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Évaluation de la propriétés immunomodulatrices des mésenchymateuses humaines cellules souches (MSC)

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DOI :

10.3791/53265

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24 décembre 2015

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1Regenerative Medicine Research Group, Institute of Cellular & System Medicine, National Health Research Institutes (NHRI), 2National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes (NHRI), 3Institute of Microbiology & Immunology, National Defense Medical Center

Dans cet article

Résumé

Les propriétés immunomodulatrices des cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) apparaissent de plus en plus pertinentes pour l'application clinique. L'utilisation d'un système de co-culture de cellules souches mésenchymateuses et leucocytes du sang périphérique pré-colorées avec le succinimidyl ester de carboxyfluorescéine fluorescent du colorant (CFSE), nous décrivons l'évaluation de l'immunomodulation MSC in vitro sur la prolifération des leucocytes et effectrice des sous-populations spécifiques.

Résumé

Les propriétés immunomodulatrices des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) multilignées semblent être très pertinentes pour une utilisation clinique dans un large éventail de maladies liées au système immunitaire. Les mécanismes impliqués sont de plus en plus élucidés et, dans cet article, nous décrivons l’expérience de base pour évaluer l’immunomodulation des CSM en dosant la suppression de la prolifération des leucocytes effecteurs. La prolifération des leucocytes peut être évaluée par un certain nombre de techniques, et nous décrivons dans ce protocole l’utilisation du colorant cellulaire fluorescent carboxyfluorescéine ester succinimidylique (CFSE) pour marquer les leucocytes avec des analyses ultérieures par cytométrie en flux. Cette technique permet non seulement d’évaluer la prolifération sans radioactivité, mais aussi le nombre de divisions cellulaires qui se sont produites, ainsi que d’identifier la population spécifique de cellules proliférantes et l’expression intracellulaire des cytokines/facteurs. De plus, le test peut être adapté pour évaluer des populations spécifiques de leucocytes effecteurs par sélection de marqueurs de surface de billes magnétiques de populations de cellules mononucléées de sang périphérique unique avant la co-culture avec des CSM. La flexibilité de ce test de co-culture est utile pour étudier les interactions cellulaires entre les CSM et les leucocytes.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) sont somatiques progéniteurs qui peuvent se différencier en lignées mésodermiques paraxiaux de l'os, le cartilage, le tissu adipeux et 4/1, ainsi que de quelques lignées extramesodermal 5. Première isolé de la moelle osseuse adulte, ces progéniteurs multilignée ont été trouvés dans de nombreux tissus 6-8 et, de façon inattendue, montré pour avoir des propriétés immunomodulatrices fortes qui apparaissent prête très bien à l'application clinique 9-12. Mécanismes détaillés impliqués dans les effets immunomodulateurs sont activement à l'étude pour une application efficace des entités pathologiques spécifiques. Une des façons les plus simples pour évaluer l'immunomodulation est en évaluant pour la suppression de la prolifération des leucocytes effecteur 13. La plupart des leucocytes effectrices telles que les monocytes et les lymphocytes T prolifèrent prodigieusement lorsqu'elles sont stimulées ou activées. Fonction immunomodulatrice peut être évaluée lorsque la suppression deprolifération est mis en évidence.

Traditionnellement, les leucocytes effecteur prolifération a été évaluée par détection de la [3H] thymidine dans l'ADN. Cependant, cette méthode présente des inconvénients importants en raison des préoccupations de rayonnement et de l'utilisation post-élimination, ainsi que l'équipement complexe nécessaire. Bien qu'il existe des dosages non radioactifs pour évaluer la prolifération cellulaire, l'ester carboxyfluorescéine succinimidyl (CFSE) dosage présente d'autres avantages tels que permettant l'identification de populations cellulaires spécifiques, ce qui est particulièrement utile dans des expériences de co-culture impliquant plusieurs types de cellules. CFSE est un colorant fluorescent cellulaire qui peut être évaluée par analyse de cytométrie en flux. Comme les cellules se divisent, l'intensité de cette étiquette cellulaire est diminuée proportionnellement; cette détermination permet non seulement de la prolifération cellulaire en général, mais aussi permet d'évaluer le nombre de divisions cellulaires jusqu'à 8 divisions avant la fluorescence devient difficile de detect contre signal de fond. En outre, la stabilité du CFSE fluorescent permet un suivi in vivo de cellules marquées telles que les cellules peuvent être trouvées à de nombreux mois 14.

Ce test peut également être modifiée pour évaluer des types spécifiques de leucocytes effectrices ou la fonction immunomodulatrice de populations spécifiques de MSC induite par les leucocytes, tels immunomodulateurs comme l'interleukine-10 (IL-10) la production de monocytes CD14 + 15 en effectuant magnétique bourrelet sélection de marqueur de surface de populations de cellules d'intérêt avant ou après la co-culture selon le cas. Notre protocole décrit l'essai de base de l'évaluation des effets immunomodulateurs de MSC sur les leucocytes effectrices (organigramme représenté sur la figure 1) et une variation sur ce test de base pour l'évaluation du MSC-induite immunomodulation de leucocytes sur CD4 + lymphocytes T effecteurs allogéniques (organigramme représenté la figure 4).

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Protocole

Le consentement éclairé du patient, tel qu'approuvé par le conseil d'examen institutionnel doit être obtenue pour l'utilisation de cellules humaines.

1. Densité isolement Gradient de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (CMSP)

  1. Ajouter 25 ml du sang total hépariné dans un tube de 50 ml par 25 ml d'une pipette.
    1. Diluer les cellules avec 25 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  2. Ajouter 15 ml d'un gradient de densité Ficoll-Paque dans un nouveau tube de 50 ml, et tout en inclinant le tube, très lentement et avec précaution ajouter à 25 ml de la suspension cellulaire diluée sur le gradient de densité de sorte qu'il n'y a pas de mélange du sang entier avec le gradient de densité, à savoir., pas de perturbation de l'interface gradient de densité du sang.
  3. Centrifugeuse la suspension de l'étape 1.2 à 400 g pendant 30 à 40 min dans un balancement rotor libre à température contrôlée, sans frein à 20 ° C.
    Remarque: Trois couches distinctes doivent être apparente après centrifugation: ee couche supérieure étant plasma; la couche inférieure étant clairement le gradient de densité Ficoll-Paque; et une mince couche cellulaire, du milieu étant les CMSP
  4. Aspirer et jeter la couche supérieure par aspiration avec une pipette Pasteur, avec un soin de ne pas perturber la couche d'interphase de cellules mononucléaires (ie, lymphocytes, monocytes et les plaquettes).
  5. Recueillir soigneusement cette couche de cellules mononucléaires avec une pipette de 10 ml à 50 ml d'un nouveau tube de centrifugation.
  6. Remplir le tube avec 20 ml de PBS, bien mélanger, et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 20 ° C. Retirer le surnageant complètement après centrifugation.
  7. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 20 ml de PBS et on centrifuge à 200 g pendant 10 à 15 min à 20 ° C. Retirer le surnageant complètement après centrifugation.
    Remarque: Cette étape élimine les plaquettes qui sont-indésirables au sein de la CMSP; cette étape peut être répétée pour assurer une élimination complète des plaquettes.
  8. Si aucune sélection de populations spécifiques eston le désire, culot de cellules de remettre en suspension dans des leucocytes du milieu complet (10% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de L-glutamine et 1% de pénicilline / streptomycine dans un milieu RPMI-1640) pour la culture après avoir effectué une numération des cellules 16 de suspension 1 ml de moyen par 10 7 PBMC avant de passer à l'étape suivante.

2. marquage magnétique des leucocytes populations (passez à l'étape 4 si aucune sélection des populations spécifiques est requis)

  1. Centrifugeuse CMSP suspension à 300 g pendant 10 min et aspirer le surnageant complètement.
  2. Resuspendre le culot cellulaire dans 80 pi de PBS par 10 7 cellules totales.
  3. Ajouter 20 pi de billes magnétiques spécifiées (c.-à-billes magnétiques CD14 pour l'isolement des monocytes, des billes magnétiques CD4 pour l'isolement de lymphocytes T) par 10 7 cellules totales.
  4. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à 2 à 8 ° C au réfrigérateur.
  5. Ajouter 1-2 ml de PBS par 10 7 cellules pour se laver, et centrifugerà 300 xg pendant 10 min.
  6. Aspirer le surnageant complètement et remettre en suspension jusqu'à 10 8 cellules dans 500 pi de PBS.

3. Sélection magnétique des sous-populations leucocytaires

Remarque: Une variété de séparateurs et des colonnes de billes magnétiques sont disponibles pour l'isolement de la population spécifique de leucocytes par le marqueur de surface cellulaire à partir d'un certain nombre de fabricants. L'isolement peut être par sélection positive à base d'un ou de quelques marqueurs positifs ou négatifs de sélection après l'épuisement des populations non désirées. Une approche générale pour effectuer la sélection positive en utilisant un marqueur (c.-à-CD4 des lymphocytes T auxiliaires, ou pour les monocytes CD14) est décrit ci-dessous.

  1. Préparer et séparateur magnétique PRIME, notamment la colonne de séparation selon les instructions du fabricant.
  2. Appliquer tube contenant l'échantillon de PBMC étiquetés. Fournir deux tubes de 15 ml de centrifugeuses pour la collecte et de l'unlabel marqué positivementfractions cellulaires ed, en suivant les instructions du fabricant.
  3. Compter le nombre de cellules 15 et remettre en suspension les leucocytes sélectionnés positive (soit lymphocytes T CD4 + ou cellules CD14 +) dans leucocytes milieu complet, en utilisant 1 ml de milieu par 10 7 cellules.

4. CFSE coloration des leucocytes pour l'évaluation de la prolifération

Remarque: CFSE a été largement utilisé dans les enquêtes immunologiques, à la fois in vivo et des études in vitro. Notre protocole a été optimisé pour l'étude in vitro de MSC / CMSP (ou d'autres leucocytes) interactions. Bien que les étapes générales impliquées dans la conduite de CFSE marquage in vitro sont similaires, il peut y avoir des différences dans la dose et le calendrier spécifique du protocole 14. Cela peut être dû à un certain nombre de facteurs, à savoir, le type de cellule spécifique utilisé, le nombre de cellules utilisées qui peuvent probablement-affecter l'intensité du signal de fluorescence CFSE.

  1. Diluer la solution stock CFSE (10 mM) dans du PBS à la concentration de travail désirée de 10 pm (solution CFSE-travail). Préparer 10 7 cellules (c.-à-CMSP ou cellules T) pour l'étiquetage de la solution CFSE-travail.
  2. Centrifuger à 300 g pendant 10 min pour obtenir un culot cellulaire et aspirer le surnageant.
  3. Remettre les cellules doucement dans 1 ml de solution préchauffé (37 ° C) CFSE-travail et incuber les cellules pendant 10 min à 37 ° C.
  4. Pour laver l'excès de CFSE, diluer la suspension cellulaire avec 10x (en volume) de pré-refroidie (4 ° C) du milieu RPMI contenant 10% de FBS. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Laver deux fois plus le culot cellulaire de cette manière.
  5. Re-sédimenter les cellules par centrifugation et de compter le nombre de cellules 15. Reprendre 10 7 cellules (soit PBMC ou cellules T) dans 1 ml de milieu complet frais de leucocytes préchauffé.

5. Co-culture de MSC avec des leucocytes et l'activation des leucocytes

  1. Moyen de pré-chaud MSC complet (FBS à 10% (pré-testé pour la croissance des MSC optimal), 1% de L-glutamine et 1% de pénicilline / streptomycine dans un milieu DMEM-bas milieu de glucose) à 37 ° C pendant pas plus de 30 min.
  2. MSC de semences à 50.000 cellules dans 1 ml de MSC du milieu complet dans des plaques de 24 puits (densité de MSC: 25.000 cellules / cm 2) pour la fixation O / N dans un incubateur à 37 °, ce qui permet aux cellules souches pour atteindre 80% de confluence.
  3. Milieu de Aspirer, et sur la base des numéros de MSC graines, ajouter CMSP CFSE-marqués (préalablement marquée-s'il vous plaît se référer à protocole Étape 4 ci-dessus) à la CSM cultivées (ensemencées la veille dans des plaques à 24 puits) dans 1 ml de leucocytes milieu complet à un 01:10 (rapport des cellules) de rapport de co-culture de cellules souches mésenchymateuses à PBMC.
  4. Ajouter la phytohémagglutinine mitogène (PHA), un activateur de leucocytes non spécifique, à une concentration finale de 10 pg / ml dans un volume total de 1 ml de milieu complet leucocytes par puits.
    1. Alternatively, afin de stimuler l'activation des lymphocytes T en particulier: utiliser des a-CD3 / 28 microbilles et ajouter à la co-culture de deux cellules pour obtenir un rapport de 1 à billes-T-lymphocyte: 1.
  5. Pour le contrôle négatif, plaque 500.000 PBMC / puits (ou une population spécifique effecteur des leucocytes; densité cellulaire: 250.000 leucocytes / cm 2) dans une plaque de 24 puits avec 1 ml de milieu complet de leucocytes seulement; pour le contrôle positif, en plus de placage le même nombre de cellules PBMC / puits, ajouter PHA à une concentration finale de 10 pg / ml.
  6. Dans le troisième et cinquième jours de l'expérience de co-culture, d'évaluer la prolifération des leucocytes marqués par CFSE (placées dans des tubes à fond rond) par analyse de cytométrie en flux 17 avec 488 nm excitation et d'émission appropriés pour les filtres de fluorescéine.
    Note: coloration des cytokines intracellulaires pour l'analyse par cytométrie en flux peut également être effectuée à ces leucocytes CFSE marqué à ce point pour évaluer les changements de leucocytes cytokine profil d'expression comme modulated par les CSP. Depuis CFSE est évaluée avec un filtre approprié à la fluorescéine de, les anticorps choisis pour évaluer diverses cytokines ont besoin d'être conjugués à des fluorochromes autres que la fluorescéine ou spectre similaire (à savoir, la phycoérythrine, péridinine complexe protéique de la chlorophylle (PerCP)).

6. Variation: effecteur répression Assay Magnetic Bead-sélectionné, MSC-induite immunomodulateur leucocytes sur CFSE-étiquetés cellules T CD4 + effecteurs activés

  1. MSC de semences à 250.000 cellules dans 3 ml de MSC du milieu complet dans des plaques 6 puits (densité MSC: 25.000 cellules / cm 2) pour la fixation O / N dans un incubateur à 37 °, ce qui permet aux cellules souches pour atteindre 80% de confluence. Au moins 3 plaques de 6 puits sont nécessaires pour assurer suffisamment de PBMC MSC-cocultivés pour la sélection des sous-population.
  2. Aspirer le milieu et ajouter CMSP séparés que par étape 1, mais dans des plaques 6 puits à 2,5 x 10 6 cellules / puits (densité cellulaire: 250.000 leukocytes / cm 2) avec 3 ml de milieu complet leucocytes. Co-culture pour les 48-72 heures dans un incubateur à 37 ° C.
  3. Billes magnétiques sélectionner population spécifique de leucocytes immunomodulateurs MSC-induites (c.-à-cellules CD14 +), conformément aux articles 2-3.
    Notes: coloration des cytokines intracellulaires pour l'analyse par cytométrie en flux peuvent être effectuées à ce stade d'évaluer les changements de leucocytes cytokine profil d'expression, à savoir, l'expression de l'interleukine-10 comme modulés par MSC.
  4. Ajout CFSE marqué cellules T CD4 + allogéniques générés par les sections 2-4 dans des plaques à 24 puits dans 1 ml de complète (densité de cellules T: 250.000 cellules / cm 2) moyen leucocytes aux leucocytes MSC-induites perles sélectionnées selon divers rapports , à savoir, 1:10, 1: 5, 1: 2 et 1: 1 (cellule à cellule) ratios.
  5. Pour stimuler les cellules T CD4 +, CD3 ajouter a- / 28 microbilles conjuguées à obtenir un rapport bille à cellule de 1: 1.
  6. Pour un contrôle négatif, plaque 500.000 cellules T CD4 + / puits dans un (densité de cellules T: 250.000 cellules / cm 2) plaque de 24 puits avec 1 ml de milieu complet de leucocytes seulement; pour le contrôle positif, en plus de placage le même nombre de cellules T CD4 + / puits, ajouter des a-CD3 / 28 microbilles conjuguées à obtenir un rapport bille à cellule de 1: 1.
  7. Sur le 3 ème jour de co-culture, d'évaluer la prolifération des cellules T CD4 + CFSE-marqués (placées dans des tubes à fond rond) par l'écoulement analyse cytométrique 16 avec 488 nm excitation et d'émission des filtres appropriés pour la fluorescéine.

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Résultats

La figure 1 représente le schéma d'ensemble de l'expérience, et la figure 2 illustre l'aspect des différentes conditions de culture cellulaire en tant que visualisées par contraste de phase inversé microscopie. MSC sont des cellules adhérentes avec un fibroblastique, la morphologie en forme de fuseau, tandis que les PBMC et les leucocytes sont de petites cellules non adhérentes rondes. Ces deux types de cellules morphologiquement différents peuvent être clairement vus dans la co-culture. À la fi...

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Discussion

De plus en plus, les propriétés immunomodulatrices des CSM se traduisent en utilisation clinique plus rapidement que la capacité de multilignage de ces cellules souches18-20. Ainsi, les techniques de co-culture de CSM avec des leucocytes et les tests pour évaluer la fonction immunitaire sont importants pour mieux délimiter les mécanismes spécifiques impliqués dans ces propriétés afin d’optimiser l’application thérapeutique efficace.

L’un des aspects techniques les plus critiques po...

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Déclarations de divulgation

Nous n’avons rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l’INDH (CS-104-PP-06 à B.L.Y.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare71-7167-00 AGGrandient de densité pour l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)Life TechnologiesV12883Marquage cellulaire pour la détection de la division cellulaire
Phytoagglutinine (PHA)SigmaL8902Activation des PBMC humains
Dynabeads Activateur T humain CD3/28Life Technologies111.32DActivation des lymphocytes T humains, e.g. CD4+ lymphocytes T, CD8+ lymphocytes T, etc.
autoMACS&trade ; SéparateurMiltenyi BiotecautoMACS&trade ; Séparateurde cellules magnétique
autoMACS® ; ColonnesMiltenyi Biotec130-021-101colonnes de séparation
CD14 microbilles, humain  ;Miltenyi Biotec130-050-201Pour une sélection positive des monocytes et macrophages humains CD14+ à partir de microbilles de
CD4 PBMC, humains  ;Miltenyi Biotec130-045-101Pour une sélection positive des lymphocytes T humains CD4+ des PBMC
RPMI 1640 MediumLife Technologies11875Milieu de culture PBMC/leucocytes humains
DMEM, Low glucose, pyruvateLife Technologies11885Milieu de culture de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM)
L-glutamineLife Technologies25030-081Supplémentation pour le milieu complet MSC
Pénicilline/StreptomycineLife Technologies15070-063Supplémentation pour PBMC/leucocytes et MSC milieu complet
Sérum fœtal bovin (FBS)1) Hyclone, pour la culture MSC  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 2) Life Technologies, pour toutes les autres cellules (c’est-à-dire PBMC, populations leucocytaires spécifiques)1) SH30070.03M 2) 10091-148Lots de pré-test pour le support de la culture MSC in vitro
Plaque de culture cellulaire à 24 puitsCorningCOR3524Plaque de co-culture
Tube à centrifuger de 50 mlCorning430291Isolation PBMC à partir de sang total par Ficoll-Paque PLUS
Tube à centrifuger de 15 ml  ;Corning430766Collection des fractions cellulaires marquées et non marquées
Tubes à fond rondBD Falcon  ;352008Prélèvement de cellules pour l’analyse cytométrique en flux

Références

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Mots-clés

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