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Article de méthode

Décrire un règlement dépendant du facteur de transcription de l'microARN transcriptome

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DOI :

10.3791/53300

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15 juin 2016

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1Division of Hematology, Davidoff Cancer Center, Rabin Medical Center, 2The Center of Nanoscience and Nanotechnology, Tel Aviv University, 3Experimental Therapeutics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Dans cet article

Résumé

Dans ce document, nous proposons une stratégie pour étudier l’effet d’un facteur de transcription d’intérêt sur le transcriptome du microARN en utilisant des données accessibles au public, des ressources de calcul et des données à haut débit provenant de réseaux de microARN après transfection de cellules avec de petits ARN en épingle à cheveux (sh)RNA ciblant un facteur de transcription d’intérêt.

Résumé

Alors que la régulation de la transcription des gènes codant des protéines a été largement étudié, on sait peu sur la façon dont les facteurs de transcription sont impliqués dans la transcription des ARN non-codant, en particulier des microARN. Ici, nous proposons une stratégie pour étudier le rôle potentiel du facteur de transcription dans la régulation de la transcription des microARN en utilisant des données publiquement disponibles, les ressources de calcul et de données à haut débit. Nous utilisons la signature épigénétique H3K4me3 pour identifier les promoteurs de microARN et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) données -sequencing du projet ENCODE pour identifier les promoteurs de microARN qui sont enrichis avec des sites de liaison du facteur de transcription. Par transfection de cellules d'intérêt avec shRNA ciblant un facteur de transcription d'intérêt et à soumettre les cellules à matrice microRNA, nous étudions l'effet de ce facteur de transcription sur le transcriptome microARN. A titre d'exemple illustratif, nous utilisons notre étude sur l'effet de STAT3 sur le transcriptome microRNA de ly chroniqueleucémie mphocytic (CLL) cellules.

Introduction

Les microARN sont de petits ARN régulateurs non codantes endogènes qui fonctionnent généralement comme des régulateurs négatifs de l'expression de l'ARNm au niveau post-transcriptionnel. Environ 1000 non codante entre 20 et 25 nucléotides de long microARN sont présents dans le génome humain 1,2. Les microARN régulent l'expression des gènes par appariement de bases canonique entre la séquence de semence de la microARN et sa séquence de match de semences complémentaire, qui est généralement situé à la région 3 'non traduite (UTR) des ARNm cibles. Collectivement, les microARN réglementent plus de 30% des gènes codant des protéines 3, mais seulement on connaît peu la transcription de l' ADN de microARN. Il a été suggéré que la régulation de la transcription microARN est similaire à celle de l' ARNm de 4,5. En particulier, celle de son activité dans la promotion de la transcription des gènes codant pour des protéines, des facteurs de transcription sont censés activer la transcription de microARN 6. Facteur de transcription microRNA jeu a été rapporté comme un facteur de modulation de l' expression génique 7, et peut également former un feed-back et des boucles feed-forward. Par exemple, Yamakuchi et al. A rapporté une boucle de rétroaction dans laquelle p53 induit l'expression de microRNA34a, qui à son tour inhibe la traduction de la p53 SIRT répresseur et d' accroître ainsi l' activité de p53 8.

Alors que des exemples spécifiques de facteur de transcription expression dépendante de microARN ont été signalés, une méthode acceptée qui fournit des informations sur la façon dont un facteur de transcription d'intérêt régule l'expression du microARN-transcriptome fait défaut. Le but du protocole proposé ici est de fournir une description détaillée de la réglementation des facteurs dépendant de la transcription du microARN-transcriptome. En combinant les données publiquement disponibles, les outils bioinformatiques et en utilisant la technologie des puces à ADN, les chercheurs qui suivent cet algorithme seraient en mesure de capturer sur une échelle génomique comment unfacteur de transcription dans tout type cellulaire d'intérêt régule l'expression du microARN-transcriptome et d'explorer une contribution putatif du facteur de transcription de l'ARNm dans la régulation de l'expression de microARN.

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Protocole

1. Identifier Facteur de transcription sites de liaison dans le promoteur des gènes microARN en utilisant l'approche d'exploration de données

  1. Utilisez l'Université de Californie à Santa Cruz (UCSC) navigateur génome pour extraire des données immunoprécipitation (ChIP) de séquençage de chromatine générés dans le cadre de l'Encyclopédie de l'élément d'ADN projet (ENCODE).
    1. Ouvrez le navigateur de table dans le navigateur de génome UCSC.
    2. Utilisez les spécifications suivantes pour extraire la table: Clade: (Mammifères), génome: (Human), Assemblée: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), le groupe: (règlement), piste (TxnFactorChIP), table: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), région : (Genome), le format de sortie (tous les gènes de la table sélectionnée).
    3. Enregistrer la sortie de 1.1.2 en tant que fichier .txt et dans une feuille de calcul.
    4. Tri et filtre pour le facteur de transcription d'intérêt (par exemple, STAT2).
  2. Utilisez la liste des promoteurs microRNA basé sur H3K4me3 épigénétique signature disponible au Baeer et al. 9 . Copier cette liste dans un fichier .txt.
  3. Pour correspondre selon les coordonnées sur le génome humain, cartographier les données à partir de 1.1 et 1.2 (par exemple, la liaison STAT3 sur les promoteurs de microARN putatifs) et de déterminer l'affinité de liaison médiane en utilisant le code écrit en C sharp comme indiqué dans supplémentaire fichier 1 codage.

2. Utilisez shRNA Down réguler l'expression d'un facteur de transcription d'intérêt

  1. Plaque de 1,5 x 10 6 cellules provenant d' embryons humains 293 lignée de cellules de rein de 10 cm de la plaque à environ 50% de confluence (DMEM avec 10% de FBS).
  2. les cellules transfecter de 293 lignée de cellules de rein embryonnaire humain avec 5 ug de protéine de fluorescence verte (GFP), des lentivirus contenant des shRNA dirigés vers le facteur de transcription d'intérêt et avec 5 pg de vecteurs d'emballage en utilisant le réactif de transfection pour les cellules adhérentes selon le protocole du fabricant.
  3. En tant que témoin, transfecter les cellules de la lignée cellulaire 293 de rein embryonnaire humain avecbrouillés shRNA et les vecteurs d'emballage selon le protocole du fabricant.
  4. Gardez mélange de transfection sur des cellules pendant 16 heures (à 37 ° C, CO 2 incubateur), puis changer de support à 10 ml frais de 10% du milieu DMEM avec 10% de FBS.
  5. Attendre 48 heures après transfection, centrifuger la culture cellulaire (300 xg, 5 min) et recueillir le surnageant infectieux. Filtrer le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,45 pm (membrane d'acétate de cellulose dépourvue d'agent tensioactif de 25 mm) pour éliminer toutes les cellules flottantes.
  6. On concentre le surnageant et recueillir le lentivirus au moyen d'un dispositif de filtrage ultracentrifugation avec un seuil de 100 kDa. Centrifuger à 950 g pendant 30-60 min jusqu'à ce que le volume a été concentré à moins de 250 pi. Stocker le virus concentré à -80 ° C.
  7. Transfecter les cellules avec le lentivirus. Retirer lentivirus congelés de -80 ° C congélateur et décongeler à la température ambiante. Transfert 100 ul de surnageant viral à un 1,5 ml nouveau tube de microcentrifugation.
    1. Bring le volume dans le tube à 1 ml avec du milieu de sérum réduit. Ajouter le bromure de hexadimethrine à 1 ml virus suspension pour une concentration finale de 10 ng / ml, mélanger délicatement et laisser reposer le mélange pendant 5 min.
  8. Centrifuger 5 x 10 6 cellules pour chaque transduction et doucement remise en suspension du culot cellulaire dans 0,5 ml de milieu contenant le virus. Que les cellules restent dans l'incubateur pendant 4-24 heures, puis ajouter 0,5 ml de milieu avec 20% de FBS à une concentration finale de 10% de FBS.
  9. Attendre 48 à 72 heures et colorer les cellules avec de l'iodure de propidium (PI) et la protéine fluorescente verte (GFP) selon les instructions du fabricant. Protéger les cellules de la lumière et utiliser un trieur FACS pour mesurer les taux de GFP + / PI - cellules. Comme les taches de PI seulement cellules mortes, ce taux est une estimation de l'efficacité de transfection dans les cellules vivantes.
  10. Trier la population de cellules positives à l' expression de la GFP (GFP +) par FACS trieuse comme décrit précédemment 10.
  11. Utilisez Western blot immunitaire comme décrit précédemment 10 pour déterminer les niveaux d'un facteur de transcription d'intérêt avant et après l' infection des cellules d'intérêt (par exemple, les cellules CLL) avec shRNA désigné.

3. Déterminer le niveau d'expression de microARN transcriptome dans les cellules transfectées avec Transcription Factor-shRNA

  1. Isoler l'ARN à l'aide d'un kit commercial en suivant le protocole du fabricant.
  2. Etiqueter l'ARN et hybrider à microRNA microarray 11.
  3. Déterminer le microARN exprimé de manière différentielle dans les cellules transfectées avec facteur de transcription shRNA ou vecteur vide contrôles 5.
  4. Valider les résultats de puces à ADN pour les microARN les plus exprimés de manière différentielle à l' aide de PCR en temps réel 5.

4. Déterminer le chevauchement entre les bio-informatique et de l'approche shRNA en décrivant le transcriptome dépendante du facteur de transcription

  1. Pour detErmine les ratios attendus et observés de gènes microRNA qui abritent les sites de leurs promoteurs de liaison du facteur de transcription et ont été downregulated en facteur de transcription shRNA cellules transfectées, procédez comme suit:
    1. Obtenir le rapport de gènes qui abritent le facteur de transcription d'intérêt dans leur promoteur / microRNA totale de la liste générée en 1.3. Cette liste est le rapport attendu (par exemple, les gènes microARN avec des sites de liaison STAT3 / total des gènes de microARN testés = 0,25).
    2. Déterminer le nombre de gènes qui ont été réprimés dans les cellules transfectées facteur de transcription shRNA de la liste générée en 3.3 et a facteur de transcription des sites de liaison d'intérêt de la liste générée en 1.3. Ce nombre / nombre total de gènes régulés à la baisse est le rapport observé (par exemple, les gènes microARN avec STAT3 sites de liaison / nombre total de microARN downregulated = 0,6).
  2. Utilisez χ2 statistiques pour comparer les ratios observés et attendus qui ont été générées ci-dessus et déterminer si la liste des gènes qui ont été downregulated dans des cellules transfectées facteur de transcription shRNA sont enrichies avec des sites de liaison du facteur de transcription dans leur promoteur.

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Résultats

STAT3 est un facteur de transcription qui induit généralement la transcription des gènes qui ont une activité anti apoptotique et des effets prolifératifs 12. Que STAT3 affectent également l'ARN transcriptome non codant est actuellement inconnue. Dans toutes les cellules CLL STAT3 est constitutivement phosphorylée sur des résidus sérine 707 10,13. Navettes phosphosérine STAT3 vers le noyau, se lie à l' ADN et activent des gènes connus pour être activés par l...

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Discussion

Le mécanisme sous-jacent l'ARN polymérase dépendante II- transcription des gènes codant des protéines a été largement étudiée. Bien que ces éléments ne représentent que 1% - 2% du génome humain, la preuve du projet ENCODE suggèrent que plus de 80% du génome humain peut subir la transcription 17 et ce qui régule la transcription des éléments d'ADN non codantes reste largement inconnue 6 .

Plusieurs études, qui indiquaient que Pol II est également responsable de l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par une subvention de la Fondation mondiale de recherche CLL. L'Université du Texas MD Anderson Cancer Center est soutenu en partie par les Instituts nationaux de la santé par le biais d'un centre d'assistance Grant Cancer (P30CA16672).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lipofectamin 2000Life Technologies11668027
0,45 & micro ; Filtre à seringue ThermoScientific (Nalgene)190-2545
Dispositif de filtration ultracentrifuge Amicon avec seuil de 100  ; kDaMerck Millipore
PolybrèneMerck MilliporeTR-1003-G
Réactif TRIzolLife Tachnologies (Invitrogen)15596-026
293 Lignée cellulaire humaineSigma-Aldrich85120602

Références

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  2. Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  4. Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61(2011).
  5. Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50(2013).
  6. Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
  7. Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
  8. Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
  9. Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
  10. Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
  11. Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
  12. Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
  13. Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
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  20. Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

R gulation des facteurs de transcriptionsignature pig n tique H3K4me3s quen age ChIPtransfection d shRNApuce micro ARNknockdown de STAT3leuc mie lympho de chroniqueWestern blotRT PCR quantitative
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