liés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Analyse par Western blot de la protéine par rapport Exemple sorties contraignant. À partir des essais de compétition de liaison. (A) PIB chargé Rac1 a été mélangé avec 5 pi GFP-coronine-1C domaine de l'hélice et de l'augmentation des volumes de GFP-RCC2 ont été titrés en jeu. En Western blot des protéines liées à GFP, des problèmes avec détection différentielle des deux protéines sont évités et le signal de la GFP indique le rapport molaire entre les deux protéines de fusion. Les astérisques indiquent les rapports de concurrence sur eithecôté r du point d'équilibre. (B) des intensités de bande des protéines liées à la GFP de fusion de trois expériences indépendantes ont été mesurées par quantitative Western Blot, en utilisant des anticorps et moyennes secondaires fluorophores conjugué comploté pour calculer le montant de RCC2 nécessaire pour atteindre l'équilibre. (C ) Exemple de sortie à partir d'une expérience dans laquelle des protéines de liaison à Rac1 lient les unes aux autres et forment un complexe ternaire, au lieu de la compétition. PIB chargé Rac1 a été mélangé avec 5 pi GFP-RCC2 et l'augmentation des volumes de GFP-coronine-1C pleine longueur ont été titrés. L'augmentation liée GFP-coronine-1C sans perte de borne GFP-RCC2 indique formation d'un complexe ternaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ce protocole décrit une méthode permettant de comparer les affinités relatives de paires de petites protéines de liaison à la GTPase. Les étapes clés sont la préparation des protéines de liaison à la GTPase purifiées et la charge nucléotidique de la GTPase. L’utilisation de protéines de liaison à la GTPase avec la même étiquette GFP permet de déterminer avec précision les concentrations auxquelles des quantités similaires de chaque concurrent se lient. L’utilisation de GTPase recombinante chargée de nucléotides permet d’interroger les propriétés de liaison de la GTPase dans des conditions d’activité spécifiques. Cette étape est également la plus sensible car les nucléotides vont à la fois s’hydrolyser et se détacher de la GTPase si les conditions de magnésium ne sont pas maintenues avec précision.

Dans la cellule, le grand nombre de protéines de liaison à la GTPase combiné au renouvellement rapide des nucléotides rend ces voies difficiles à interpréter. La simplicité de cette méthode, qui consiste à comparer uniquement des paires de protéines de liaison et à utiliser des conditions de charge nucléotidique soigneusement contrôlées, permet d’élucider les voies de signalisation. Cependant, la plus grande force du protocole est aussi la plus grande faiblesse car il s’agit d’une simplification de la situation in vivo . Les tests de compétition peuvent être utilisés pour construire une hypothèse robuste, mais celle-ci doit ensuite être testée dans des cellules par des expériences de knockdown.

Trois caractéristiques doivent être prises en compte lors de la sélection des protéines de liaison à la GTPase marquées GFP à utiliser dans l’expérience. Tout d’abord, les protéines de fusion doivent bien s’exprimer dans les cellules de mammifères, telles que les HEK293T, car les tests de compétition nécessitent une quantité raisonnable de protéines. Deuxièmement, il doit être possible de purifier la protéine recombinante sans dégradation significative, et lorsque cela n’est pas possible, le clonage d’un fragment de liaison à la GTPase doit être envisagé. Troisièmement, les deux protéines de liaison à la GTPase doivent se dissoudre l’une de l’autre sur SDS-PAGE pour permettre l’analyse dans la section 6.

Il y a un certain nombre de mises en garde potentielles à l’expérience qui doivent être prises en compte, et peut-être abordées :

Dénaturation possible des protéines purifiées de liaison à la GTPase lors de l’étape d’élution acide ou entrave stérique par l’étiquette GFP. Entre nos mains, cela n’a pas été un problème, mais doit être testé. Les protéines purifiées peuvent être testées dans des tests fonctionnels ¹⁰. Il existe maintenant des kits commerciaux pour tester l’activité des FEM ou des GAP sans avoir besoin de nucléotides marqués par des isotopes. Les protéines séquestrantes, de par leur nature, protègent les GTPases de l’activité du GEF ou du GAP, et peuvent donc être utilisées comme inhibiteurs compétitifs dans les essais commerciaux du GEF ou du GAP, comme nous l’avons fait dans notre récente publication ⁷. La caractéristique pertinente des protéines qui circulent dans la GTPase est la capacité de se lier à la GTPase, ce qui peut être testé facilement dans un test de traction. Une autre approche de test de l’intégrité des protéines qui s’applique à toutes les protéines de liaison consiste à titrer la protéine éluée des billes du piège GFP avec de la glycine, la même protéine étant retirée des billes du piège GFP par clivage enzymatique. L’expérience serait analysée en sondant à la fois la protéine marquée à la GFP et la protéine clivée avec un anticorps contre la protéine elle-même. Si la protéine n’est pas endommagée par l’élution, l’équilibre doit être atteint dans un rapport de 1:1. Cette approche indiquerait également si la présence de l’étiquette GFP elle-même compromet les propriétés de liaison de la protéine candidate, bien que cela nécessite la production d’une construction avec un site de clivage enzymatique entre l’étiquette et la protéine de liaison. Que la protéine soit compromise par l’étiquette ou l’étape d’élution, le problème pourrait être résolu en modifiant le protocole pour utiliser une méthode de purification alternative. Plutôt que la GFP, les protéines de liaison pourraient être marquées par His, purifiées à l’aide de Ni-NTA et analysées à l’aide d’un anticorps contre le His-tag. La caractéristique importante est que les deux protéines de liaison doivent partager une étiquette commune, bien que, si nécessaire, deux étiquettes puissent être ajoutées à une protéine, l’une pour la purification et l’autre pour la détection.

Le protocole est conçu pour étudier la concurrence entre les interactions avec les domaines de commutation I/II. Bien que la majorité des interactions de la GTPase soient médiées par ce motif, il existe quelques exceptions, notamment les interactions des GDI qui se lient à la queue prényle, ainsi que l’obscurcissement des domaines de commutation. En principe, le protocole pourrait être adapté pour utiliser la GTPase purifiée à partir de cellules de mammifères, de sorte que la GTPase soit prénylée, cependant, la présence de plusieurs sites de liaison ou des effets allostériques compliquent l’interprétation des données de liaison à la compétition. D’autres problèmes associés à une telle modification sont que les GDI co-purifient avec la GTPase à partir de cellules de mammifères, compromettant la pureté des protéines isolées et la nature hydrophobe des groupes prényles, ce qui signifie que les GTPases prénylées sont associées soit à la GDI, soit à la membrane lipidique et que ces facteurs devraient être pris en compte dans l’expérience.

La quantité de GST-Rac1 utilisée dans l’essai. La protéine de liaison constante à la GTPase doit être à une concentration supérieure à celle de la Rac1, sinon lorsque le concurrent est ajouté, il se liera simplement à la Rac1 libre. Il sera immédiatement évident si cela s’est produit, car la liaison du concurrent, sans perte de la protéine constante, sera détectée à peu près de la même manière que lorsque les deux protéines concurrentes se lient l’une à l’autre, comme le montre la figure 3B. À titre de contrôle supplémentaire (étape 5.3), une réaction de liaison contenant le double de la quantité de protéine de liaison constante et aucune protéine de liaison variable doit être incluse (étape 5.3). Si le Rac1 dans l’expérience de titrage est saturé, doubler la quantité de protéine de liaison constante n’aura aucun effet sur la sortie. Les volumes suggérés dans le protocole devraient être appropriés, mais la quantité de Rac1 peut être facilement réduite. Si la liaison du compétiteur sans perte du partenaire de liaison constant est observée, il faut tenter de réduire la quantité de Rac1 avant d’essayer de cartographier les sites de liaison pour éviter la formation de complexes ternaires.

Interaction non spécifique des protéines de liaison à la GTPase avec la GST ou la bille, ainsi que spécifiquement avec Rac1. Ce problème se manifesterait par une liaison résiduelle de la protéine constante de liaison à la GTPase, même lorsque la protéine variable de liaison à la GTPase a atteint un plateau à forte concentration. L’identification de ce problème sera facilitée par la réalisation d’expériences réciproques où les protéines constantes et variables de liaison à la GTPase sont échangées. Les expériences réciproques amélioreront également considérablement la précision de l’estimation du point d’équilibre, elles doivent donc toujours être incluses. Dans les cas de liaison non spécifique, les concentrations relatives auxquelles l’équilibre est atteint peuvent encore être calculées en comparant l’intensité de la bande entre les maxima et les minima pour chaque protéine, ou en mesurant l’étendue de la liaison non spécifique en utilisant des billes de GST comme appât, plutôt que GST-Rac1.

Des essais de traction utilisant différentes conditions de charge nucléotidique doivent être utilisés pour compléter l’essai de compétition décrit dans le présent protocole. Déterminer la préférence nucléotidique des partenaires est important à la fois pour comprendre les événements de compétition et pour comprendre la voie de signalisation dans laquelle la protéine de liaison à la GTPase est impliquée. Dans la figure 2B , nous analysons la liaison des protéines avec une préférence établie pour la GTPase chargée en GTP ou sans nucléotides comme moyen de valider la charge nucléotidique. Cependant, il est judicieux d’étudier également l’effet de la charge nucléotidique sur chacun des concurrents. Si les concurrents hypothétiques montrent des préférences différentes, la concurrence contribuera moins à la voie de signalisation, et en effet, le renouvellement des nucléotides est probablement le mécanisme qui dirige l’échange des protéines de liaison.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
Inhibiteur de protéase COMPLET	Roche	05 056 489 001
Billes magnétiques de glutathion	Pierce	88821
Polyéthylénimine, ramifiée, moyenne Mw ~25 000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Très instable. Aliquote et stockage à -80 immédiatement après la reconscription
GTP & gamma ; S	Sigma Aldrich	G8634	Très instable. Aliquote et stockage à -80 immédiatement après la reconstitution
Tampon de blocage	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anticorps anti-GFP	Living Colors	632592	Utilisation à 1/1000 de dilution
DyLight 800 Anticorps secondaire anti-lapin conjugué	de chèvre Fisher Scientific	10733944
Anticorps anti-PAK1	Signalisation cellulaire	2602S	Utilisation à dilution 1/1000
Système d’imagerie infrarouge Odyssey SA	Li-cor	9260-11PC