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Champ géomagnétique (FMV) et Evolution des végétaux: Étude des effets de la GMF Reprise sur

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DOI :

10.3791/53286

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30 novembre 2015

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1Department of Life Sciences and Systems Biology, University of Turin, 2Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour tester l’hypothèse selon laquelle l’inversion du champ géomagnétique effectif (GMF) induit une expression génique différentielle et modifie la morphologie d’Arabidopsis thaliana. Un système triaxial octogonal de paires de bobines Helmholtz a été utilisé pour générer artificiellement des conditions GMF inversées dans la chambre de croissance des plantes.

Résumé

L'une des observations les plus stimulants dans l'évolution des plantes est une corrélation entre la survenue de champ géomagnétique (GMF) reprises (ou excursions) et le moment de la radiation des Angiospermes. Cela a conduit à l'hypothèse que les altérations de GMF polarité peuvent jouer un rôle dans l'évolution des plantes. Ici, nous décrivons une méthode pour tester cette hypothèse en exposant Arabidopsis thaliana à inverser artificiellement conditions FMV. Nous avons utilisé un magnétomètre à trois axes et les données recueillies ont servi à calculer l'ampleur de la GMF. Trois DC alimentations ont été connectées à trois paires de bobines de Helmholtz et ont été contrôlés par un ordinateur pour modifier les conditions du FMV. Les plantes cultivées dans des boîtes de Pétri ont été exposés à la fois normal et inversé conditions FMV. Expériences d'exposition Sham ont également été réalisées. Plantes exposées ont été photographiés pendant l'expérience et les images ont été analysés pour calculer la longueur des racines et des surfaces foliaires. Arabidopsis ARN total a été extrait et quantitativePCR en temps réel (qPCR) Les analyses ont été effectuées sur l'expression du gène de la cruciférine 3 (CRU3), le transport du cuivre protein1 (COTP1), Redox Responsive Facteur1 transcription (RRTF1), Fe superoxyde dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), thylacoïdales ascorbate peroxydase (tapX), un ascorbate cytosolique Peroxidase1 (APX1), et le NADPH / respiratoires protéines rafale oxydase D (RbohD). Quatre gènes de référence différents ont été analysés afin de normaliser les résultats de la PCR quantitative. La meilleure des quatre gènes a été sélectionné et le gène le plus stable pour la normalisation a été utilisé. Nos données montrent pour la première fois que inversant la polarité GMF utilisant des bobines triaxiales a des effets importants sur la croissance des plantes et de l'expression des gènes. Ce soutient l'hypothèse que GMF inversion contribue à induire des changements dans le développement des plantes qui pourraient justifier une pression plus élevée sélective, pour aboutir finalement à pévolution lant.

Introduction

Le champ magnétique de la Terre (ou de manière équivalente le champ géomagnétique, GMF) est un facteur environnemental incontournable pour tous les organismes vivants sur la planète, y compris les plantes. La GMF a toujours été une caractéristique naturelle de la Terre, afin cours de l'évolution, tous les organismes vivants connu son action. Un nombre croissant de preuves montre que le GMF est capable d'influencer de nombreux processus biologiques 1. Le FMV est pas uniforme et il ya d'importantes différences locales dans son ampleur et la direction de la surface de la Terre. Le GMF à la surface de la Terre présente une large gamme de grandeurs, allant de moins de 30 uT à près de 70 uT. Le GMF protège la Terre et sa biosphère des effets létaux de vent solaire en déviant la plupart de ses particules chargées à travers la magnétosphère 2.

Les plantes répondent à des stimuli environnementaux; et les réponses classiques aux facteurs abiotiques tels que la lumière et la gravité ont été thoroughly décrit en définissant les réponses dites phototropes et gravitropique. Très peu, ou rien, qui est connu sur les mécanismes de perception et de réponses des plantes à des champs magnétiques, malgré la pléthore d'articles publiés sur ce sujet et a récemment examiné 1. Contrairement au champ gravitationnel, la GMF a changé régulièrement au cours de l'évolution des plantes représentant ainsi une importante abiotique facteur de stress qui a été récemment considéré comme une force motrice potentielle éventuellement contribuer à planter diversification et spéciation 2. Inversions géomagnétiques (ou excursions) sont changements de polarité de la GMF. Pendant la vie histoire de la Terre, des inversions FMV ont eu lieu à plusieurs reprises. Ces exposés de la planète à des périodes de force GMF réduite pendant chaque transition de polarité. Certains auteurs ont émis l'hypothèse que ces transitions périodes de faible intensité pourraient GMF ont permis rayonnements ionisants du vent solaire d'atteindre la surface de la Terre, induisant ainsi unele stress cohérente pour les organismes vivants, qui aurait pu être assez forte pour induire des altérations génétiques conduisant finalement à planter évolution 2.

Une analyse détaillée des expériences décrivant les effets des champs magnétiques sur les plantes montre un grand nombre de rapports contradictoires, caractérisé par un manque de mécanismes d'interaction biophysique plausible. De nombreuses expériences sont tout simplement irréaliste, tandis que d'autres manquent d'une hypothèse vérifiable et, finalement, ne sont pas convaincantes 3. Au cours des dernières années, l'état d'avancement de la recherche sur les effets des champs magnétiques sur végétales a été étudié 2,4-11. Récemment, l'effet de champ magnétique à la fois basse et haute a été discuté à fond 1, avec un accent particulier sur la participation des événements d'inversion du FMV sur l'évolution de l'usine 2.

Les moyens les plus directs pour justifier l'hypothèse que les inversions du FMV affectent l'évolution des plantes est de synthétiser un GMFinversion du laboratoire en testant la réponse des plantes à des conditions de champ magnétique normale et inversée. Pour tester cette hypothèse, nous avons construit donc une bobine Helmholtz octogonale paires champ magnétique système de compensation triaxial (bobines triaxiales), qui est en mesure d'inverser précision les conditions normales du FMV.

Nous avons utilisé Arabidopsis thaliana comme plante modèle et nous avons testé l'effet de inversée GMF sur l'expression génétique de certains gènes importants: cruciférine 3 (CRU3), qui code pour une protéine de stockage 12S de semence qui est la tyrosine phosphorylée et son état ​​de phosphorylation est modulée en réponse ABA dans les graines d'Arabidopsis thaliana 12,13; Cuivre Transport protein1 (COTP1), qui code une protéine de la superfamille transport de métaux lourds / désintoxication avec la fonction prédominante dans le sol acquisition Cu et le développement du pollen 14; et Redox Facteur1 transcription sensible (de RRTF1),qui code pour un membre de l'ERF (éthylène facteur de réponse) sous-famille B-3 de ERF / AP2 famille des facteurs de transcription qui contient un domaine AP2 qui facilitent la co-activation synergique de gène des voies d'expression et leur confèrent une tolérance croisée à abiotiques et biotiques souligne 15.

Par ailleurs, nous avons également analysé cinq gènes impliqués dans les réponses au stress oxydatif: Fe superoxyde Dismutase1, (FSD1), qui code pour une enzyme cytoplasmique qui convertit par voie enzymatique et rapidement l'anion superoxyde (O 2 -) et d'eau (H 2 O) au peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2) et de l'oxygène moléculaire (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), qui code pour et qui enzyme qui catalyse la décomposition de H 2 O 2 en eau et oxygène 17,18; ascorbate peroxydase thylacoïdales (tapX), qui code pour un peroxydase thylakoïde chloroplastique qui balaye H 2 O2 19; ascorbate Peroxidase1 (APX1), qui code pour une peroxydase cytosolique qui balaye H 2 O 2 et représente l'une des cibles potentielles de modifications post-traductionnelles induites par des molécules dérivées NO 20; et NADPH respiratoire protéines rafale oxydase D (RbohD) qui code une enzyme qui génère O 2 - et joue un rôle essentiel dans la régulation de la croissance, le développement et la réponse au stress chez Arabidopsis 21.

Notre méthodologie champ inversion fournit la première preuve que le FMV inversion peut induire un changement significatif dans l'expression de la morphologie et le gène de A. racines et des pousses thaliana. Ce protocole fournit un moyen novateur pour évaluer l'effet de la GMF inversion sur la morphologie de la plante et l'expression des gènes et peut être utilisé pour évaluer l'effet potentiel de retournement GMF sur d'autres aspects du comportement de la plante, et ainsi guider la discussion de la role renversement de GMF sur l'évolution de la plante.

Protocole

1. Réglage de la triaxial Bobines

REMARQUE: La figure 1 montre les bobines triaxiales utilisés pour inverser la GMF.

  1. Allumer le magnétomètre à trois axes, dont la sonde est insérée dans les bobines triaxiales.
  2. Allumez l'ordinateur et lancez le logiciel de magnétomètre qui permet aux données d'être collectées à partir magnétomètre trois axes.
  3. Utilisez les valeurs des composants rapportés par le magnétomètre pour calculer l'ampleur de la GMF. Par exemple, avec des valeurs de magnétomètres: Bx = 6.39 uT, Par = 36.08 uT, Bz = 20.40 uT calculer une intensité de champ de 41.94 uT en utilisant l'équation suivante: B = B GMF + B supplémentaires, où B supplémentaire = (Bx 2 + Par Bz 2 + 2) ½ (à savoir, 41,9 uT dans l'exemple).
  4. Allumez les trois alimentations en courant continu (double gamme: 0-8V / 0-20V 5A et / 2.5A, 50W) chacun relié à trois couples des bobines de Helmholtz et connecté à un ordinateur via une connexion GPIB (figure 1B).
  5. Set tensions des alimentations pour générer le champ magnétique désiré avec un vecteur de champ magnétique inversé. Par exemple, avec B GMF comme dans l'étape 1.3 et avec la taille de la bobine de l'instrumentation décrit ici, régler les tensions V x = 0,00 V, V y = 30,52 V, V z = 0.00 V afin de générer une nouvelle résultante B = B + B GMF bobines triaxiaux = (6,38, -36,08, 20.39) uT. ie, un nouveau domaine avec le même ordre de grandeur que B GMF mais pointant vers une direction différente.
  6. Vérifiez le nouveau domaine avec le logiciel de magnétomètre en utilisant la procédure décrite au point 1.3.
  7. Exposer les plantes à la fois normal et inversé conditions FMV en utilisant des boîtes de Pétri comme décrit dans la section 2.
  8. Effectuer des expériences d'exposition fictive en gardant l'amplitude du champ égale à | B GMF | et la tenuela composante verticale du champ égale à celle de la GMF mais la modification de la direction (à savoir, "Nord, Est ou Ouest") de la composante horizontale du champ par des courants égaux dans les enroulements à trois axes par rapport à l'état d'inversion de champ. Pour ce faire, par modification de la tension des bobines comme décrit dans 1.5.
    Remarque: Cette exposition fictive exclut chauffage subtile potentiel ou les effets de vibration provenant soit les bobines elles-mêmes ou de l'électronique utilisés pour contrôler les bobines.
  9. Exécutez expériences en double aveugle en appliquant des conditions de terrain aveuglés de personnel réalisant le reste des expériences et / ou l'interprétation des données.

2. Préparation des matériaux et des conditions de croissance Plant

  1. Utiliser des semences d'Arabidopsis thaliana, écotype Columbia 0 (Col 0), placer ensuite dans un tube de 1,5 ml et surface stériliser par traitement avec une 5% (p / v) de solution d'hypochlorite de calcium et 0,02% (v / v) de Triton X-100 dans 80% d'éthanol (EtOH), pour 10 à 12 min à 25-28 ° C, sous agitation continue. Puis rincer deux fois avec 80% EtOH, laver avec de l'EtOH à 100% et enfin rincer à l'eau distillée stérile.
  2. Préparer 1 litre de 22 Murashige et Skoog (MS) modifié par adjonction moyen: 2,297 g de MS (MS 0,5 x Basal Mélange de sel), 10 g de saccharose, de l'eau désionisée jusqu'à 1 L, pH ajusté de 5,8 à 6,0 avec KOH. Ajouter 16 g d'agar et autoclave pendant 20 min, 120 ° C.
  3. Avant la solidification, versez 80 ml ​​de milieu dans chaque (120 x 120 mm 2) boîtes de Pétri carrés. Semez trente semences stériles sur la plaque, puis sceller les plaques avec un film cireux.
  4. Vernalize les plaques horizontalement dans l'obscurité à 4 ° C pendant 2 jours pour potentialiser et de synchroniser la germination, puis exposer boîtes de Pétri soit normale ou inversée GMF.
  5. Exposer les graines dans un environnement contrôlé de température à 22 ° C en position verticale dans des expériences parallèles à la fois à l'intérieur des bobines triaxiales et à l'extérieur des bobines triaxialesen vertu d'un calendrier de photopériode de 8 h obscurité et 16 heures de lumière, en utilisant des lampes à vapeur de sodium (220 x 10 -6 m E -2 s -1). Utilisez un film de gélatine bleue pour projecteur pour réduire la composante rouge de lampes.
  6. Exposer les plantes pendant 10 jours avant l'extraction de l'ARN à la fois normale (contrôle) et l'inversion (de traitement) du FMV.
  7. Après l'exposition, prendre des photos des boîtes de Pétri.
  8. Utilisez le logiciel ImageJ pour calculer les zones de la longueur des racines et des feuilles.
    1. Brièvement, mesurer le côté de la boîte de Pétri, puis ouvrez l'image de la boîte de Pétri et en utilisant l'option de ligne "droite" pour dessiner une ligne qui traverse exactement le côté de la plaque.
    2. Dans le menu «analyser», sélectionnez «barème fixé" et insérez la distance réelle dans la boîte "de distance connue" (par exemple, 120 mm), puis insérez l'unité de longueur (mm); enfin cliquez sur l'option "global" pour effectuer les réglages disponibles pour toutes les mesures.
    3. Pour Root longueur, suivre attentivement la forme de la racine à l'aide de l'outil à main levée. Mesurer la longueur à l'aide de l'option "mesure" dans le menu "analyser". Continuer à mesurer toutes les racines dans l'image et enregistrez le fichier pour d'autres analyses statistiques.
    4. Pour la surface foliaire, dans le menu "image" utiliser l'option, puis "seuil de couleur" régler. Sélectionnez la feuille individuelle et dans le menu «analyser», sélectionnez «analyser des particules". Sauvegardez les mesures individuelles pour des analyses statistiques.

3. Arabidopsis Extraction des ARN totaux, quantitative PCR en temps réel (qPCR) Conditions de réaction et d'amorces pour Arabidopsis

  1. Recueillir séparément 30 et 30 pousses racines et geler immédiatement dans de l'azote liquide. Ensuite moudre dans l'azote liquide avec un mortier et un pilon.
  2. Isoler l'ARN total en utilisant un kit de purification et de RNase-Free kit de traitement de DNase en utilisant manufacturles instructions du RE.
  3. Vérifier la qualité et la quantité de l'échantillon en utilisant un kit d'électrophorèse de l'ARN et de nano gel capillaire selon les instructions du fabricant. Confirmer la quantification de l'ARN par spectrophotométrie.
  4. Utiliser 2 ug d'ARN total et des amorces aléatoires en utilisant un kit d'ADNc transcription inverse pour obtenir des ADNc de premier brin selon les recommandations du fabricant.
  5. Effectuer toutes les expériences sur un système en temps réel en utilisant SYBR Green I avec ROX comme une norme de chargement interne.
  6. Effectuer la réaction avec 25 pi de mélange constitué de 12,5 ul de 2x SYBR Green QPCR Master Mix, 0,5 pi de l'ADNc et 100 amorces nm. Utilisez les amorces énumérées dans le tableau 1. Inclure dans les contrôles des contrôles non-RT (en utilisant l'ARN total sans transcription inverse pour surveiller la contamination d'ADN génomique) et des contrôles non-modèle (eau au lieu de modèle).
  7. Calculer l'efficacité primaire pour toutes les paires d'amorces utilisant la normeméthode de la courbe 23.
  8. Utiliser les conditions de PCR suivantes: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min à 95 ° C, 40 cycles de 15 s à 95 ° C, 30 secondes à 58 ° C, et de 30 sec à 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, RETOUR1, GAPC2, CAT3, tapX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min à 95 ° C, 40 cycles de 15 s à 95 ° C, 20 sec à 57 ° C, et de 30 sec à 72 ° C.
  9. Lire la fluorescence après chaque phase de recuit et l'extension. Pour tous les essais, effectuer une analyse de courbe de fusion de 55 à 95 ° C en incluant le segment de dissociation dans le profil thermique. Utilisez l'écran de la courbe de dissociation, accessible via l'onglet Résultats pour voir le profil de dissociation (de la parcelle de la fluorescence en fonction de la température). Assurez-vous que l'ensemble des données recueillies au cours du segment de dissociation de l'expérience est sélectionné pour l'analyse en utilisant l'écran Analyse / Setup.
  10. Déterminer la lEcouteur gamme de concentration de matrice de valeur de cycle seuil (valeur de Ct) en effectuant une série de dilutions par dix (de 1 à 10 3 -fois) en utilisant un ADNc à partir de trois extractions d'ARN indépendantes analysées dans trois répétitions techniques 24,25.
  11. Analyser toutes les parcelles d'amplification avec le logiciel de l'instrument de PCR en temps réel pour obtenir des valeurs de Ct. Calibrer et normaliser les niveaux d'ARN rapport avec le niveau des meilleurs gènes de ménage comme suit: 3.11.1) Accéder au Amplification écran Parcelles via l'onglet Résultats, sélectionnez la rampe ou plateau pour lesquels les données doivent être analysées à l'aide de l'écran / Setup Sélection Analyse, puis sélectionnez la DRN (fluorescence normalisée de référence corrigée) dans le menu de fluorescence sur le panneau de commande. Accéder à la plaque écran exemples de valeurs à travers l'onglet Résultats pour afficher les valeurs de Ct pour les puits échantillonnés.
  12. Utiliser quatre gènes de référence différentes [par exemple, cytoplasmique de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, (GAPC2), l'ubiquitine spécific protease 6 (UBP6), actine-1 (ACT1) et le facteur d'élongation sous-unité alpha 1B 2 (eEF1Balpha2)] pour normaliser les résultats de la PCR en temps réel. Sélectionnez le premier rang génique utilisant un logiciel d'analyse 26; et d'utiliser le gène le plus stable pour la normalisation.
    1. En bref, organiser les données d'entrée sur une feuille Excel avec la première colonne contenant les noms de gènes et la première ligne contenant les noms des échantillons. Ensuite, sélectionnez le logiciel d'analyse de la barre de menu. Utilisez la boîte de dialogue pour sélectionner les données d'entrée.
    2. Ensuite, vérifiez les champs les noms d'échantillons, les noms de gènes et simple sortie seulement. Cliquez sur le bouton Go pour effectuer l'analyse. Sélectionnez le haut gène classé (qui a la valeur de stabilité plus petit) comme gène candidat le plus exprimé de façon stable.
  13. Données de parcelle par montrant le changement expression pli différentiel dans les deux pousses et des racines.

4. Analyses statistiques

  1. Exprimez données en tant que valeurs moyennes ± erreur standard. Comparez le control et les groupes de traitement en effectuant une analyse de variance (Anova) et le test de Tukey avec Bonferroni et Dunn-Sidak test de probabilité ajusté (0,95% de confiance).

Résultats

L'objectif de ce protocole est de fournir une méthode pour évaluer si l'inversion du champ géomagnétique (GMF) peut affecter le développement de la plante et l'expression du gène d'Arabidopsis thaliana écotype Col 0. bobines triaxiales comme le montre la Figure 1A sont utilisés pour inverser la GMF quand ensemble avec les tensions de commande appropriées (figure 1b), obtenu comme décrit dans l'étape 1.5 dans le protocole. Les dimensions des bobines triaxiales sont ~ 2 x 2 x 2 m 3, ce qui a permis un espace suffisant aux conditions FMV inversées pour accueillir plusieurs boîtes de Pétri. Les témoins ont été cultivées dans les mêmes conditions environnementales et à des valeurs normales du FMV. Après 10 jours d'exposition à la normale et inversée conditions FMV, le phénotype des plantes a montré altérations morphologiques évidentes. Comme le montre la Figure 2, les plants témoins (par exemple, cultivées dans des conditions normales FMV) ont montré des racines avec des longueurs sensiblement Prob (Dunn-Sidak Bonferroni et corrigés <0,001;T de Student = 10,68, df = 31) des valeurs plus élevées (29,41 mm; SEM = 1,04; n = 32) par rapport à des plantes exposées à inversée GMF (17,53 mm; SEM = 0,58; n = 36). Chez les plantes GMF-inversées, la morphologie des pousses a également été modifié par un développement réduit représentant de l'expansion de la valve. Plantes exposées à des conditions normales ont montré une superficie moyenne de feuilles de 4,95 mm 2 (SEM 0,025, N = 54), tandis que les plantes exposées à des conditions FMV inversées ont montré de manière significative (Dunn-Sidak et Bonferroni ajusté Prob = <0,001; t de Student = 31.32, df = 53) des valeurs inférieures des feuilles de la région (3,71 mm 2; SEM = 0,032; n = 54). Par conséquent, l'exposition à des conditions d'Arabidopsis FMV inversées induit une réduction à la fois dans la longueur des racines et la surface foliaire.

L'expansion et la croissance Feuille racine dépendent à la fois la division et l'élongation des cellules 27. Par conséquent, le développement de la plante, la productivité et la condition physique sont tributaires d'une prise de vue et la racine système architecture optimale 28. La longueur des racines et des feuilles taille réduite des plantes exposées à des conditions FMV inversées indiquent la présence d'un système de détection capable de percevoir non seulement les variations de l'intensité du champ magnétique, mais aussi pour répondre aux changements dans le domaine de "direction" magnétique par rapport à la gravité. L'hypothèse que le FMV inversion peut affecter la croissance de la plante trouve des preuves convaincantes dans nos expériences, qui démontrent que les conditions d'inversion du FMV peuvent affecter de manière significative le développement de la plante.

Les modifications morphologiques ont été accompagnés par des changements dans l'expression génique. Parmi les gènes ménage, le gène le plus stable est le facteur d'élongation 1B sous-unité alpha 2. Le premier groupe de gènes (CRU3, COTP1, RRTF1) a montré une altération dramatique dans l'expression des gènes (Figure 3). Pousse expression de tous les trois gènes a été augmenté de façon significative (P <0,05) d'environ 2,5 fois dans les plantes exposées à la réserved conditions FMV. Expression de la racine de CRU3 a été régulée à la hausse dans les racines de plantes exposées à des conditions normales du FMV, mais était significative (P <0,05) régulée à la baisse dans des conditions FMV inversées. L'inverse a été trouvée pour COTP1 et RRTF1, qui ont été régulée à la baisse dans des conditions normales et régulée à la hausse dans la présence de GMF inversion (Figure 3).

Cruciférine (une globuline 12 S) est une protéine de stockage le plus abondant dans les graines de A. thaliana et d'autres crucifères et est synthétisé comme un précurseur dans le réticulum endoplasmique rugueux. Il est ensuite transporté vers les vacuoles de stockage de 13 protéines. Plantule germination exige la rupture de la cruciférine, qui est utilisé comme source initiale de l'azote. La régulation de la dégradation cruciférine réduit le développement des embryons en altérant les structures cellulaires ou des composants cellulaires de développement 29,30. Nos résultats montrent que la régulation positive de CRU3 corrélation avecune expansion de la feuille inférieure et une longueur de racines réduit, ce qui indique que ce gène dans GMF sensible à l'inversion et que sa surexpression peut contribuer à la réduction du développement de la plante. En outre, GMF induit une régulation à la baisse renversement significatif de CRU3 dans les racines, qui est en corrélation avec une longueur de racines réduit. Le cuivre est un cofacteur essentiel pour les processus clés dans les plantes, mais elle exerce des effets néfastes lorsque supérieures; Ainsi, la surexpression de transport du cuivre compromet la croissance des plantes. L'effet de la GMF inversion était une surexpression significative de COTP1 dans les deux pousses et des racines, ce qui explique la croissance de la plante réduite. Le stress altère le métabolisme Ion chloroplaste, qui est étroitement liée à l'état de la pile redox. Chez Arabidopsis RRTF1 le facteur de transcription est importante pour l'expression de gènes associés à la possibilité d'ajuster à des changements redox 31. Par conséquent, quand les plantes sont exposées à des stimuli externes capables de modifier leur développement physiologique etal programmes une surexpression de cet important facteur de transcription est attendue. Renversement de la GMF a induit une surexpression significative de RRTF1 dans les deux pousses et des racines, indiquant ainsi plus élevés de stress oxydatif réponses des plantes aux conditions FMV inversées.

Des résultats intéressants sont obtenus en analysant les cinq gènes impliqués dans le stress oxydatif. En général, tous les gènes extraites et analysées dans les pousses ne montrent pas de différences significatives (P> 0,05) lorsque les plantes ont été cultivées dans des conditions normale ou inversée FMV (figure 4 et figure 5). Cependant, une régulation à la baisse significative a été observée chez toujours racines des plantes exposées à des conditions FMV inversées. En particulier, CAT3 a montré la plus forte régulation à la baisse (figure 5), suivie dans l'ordre de la régulation négative par APX1, FSD1, RBOHD et tapX (Figure 4).

Tolérance à une Croixstress biotique et abiotique est fourni par l'activation des différents gènes impliqués dans plusieurs voies biochimiques. RRTF1 facteur de transcription facilite le co-activation synergique de l'expression génique de ces voies 15,31, et peut être potentiellement impliqué dans le stress oxydatif 32. Par conséquent, la régulation positive de RRTF1 est attendue lorsque piégeage de l'oxygène est réduite. Régulation à la baisse des enzymes d'élimination des racines est corrélée avec la régulation à la hausse de RRTF1, qui agit en réponse à une augmentation du stress oxydatif. La régulation à la baisse de la racine dramatique de CAT3, APX1 tapX et indique la capacité réduite des cellules de la racine à nettoyer H 2 O 2, qui est accompagné par la capacité réduite à dismuter l'anion superoxyde par la régulation négative de FSD1. Les réponses de stress oxydatif est plus élevé dans les racines, qui semblent être le site principal de la perception inversée GMF.

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Figure système de compensation de champ 1. géomagnétique. (A) des bobines triaxial (comprenant une paire de bobines de forme octogonale pour chacun des trois axes perpendiculaires) utilisés pour inverser le vecteur champ géomagnétique. (B) Un bloc d'alimentation commandé par ordinateur est relié à chaque paire de bobines de Helmholtz. (Tensions dans ces chiffres sont arbitraires) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Effets d'inversion du champ magnétique terrestre sur le terrain sur Arabidopsis morphologie. Après dix jours de l'exposition, les plantes de contrôle (par exemple, ceux qui sont exposés à des conditions normales FMV) montrent un nombre significativement plus la longueur des racines et plus expandépliants ded comparées à des plantes qui ont été exposés à des conditions FMV inversées. Metric bar = 18 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Effets d'inversion du champ géomagnétique sur l'expression des gènes d'Arabidopsis. Au bout de dix jours d'exposition, l'ARN total de contrôle et les plantes traitées a été extrait et analysé par PCR en temps réel pour l'analyse d'expression. L'effet de renversement de la GMF était d'induire un changement radical dans l'expression du gène de tous les gènes qui ont été testés CRU3, cruciférine 3;. COTP1, cuivre Transport protein1; RRTF1, Redox Responsive Facteur1 transcription. Bars indiquent l'erreur type; astérisques indique significative (p <0,05) différences entre les plfourmis exposées à des conditions FMV inversés et normales. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. Effets de inversion du champ géomagnétique sur Arabidopsis expression du gène lié antioxydant. Au bout de dix jours d'exposition, l'ARN total de contrôle et les plantes traitées est isolé et utilisé pour l'analyse de l'expression génique en utilisant PCR en temps réel. L'effet de renversement de la GMF était d'induire aucun changement significatif dans l'expression du gène de tournage; cependant, une régulation à la baisse drastique a été observée dans l'expression des gènes des racines des plantes cultivées dans des conditions FMV inversées tapX, thylacoïdales ascorbate peroxydase;. APX1, ascorbate Peroxidase1; FSD1, Fe superoxyde Dismutase1; RbohD, NA. DPH / respiratoire rafale oxydase protéine D Bars indiquent l'erreur type; astérisques indique significatives (P <0,05) différences entre les plantes exposées à des conditions normales et FMV inversées. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5. Effets de l'inversion du champ magnétique terrestre sur le terrain sur Arabidopsis catalase 3 (CAT3) l'expression des gènes. Au bout de dix jours d'exposition, l'ARN total de contrôle et les plantes traitées est isolé et utilisé pour l'analyse de l'expression génique en utilisant PCR en temps réel. L'effet de renversement de la GMF était d'induire aucun changement significatif dans l'expression du gène de tournage; cependant, une régulation à la baisse drastique a été observée dans l'expression des plantes cultivées sous conditions FMV inversées du gène de la racine. Les barres indiquent une erreur normer; astérisques indique significatives (P <0,05) différences entre les plantes exposées à des conditions normales et FMV inversées. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous avons récemment montré qu'une étonnante corrélation existe entre les inversions de FMV et le moment où le détournement de la plupart des lignées familiales Angiospermes survenu 2. Cependant, malgré les hypothèses stimulantes et la pléthore d'études sur l'effet des intensités variées FMV, l'hypothèse que le FMV inversion peut se induire des changements importants dans l'expression des gènes de la plante et de la morphologie n'a jamais été démontrée. Ici, nous montrons pour la première fois, un procédé qui utilise une bobine de Helmholtz octogonal triaxial pour inverser GMF dans notre laboratoire, et que l'inversion du champ magnétique ambiant peut provoquer des changements phénotypiques et modulation de l'expression génique dans les plantes.

Afin d'obtenir l'inversion GMF (ou modification) sur un volume suffisant pour les expériences de la croissance des plantes (2 x 2 x 2 m 3), nous avons construit un système octogonale de bobines de Helmholtz. Ce système ne sont pas disponibles dans le commerce (bobines de Helmholtz sont généralement en forme d'anneau et plus petit)et les coûts de construction ont été considérables. Surtout, ce système offre une modification du champ robuste, avec des temps exceptionnelle stabilité et l'homogénéité dans les champs magnétiques modifiés.

Le système est conçu et construit pour réduire la valeur de la GMF à un millième des conditions normales ou de renverser l'un des trois dimensions du champ magnétique. Cependant, la conception des bobines ne permet pas de générer une intensité de champ magnétique élevé. Par conséquent, cet instrument dans sa forme actuelle ne convient pas pour des expériences visant à évaluer l'effet de la force du champ magnétique élevé sur les plantes ou d'autres organismes.

En laboratoire, l'altération de la GMF similaires à ceux décrits dans ce procédé a été obtenu par différentes méthodes, y compris le blindage en entourant la zone expérimentale par des plaques métalliques ferromagnétiques à perméabilité magnétique élevée, qui diffèrent des champs magnétiques et les concentrer au sein du métal lui-même. The avantage d'utiliser des bobines de Helmholtz est que le système permet aux plantes d'être exposés à des conditions plus naturelles (lumière, circulation d'air, etc.), ce qui le rend idéal non seulement pour les études in vitro (comme avec l'utilisation de boîtes de Pétri) mais aussi pour vivo la croissance de la plante et des expériences de développement. Les dimensions de notre système de créer un espace qui permet une suppression à <1 / 1000e du GMF naturelle tout au long d'un 25 x 25 x 25 cm 3 volume sphérique (voir la figure 1A), permettant ainsi d'accueillir plusieurs boîtes de Pétri ou certains petits pots pour la croissance des plantes.

La méthode présentée ici a été appliquée à des études de biologie végétale; Cependant, le système permet un large éventail d'expérimentation, y compris la virologie et de microbiologie, ainsi que des études sur les nématodes (par exemple, Caenorhabditis elegans), les arthropodes et les petits animaux (y compris les souris et les rats). Par conséquent, les tests de l'hypothèse que l'inversion de la GMF est capablepour induire des changements morphologiques et de transcription pourraient également être étendus à de nombreux autres systèmes de vie, peut-être en fin de compte, même pour les cellules humaines.

Le FMV est en constante évolution et fluctuante. Par conséquent, dans nos expériences un défi majeur est de fournir une compensation constante de la GMF pour obtenir les nouvelles valeurs souhaitées FMV. Cela ne peut être réalisé par un contrôle continu des valeurs de champs magnétiques à travers la lecture des valeurs de magnétomètres et compensation de tension. Par conséquent, le système peut compenser la partie variant lentement de la GMF, mais il ne fait rien pour les plus élevés fluctuations de fréquence.

En conclusion, l'utilisation de bobines triaxial pour inverser le vecteur FMV a contribué à démontrer que ce renversement du vecteur GMF est capable d'induire des changements morphologiques végétales et l'expression différentielle des gènes. Les résultats obtenus avec la méthode présentée fournissent une preuve convaincante à l'appui de l'hypothèse que la re GMFlettrines pourraient avoir été l'une des forces motrices de l'évolution des plantes sur des périodes géologiques 2.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention au MEM du Département des sciences de la vie et de la biologie des systèmes de l’Université de Turin, en Italie. Les auteurs remercient G. Gnavi pour l’assistance technique lors de certaines expériences. CTR est financé par le Wellcome Trust et la Royal Society (numéro de subvention 098436/Z/12/Z).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Magnétomètre à trois axesBartington  ;Mag-03MCmagnétomètre triaxial fluxgate
Alimentation magnétomètreBartington  ;Mag-03PSUmagnétomètre triaxial fluxgate
Logiciel de magnétomètreBartington  ;Mag03DAMmagnétomètre à fluxgate triaxial
alimentation DC  ;Agilent TechnologiesE3642A
Hypochlorite de calcium  ;Sigma211389
Triton X-100²SigmaX100  ;
Éthanol  ;Sigma2860
GroLux Lampes à vapeur de sodium  ;OSRAM Sylvania600W
RNeasy Kit d’ARN pour plantes  ;Qiagen74903
Sans RNase  ;Qiagen79254
Agilent 2100 BioanalyseurAgilent TechnologiesG2938B
NanoDrop ND-1000  ;Thermo Fisher Scientificnon disponible
Kit de transcription inverse de l’ADNc haute capacité  ;Applied Biosystems4368813
Mx3000PAgilent Technologies401512
2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix  ;Fermentas International, IncK0221
ParafilmSigmaP7793-1EA
Murashige et Skoog Basal MediumSigmaM5519  ;
Boîte de Pétri carrée (120 x120 mm2)SigmaZ692344  ;

Références

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